• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    CRISPR/Cas9系統(tǒng)中引導(dǎo)RNA的研究進(jìn)展

    2019-05-09 06:57:32李江耿立召許建平
    生物技術(shù)通報(bào) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:雙鏈核苷酸分子

    李江 耿立召 許建平

    (先正達(dá)生物科技(中國(guó))有限公司,北京 102206)

    基因編輯是目前生命科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn),CRISPR/Cas9(The clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated 9)是基因編輯技術(shù)中的一個(gè)重要工具。目前廣泛使用的CRISPR/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌的對(duì)抗外源DNA入侵的一種防御系統(tǒng),可將入侵的噬菌體基因組DNA等外源核酸序列切除[1]。自2013年首次報(bào)道CRISPR/Cas9在生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因編輯以來(lái)[2-3],由于其操作簡(jiǎn)單,效率高,所以該系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物,成為藥物開(kāi)發(fā)、疾病治療和農(nóng)作物品質(zhì)改良等領(lǐng)域的一個(gè)重要基因編輯工具,具有廣泛應(yīng)用前景[4]。

    基因編輯中所用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬細(xì)菌II型的CRISPR/Cas9,由Cas9蛋白和引導(dǎo)RNA(Guide RNA,gRNA)兩種分子組成,其中Cas9蛋白是一種依賴于引導(dǎo)RNA分子的核酸切割酶,只有裝載引導(dǎo)RNA后才能激活自身識(shí)別和切割基因組DNA的功能。而引導(dǎo)RNA除激活Cas9活性外,還含有一段與靶基因組DNA反向互補(bǔ)的20 個(gè)核苷酸序列,將Cas9蛋白/引導(dǎo)RNA復(fù)合體定靶向位于目的DNA序列[1]。目前關(guān)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究綜述多集中于工作機(jī)理、Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)與工作模式,以及CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用發(fā)展,而對(duì)CRISPR/Cas9中的引導(dǎo)RNA研究進(jìn)展還缺乏系統(tǒng)性回顧。因此,本文將從引導(dǎo)RNA的結(jié)構(gòu),產(chǎn)生方式以及對(duì)基因編輯頻率的影響這幾個(gè)方面,對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的引導(dǎo)RNA研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

    1 引導(dǎo)RNA的序列與結(jié)構(gòu)

    在細(xì)菌中,CRISPR/Cas9的引導(dǎo)RNA由兩條RNA分子組成,CRISPR RNA(CrRNA)和trans activating CRISPR RNA(TracrRNA)( 圖 1-a)。crRNA的5′端包含20個(gè)堿基與噬菌體基因組DNA互補(bǔ),并由重復(fù)間隔序列串聯(lián)構(gòu)成,轉(zhuǎn)錄成一條長(zhǎng)的RNA分 子(Precursor crRNAs,pre-crRNAs) 后, 經(jīng) 過(guò)RNA 酶III加工過(guò)程產(chǎn)生一系列短的40 nt左右的包含間隔序列的成熟crRNA。tracrRNA 具有與crRNA互補(bǔ)的一段序列,crRNA與tracrRNA結(jié)合形成部分雙鏈互補(bǔ)的兩個(gè)RNA分子復(fù)合體[1]。Cas9蛋白首次在體外證明具有切割功能時(shí)發(fā)現(xiàn)其切割活性是由兩條引導(dǎo)RNA分子參與產(chǎn)生的,只加入CrRNA不 能使Cas9蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)質(zhì)粒DNA的切割,只有再加入TracrRNA時(shí)才能使Cas9體外切割質(zhì)粒DNA,獲得與CRISPR/Cas9體內(nèi)相同的生物學(xué)活性[5]。CrRNA 與TracrRNA 有兩個(gè)RNA分子組成,crRNA 5′端20個(gè)堿基與靶基因互補(bǔ),與crRNA配對(duì)結(jié)合后促進(jìn)CrRNA的成熟。雖然CrRNA與TracrRNA通過(guò)互補(bǔ)序列形成的雙鏈分子與Cas9結(jié)合后產(chǎn)生的基因編輯在原核生物中應(yīng)用較好,但在真核生物中因技術(shù)復(fù)雜難以進(jìn)行應(yīng)用。為了便于操作,科學(xué)家將CrRNA的3′端與TracrRNA的5′端通過(guò)GAAA的核苷酸序列相連,并縮短了雙鏈互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域僅保留4個(gè)核苷酸對(duì),形成48 nt的單引導(dǎo)RNA分子(圖1-b),并通過(guò)延長(zhǎng)3′端37個(gè)堿基后(圖1-c),獲得編輯效率很高的單引導(dǎo)RNA分子結(jié)構(gòu)。目前,85nt的單引導(dǎo)RNA序列結(jié)構(gòu)是CRISPR/Cas9在基因編輯中廣泛使用的一個(gè)分子結(jié)構(gòu)[2-3,5-8]。

    圖1 引導(dǎo)RNA的序列結(jié)構(gòu)變化[9]

    目前關(guān)于引導(dǎo)RNA的結(jié)構(gòu)研究以是以單引導(dǎo)RNA序列為模型獲得。引導(dǎo)RNA的序列可分為兩部分,5′端1-20個(gè)堿基是與目標(biāo)DNA互補(bǔ)的Protospacer序 列, 它 與 PAM(Protospacer adjacent motif)序列共同決定Cas9蛋白目的DNA序列上的定位,在PAM上有的3-4位核苷酸之間產(chǎn)生雙鏈斷裂。Protospacer之后的核苷酸為引導(dǎo)RNA的折疊結(jié)構(gòu)(Scaffold fold),含有多個(gè)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。在這些RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中,雙鏈互補(bǔ)區(qū)域的14個(gè)堿基由CrRNA與TracrRNA的重復(fù)序列反向互補(bǔ)形成,其中G27、G28、A41、A42、G43和U44不配對(duì)而產(chǎn)生一個(gè)突起(Bulge),突起上游的雙鏈序列稱為下位莖(Lower stem),下游的雙鏈序列成為上位莖(Upper stem)。上位莖下游含有3個(gè)莖環(huán)組成的結(jié)構(gòu),依次為 Nexus,Hairpin1 和 Hairpin2[10-11]。對(duì)引導(dǎo)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)在不同文章中的命名不完全相同,但對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)是一致的。通過(guò)對(duì)Cas9蛋白結(jié)合引導(dǎo)RNA和目標(biāo)DNA序列的形成的晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn),引導(dǎo)的5′端序列與目標(biāo)DNA序列形成的復(fù)合體被Cas9蛋白包裹于充滿負(fù)電荷的多肽內(nèi)部,引導(dǎo)RNA的第10-20個(gè)核苷酸稱為種子序列(Seed region),與模板DNA互補(bǔ)形成有序而牢固的雙鏈結(jié)構(gòu),當(dāng)種子序列存在2個(gè)及以上堿基的與目的DNA序列產(chǎn)生錯(cuò)配時(shí),Cas9蛋白不能與目的DNA序列牢固結(jié)合無(wú)法對(duì)DNA序列產(chǎn)生切割[12]。引導(dǎo)RNA中的反向互補(bǔ)的雙鏈重復(fù)序列結(jié)構(gòu)被Cas9蛋白的識(shí)別結(jié)構(gòu)域(Recognition,REC)和核酸酶結(jié)構(gòu)域(Nuclease,NUC)以序列依賴的方式識(shí)別。此結(jié)構(gòu)中的非互補(bǔ)突起部分及相鄰的核苷酸是Cas9蛋白識(shí)別的核心序列,而末尾的C30∶G39和A32∶U37不被Cas9蛋白識(shí)別而突出于Cas9蛋白表面,提示此部分雙鏈互補(bǔ)序列是經(jīng)RNA酶III加工產(chǎn)生的。引導(dǎo)RNA雙鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)下游的三個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定Cas9蛋白與引導(dǎo)RNA復(fù)合體的重要序列。其中Nexus的序列中有部分核苷酸(52、53和59-61)是被Cas9蛋白的REC結(jié)構(gòu)域和NUC結(jié)構(gòu)域中的1103-1107 位的氨基酸結(jié)合,被PAM激活結(jié)構(gòu)域(PAM-interacting,PI)所識(shí)別,與雙鏈重復(fù)互補(bǔ)序列中的突起結(jié)構(gòu)共同參與激活Cas9蛋白對(duì)PAM序列的識(shí)別,引導(dǎo)RNA打開(kāi)Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)去識(shí)別PAM序列[13]。其余兩個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)Hairpin1和Hairpin2的大部分序列暴露于Cas9蛋白表面,只有Hairpin1中的63-65、67和Hairpin2中的92位核苷酸被Cas9蛋白的NUC結(jié)構(gòu)域識(shí)別[10],這兩個(gè)莖環(huán)可以提高Cas9蛋白與引導(dǎo)RNA復(fù)合體的穩(wěn)定性,并且這段區(qū)域中的核苷酸能容忍較大范圍的改變,是改造引導(dǎo)RNA的一個(gè)可行區(qū)域[11-12,14]。可見(jiàn),引導(dǎo)RNA的雙鏈復(fù)合體和Nexus是Cas9蛋白行使功能所必需的結(jié)構(gòu),而Hairpin1和Hairpin2以及之間的5個(gè)連接堿基可幫助穩(wěn)定Cas9蛋白與引導(dǎo)RNA及目標(biāo)DAN形成的復(fù)合體,突變將影響Cas9蛋白的切割效率。

    引導(dǎo)RNA的序列特征在Type II的 CRISPR-Cas9系統(tǒng)中具有保守性。在Streptococcus和Lactobacillus中分離到的41 種Cas9基因中,盡管Cas9的蛋白序列根據(jù)一致性可分為3組,但引導(dǎo)RNA中CrRNA與TracrRNA反向重復(fù)序列結(jié)合的雙鏈序列高度保守,都存在不配對(duì)的核苷酸突起結(jié)構(gòu)以及相鄰的上下位莖序列,是II型CRISPR/Cas9特有的結(jié)構(gòu)。但核苷酸組成和上下位莖的長(zhǎng)度在不同來(lái)源的Cas9中差異很大,其中較短的下位雙鏈序列長(zhǎng)度保守,較長(zhǎng)的上位雙鏈序列長(zhǎng)度在不同種類的菌中變異較大。但最為保守的部分為TracrRNA的第一個(gè)莖環(huán),甚至在不同菌中都含有高度一致的堿基,如A52和C55與Cas9蛋白的1 103-1 107 位的氨基酸結(jié)合[10]。對(duì)S. thermophiles中的兩個(gè)同源Cas9蛋白Sth1Cas9和Sth3Cas9以及對(duì)應(yīng)的引導(dǎo)RNA序列CRISPR1 sgRNA和CRISPR3 sgRNA進(jìn)行置換,未能檢測(cè)到Sth1Cas9和Sth3Cas9的切割活性。然而當(dāng)CRISPR1 sgRNA含有 CRISPR3 的Protospacer 序列后可以使Sth3 Cas9產(chǎn)生切割活性。進(jìn)一步對(duì)兩種引導(dǎo)RNA的莖環(huán)同時(shí)進(jìn)行互換后發(fā)現(xiàn),人工產(chǎn)生的引導(dǎo)RNA不能使原對(duì)應(yīng)的Cas9蛋白產(chǎn)生切割活性,但使異源的Cas9產(chǎn)生了切割活性。而只互換其中的一個(gè)莖環(huán)不足以產(chǎn)生這種效果[10]。說(shuō)明引導(dǎo)RNA的序列結(jié)構(gòu)在不同類型的CRISPR/Cas9中具有獨(dú)特性,表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)化具有不同的分支;也表明引導(dǎo)RNA對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)揮功能具有非常重要的決定作用。

    2 引導(dǎo)RNA的產(chǎn)生方式

    引導(dǎo)RNA在細(xì)菌和古細(xì)菌中由體內(nèi)的RNA 轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)產(chǎn)生,但在CRISPR/Cas9應(yīng)用于基因編輯技術(shù)時(shí),需要在體內(nèi)表達(dá)人工設(shè)計(jì)的引導(dǎo)RNA,引導(dǎo)RNA的5′端1-20個(gè)核苷酸對(duì)應(yīng)目的DNA序列不同而做改變,使Cas9蛋白在特定預(yù)期位點(diǎn)產(chǎn)生切割。引導(dǎo)RNA的產(chǎn)生是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中的重要過(guò)程,引導(dǎo)RNA需要滿足以下要求:(1)引導(dǎo)RNA保持在細(xì)胞核內(nèi)。(2)產(chǎn)生的引導(dǎo)RNA的5′端不能有與目的序列不配對(duì)的多個(gè)額外核苷酸。針對(duì)不同的基因編輯需求,CRISPR/Cas9的引導(dǎo)RNA有不同的產(chǎn)生方式,會(huì)對(duì)最終基因的編輯效果產(chǎn)生顯著影響。

    2.1 單引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄

    CRISPR/Cas9人工構(gòu)建的引導(dǎo)RNA的5′端1-20核苷酸與靶DNA序列互補(bǔ),不能有額外的多個(gè)核苷酸序列,因此引導(dǎo)RNA最初都是由聚合酶III型啟動(dòng)子(Pol III promoter)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。在植物過(guò)表達(dá)技術(shù)中應(yīng)用廣泛的II 型啟動(dòng)子是一類表達(dá)強(qiáng),在基因過(guò)表達(dá)中廣泛使用的一類生物體內(nèi)源啟動(dòng)子,如CaMV 35S 啟動(dòng)子、玉米泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin)啟動(dòng)子等。但這類啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的RNA是前體結(jié)構(gòu),如mRNA 前體,microRNA前體和一些小的核RNA前體等,這些非成熟的RNA前體會(huì)經(jīng)過(guò)體內(nèi)加工系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)5′ 加帽和3′加尾,并且切除內(nèi)含子。因此II型啟動(dòng)子不能用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)中引導(dǎo)RNA的轉(zhuǎn)錄[15]。III型啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄5s RNA,tRNA和小的非編碼RNA的啟動(dòng)子。在CRISPR/Cas9中常用的Pol III啟動(dòng)子有U3和U6兩類,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生引導(dǎo)RNA為U6,在植物中產(chǎn)生引導(dǎo)RNA為U3和U6,U3和U6啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄引導(dǎo)RNA產(chǎn)生基因編輯的頻率上沒(méi)有差別[2-3,6,16]。U3 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物第一個(gè)堿基固定是A,而U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物第一個(gè)堿基固定是G,因此引導(dǎo)RNA的5′端序列需根據(jù)U3或U6的使用進(jìn)行調(diào)整,如5′GN(19)NGG 和 5′AN(19)NGG[17]。在使用 Pol III啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生引導(dǎo)RNA時(shí),通常一個(gè)U3或U6啟動(dòng)子只能產(chǎn)生一個(gè)引導(dǎo)RNA分子去實(shí)現(xiàn)一個(gè)靶位點(diǎn)的切割。當(dāng)需要產(chǎn)生多個(gè)引導(dǎo)RNA時(shí),需要將這類啟動(dòng)子重復(fù)使用去驅(qū)動(dòng)多個(gè)引導(dǎo)RNA產(chǎn)生[18]。

    U3和U6啟動(dòng)子在CRISPR/Cas9基因編輯中廣泛用于引導(dǎo)RNA的轉(zhuǎn)錄,但具有一定的局限性。U3和U6啟動(dòng)子是組成型表達(dá)啟動(dòng)子,不具備組織特異性表達(dá),這導(dǎo)致引導(dǎo)RNA的產(chǎn)生無(wú)法在時(shí)空上進(jìn)行調(diào)節(jié),不能實(shí)現(xiàn)條件誘導(dǎo)性的基因編輯。生物體內(nèi)的U3和U6啟動(dòng)子分布廣、種類多,不同種屬之間序列差異大,同一物種中的啟動(dòng)子活性也不同。啟動(dòng)子的有些調(diào)控元件位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游內(nèi),容易導(dǎo)致克隆的啟動(dòng)子序列不完整,影響啟動(dòng)子活性[15]。近來(lái)也有研究報(bào)道通過(guò)RNA聚合酶II型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄一條包含Cas9 和引導(dǎo)RNA的轉(zhuǎn)錄本,這條轉(zhuǎn)錄本中的引導(dǎo)RNA可被RNaseIII途徑加工后,與Cas9結(jié)合在水稻中產(chǎn)生高頻率的基因編輯活性[19-20]。

    2.2 多引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄

    當(dāng) CRISPR/Cas9要對(duì)體內(nèi)多個(gè)靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)基因編輯時(shí),需要產(chǎn)生多個(gè)引導(dǎo)RNA與目的序列位點(diǎn)結(jié)合。多個(gè)引導(dǎo)RNA的產(chǎn)生最早是用U3或U6啟動(dòng)子交替重復(fù)使用,每個(gè)啟動(dòng)子對(duì)自身下游的引導(dǎo)RNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。采用此策略在水稻和擬南芥中可同時(shí)分別轉(zhuǎn)錄6個(gè)引導(dǎo)RNA產(chǎn)生,獲得16%的純和突變體的靶位點(diǎn)編輯頻率[21]。雖然這個(gè)方法可以得到多個(gè)靶位點(diǎn)的突變體,但利用U3/U6重復(fù)表達(dá)多個(gè)引導(dǎo)RNA有以下不足:(1)由于引導(dǎo)RNA長(zhǎng)度很短,并且要求引導(dǎo)RNA的5′末端為A/G,3′末端需要為5個(gè)及以上的poly(T)作為終止信號(hào),克隆構(gòu)建策略有限,無(wú)論是采用DNA合成還是多個(gè)片段拼接,引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄單元串聯(lián)的載體十分具有挑戰(zhàn)性。目前文章報(bào)道采用的策略均在Golden Gate的技術(shù)上做改進(jìn),最多可將5個(gè)引導(dǎo)RNA表達(dá)單元裝入一個(gè)載體,而6個(gè)以上的引導(dǎo)RNA表達(dá)單元組裝效率很低[16]。(2)串聯(lián)重復(fù)的引導(dǎo)RNA表達(dá)單元包含啟動(dòng)子后在300-600個(gè)堿基左右,其中只有與目的基因序列互補(bǔ)的20 個(gè)堿基作為Protospacer有變化,其余序列均為重復(fù)序列。過(guò)多的重復(fù)序列容易造成載體在細(xì)菌和農(nóng)桿菌中的不穩(wěn)定。(3)由于多引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)的串聯(lián),容易在植物體內(nèi)誘發(fā)基因沉默,造成引導(dǎo)RNA的低水平或不表達(dá)。以上這些因素使U3或U6啟動(dòng)子重復(fù)使用產(chǎn)生多個(gè)引導(dǎo)RNA的基因編輯技術(shù)存在很大的挑戰(zhàn)[21]。

    近年來(lái),多個(gè)引導(dǎo)RNA的產(chǎn)生是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。在生物體內(nèi)存在可以從一個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本中產(chǎn)生多個(gè)RNA分子的機(jī)制,如多順?lè)醋觤RNA前體在轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程中被RNA酶剪切后可產(chǎn)生多個(gè)獨(dú)立的引導(dǎo)RNA分子。因此,可以利用生物體內(nèi)的RNA剪切加工過(guò)程從一個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本中同時(shí)產(chǎn)生多個(gè)引導(dǎo)RNA分子。目前報(bào)道在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中利用3種RNA剪切過(guò)程實(shí)現(xiàn)多個(gè)引導(dǎo)RNA的產(chǎn)生:來(lái)源于Pseudomonas aeruginosa的Csy4的RNA切割酶,tRNA序列介導(dǎo)的內(nèi)源RNA酶剪切和病毒來(lái)源的核酶剪切系統(tǒng)。Csy4作為外源RNA切割酶,多個(gè)引導(dǎo)RNA被其20個(gè)核苷酸的識(shí)別序列間隔開(kāi),Csy4識(shí)別這段序列并切割間隔序列的3′末端,可釋放兩個(gè)Csy4識(shí)別序列之間的引導(dǎo)RNA分子,產(chǎn)生的引導(dǎo)RNA的5′端沒(méi)有額外核苷酸存在而3′端帶有Csy4的20nt的識(shí)別序列[22]。2017年,有研究將Csy4通過(guò)2A肽與Cas9蛋白融合表達(dá),引導(dǎo)RNA通過(guò)Csy4識(shí)別序列串聯(lián),可在體內(nèi)通過(guò)能從一個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本上同時(shí)產(chǎn)生12個(gè)引導(dǎo)RNA分子[23]。生物體內(nèi)還存在一類tRNA加工的RNA 剪切加工系統(tǒng),常用的是tRNAGly是一段77nt 的核苷酸形成的一個(gè)包含3個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的一段RNA序列,其5′端含有一個(gè)RnaseP的識(shí)別切割位點(diǎn),3′端含有一個(gè)RnazeZ的識(shí)別切割位點(diǎn),在體內(nèi)通過(guò)內(nèi)源核酸酶將tRNA序列的兩個(gè)位點(diǎn)切割從而釋放引導(dǎo)RNA。當(dāng)多個(gè)引導(dǎo)RNA通過(guò)在5′和3′端連接有77 nt 的tRNA序列進(jìn)行串聯(lián)時(shí),核酸酶加工切割過(guò)程可從一個(gè)RNA分子上釋放多個(gè)引導(dǎo)RNA,產(chǎn)生的引導(dǎo)RNA的3′端經(jīng)RNaseZ切割后殘留6個(gè)tRNA序列的核苷酸而5′不含額外的核苷酸[24-25]。tRNAGly序列在動(dòng)植物中均存在,介導(dǎo)的多個(gè)引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄釋放技術(shù)在CRISPR/Cas9技術(shù)中得到了廣泛使用,通過(guò)此方法實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)動(dòng)植物體內(nèi)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯,有報(bào)道最多可一次產(chǎn)生8個(gè)引導(dǎo)RNA分子[23]。此外,與tRNAGly序列釋放引導(dǎo)RNA的過(guò)程類似,在引導(dǎo)RNA的5′端和3′端各加上一種核酶序列,5′端是Hammerhead(HH)type ribozyme,3′端 是 Hepatitis delta virus(HDV)ribozyme,這種結(jié)構(gòu)形成的引導(dǎo)RNA分子稱為 RGR(Ribozyme-gRNA-Ribozyme,RGR)。RGR可利用核酶序列間隔,將多個(gè)引導(dǎo)RNA分子串聯(lián)轉(zhuǎn)錄后,引導(dǎo)RNA兩側(cè)的核酶序列被體內(nèi)核酸酶識(shí)別并切除,從而釋放有活性的引導(dǎo)RNA分子,但這兩種核酶的切割活性較tRNA結(jié)構(gòu)要低很多[23],并且在需要引入動(dòng)物病毒的核酶序列,在植物應(yīng)用中有很大局限。但tRNA結(jié)構(gòu)不同,這兩種核酶在SP6啟動(dòng)子介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程中,可被SP6 RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中識(shí)別并切除[26]。

    以上3種策略中,Csy4和tRNA介導(dǎo)的多個(gè)引導(dǎo)RNA在體內(nèi)產(chǎn)生并實(shí)現(xiàn)多靶位點(diǎn)的基因編輯頻率相當(dāng),而遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HH ribozyme和HDV ribozyme核酶產(chǎn)生的引導(dǎo)RNA。有報(bào)道表明Csy4核酸酶不會(huì)對(duì)植物體產(chǎn)生負(fù)表型影響,而且Csy4的識(shí)別序列只有20個(gè)核苷酸,遠(yuǎn)短于tRNA的77個(gè)核苷酸序列,有利于載體的構(gòu)建和穩(wěn)定[23]。tRNA的切割加工是生物體的一個(gè)基本活性過(guò)程,因此tRNA介導(dǎo)的多個(gè)引導(dǎo)RNA的產(chǎn)生可廣泛用于動(dòng)植的基因編輯,是多位點(diǎn)CRISPR/Cas9基因編輯的一個(gè)研究熱點(diǎn)[15,23-25]。而 HH ribozyme 和 HDV ribozyme核酶能被SP6識(shí)別并切割,因此更適用于體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生多個(gè)引導(dǎo) RNA 的應(yīng)用[15,26]。

    2.3 體外產(chǎn)生引導(dǎo)RNA

    在CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中,Cas9和引導(dǎo)RNA可以在體外產(chǎn)生后組裝成蛋白核酸復(fù)合體(Ribonucleoproteins,RNPs),導(dǎo)入細(xì)胞體內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)DNA編輯。體外產(chǎn)生引導(dǎo)RNA主要由用商品化的T7體外轉(zhuǎn)錄試劑完成,引導(dǎo)RNA的DNA序列5′端含有T7啟動(dòng)子序列和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)[27-28]。體外轉(zhuǎn)錄的引導(dǎo)RNA可以是單分子形式,也可以是CrRNA和TracrRNA兩個(gè)分子。引導(dǎo)RNA也由化學(xué)合成的方法在體外產(chǎn)生,常用的方法是固相基質(zhì)上如利用 2′-silyl,2′-bis-methylther等化學(xué)合成方法。但單引導(dǎo)RNA的分子長(zhǎng)度接近100個(gè)核苷酸,合成的成本和難度大,因此通常采用CrRNA和TracrRNA兩個(gè)分子的形式[29]。

    3 優(yōu)化引導(dǎo)RNA提高基因編輯效率

    CRISPR/Cas9雖然廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)植物體的基因編輯,但在一些生物體中仍存在效率低的問(wèn)題,如小麥等[30]。此外,同源重組介導(dǎo)的核苷酸定點(diǎn)插入和替換的效率依賴于Cas9的切割效率。群體中足夠多的雙鏈斷裂(Double strand break,DSB)是實(shí)現(xiàn)同源重組的必要條件,而引導(dǎo) RNA 5′端的序列結(jié)構(gòu)是影響同源重組效率的另一因素[31]。因此,提高CRISPR/Cas9的基因編輯效率對(duì)這項(xiàng)技術(shù)的廣泛和深入應(yīng)用有重要意義。引導(dǎo)RNA作為CRISPR/Cas9的重要組成之一,引導(dǎo)RNA的序列、高級(jí)結(jié)構(gòu)以及表達(dá)方式對(duì)CRISPR/Cas9的基因編輯效率有顯著影響[32]。

    3.1 引導(dǎo)RNA序列組成對(duì)基因編輯效率的影響

    引導(dǎo)RNA的序列由與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)的Protospacer和Scaffold 兩部分組成。5′端的1-20個(gè)核苷酸是與目標(biāo)序列互補(bǔ)的一段序列,其中的核苷酸組成會(huì)影響基因編輯效率,當(dāng)G和C出現(xiàn)頻率高而A出現(xiàn)頻率低,尤其是GC含量高于50%時(shí),可以提高引導(dǎo)RNA序列與靶基因序列位點(diǎn)結(jié)合的穩(wěn)定性,提高Cas9的切割效率;尤其是靠近靶序列的PAM位點(diǎn)的核苷酸中,20位核苷酸偏好G而避免C,19位核苷酸避免C時(shí),可顯著提高引導(dǎo)RNA產(chǎn)生的編輯效率。此外,引導(dǎo)RNA通常由RNA聚合酶III型的U3或U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生,RNA序列中連續(xù)4個(gè)及以上的尿嘧啶將成為這類啟動(dòng)子的終止信號(hào),可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的提前終止[33]。在引導(dǎo)RNA內(nèi)部位于Lower stem的第23-26位4個(gè)連續(xù)尿嘧啶序列UUUU[23,26-30]是U3或U6啟動(dòng)子潛在的終止信號(hào),當(dāng)這四個(gè)尿嘧啶分別被突變?yōu)锳,C,G時(shí),均可提高CRISPR/Cas9的基因編輯效率,尤其是突變?yōu)镃和G時(shí)較A的基因編輯效率高很多;并且第26位的尿嘧啶突變?yōu)镃時(shí),提高的編輯效率較其他3位的突變最為明顯[9]。這種優(yōu)化的引導(dǎo)RNA序列在水稻基因編輯中得到了應(yīng)用[14]。

    3.2 引導(dǎo)RNA序列結(jié)構(gòu)對(duì)基因編輯效率的影響

    引導(dǎo)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是被Cas9蛋白識(shí)別并產(chǎn)生功能的重要序列。利用熒光探針淬滅技術(shù)研究不同序列缺失的引導(dǎo)RNA與Cas9蛋白體外結(jié)合時(shí)發(fā)現(xiàn),缺失第一個(gè)莖環(huán)(Nexus)將導(dǎo)致Cas9蛋白不能結(jié)合引導(dǎo)RNA,這與Cas9蛋白結(jié)合引導(dǎo)RNA的晶體結(jié)構(gòu)相吻合,缺失第2個(gè)莖環(huán)(Hairpin1)和第3個(gè)莖環(huán)(Hairpin2)時(shí),Cas9蛋白結(jié)合引導(dǎo)RNA的效率要降低很多,尤其是與總RNA共同混合時(shí)尤其明顯。說(shuō)明引導(dǎo)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是CRISPR/Cas9產(chǎn)生基因編輯的重要部分,還對(duì)引導(dǎo)RNA在細(xì)胞內(nèi)特異性被Cas9蛋白識(shí)別結(jié)合有作用[34]。應(yīng)用于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中人工創(chuàng)造的引導(dǎo)RNA序列中,雙鏈互補(bǔ)區(qū)的序列比天然crRNA:tracrRNA的雙鏈互補(bǔ)區(qū)截短了10個(gè)堿基對(duì),目前關(guān)于引導(dǎo)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化提高CRISRP/Cas9基因編輯效率的研究集中在這部分序列。當(dāng)延長(zhǎng)這部分序列從1、3、5、8和10個(gè)堿基對(duì)時(shí),發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)5個(gè)堿基對(duì)時(shí)引導(dǎo)RNA的基因編輯效率可達(dá)到最大[9,35]。在水稻中,延長(zhǎng)雙鏈結(jié)合區(qū)5個(gè)堿基對(duì)并疊加第26位的尿嘧啶突變?yōu)镃時(shí),這種類型的引導(dǎo)RNA結(jié)構(gòu)比現(xiàn)有序列的基因編輯提高13倍[14]。此外,對(duì)引導(dǎo)RNA的3′端添加G3U3或G2U1的特定核苷酸序列,通過(guò)提高引導(dǎo)RNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性而提高CRISPR/Cas9的切割效率并降低脫靶率[36]。

    3.3 RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄引導(dǎo)RNA對(duì)基因編輯效率的影響

    在CRISPR/Cas9基因編輯中,引導(dǎo)RNA通常由RNA聚合酶III型轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生,但由于這類啟動(dòng)子的強(qiáng)度較常用的II型啟動(dòng)子強(qiáng)度低,限制了CRISPR/Cas9的編輯效率。在多引導(dǎo)RNA產(chǎn)生中發(fā)展來(lái)的幾種多順?lè)醋覴NA切割系統(tǒng),可以使引導(dǎo)RNA的5′端不受RNA聚合酶III啟動(dòng)子限制,而是用強(qiáng)度更大的RNA聚合酶II型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄引導(dǎo)RNA。在番茄原生質(zhì)體中,用CmYLCV(Cestrum Yellow Leaf Curling Virus promoter)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)tRNAGly和Csy4介導(dǎo)的兩種引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄,對(duì)黃色熒光蛋白(Yellow fluorescent protein,YFP)的編輯效率比U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的引導(dǎo)RNA要高2倍[21]。考慮到RNA聚合酶II型啟動(dòng)子的35S 和Ubiquitin啟動(dòng)子常用于驅(qū)動(dòng)Cas9表達(dá)盒,為了避免載體含有重復(fù)的大片段,目前有多個(gè)RNA聚合酶II型啟動(dòng)子以供引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄,除前文提到的植物病毒來(lái)源的CmYLCV啟動(dòng)子,還有細(xì)菌來(lái)源的M24和Nos以及植物來(lái)源的 AtUbi10,OsAct1,PvUbi1和 PvUbi2等, 甚 至有組織特異性的啟動(dòng)子如Arabidopsis Ec1.2 和YAO promoter可供引導(dǎo)RAN實(shí)現(xiàn)植物卵細(xì)胞,囊胚和花粉中的特異表達(dá)[21,37]。

    4 總結(jié)與展望

    CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為基因編輯重要的一個(gè)工具,已經(jīng)廣泛用于各種生物體的特定核苷酸的缺失和改變,以及特定基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。引導(dǎo)RNA作為CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的核心元件之一,對(duì)其序列和結(jié)構(gòu)的研究不僅加深人們認(rèn)識(shí)CRISPR/Cas9的自然分類、工作原理,而且為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)化和拓展具有重要價(jià)值[38-39]。最近報(bào)道在引導(dǎo)RNA的3′端添加用于同源重組介導(dǎo)的RNA形式的供體序列,在Cas9蛋白產(chǎn)生的雙鏈斷裂缺口處完成供體RNA鏈與目的DNA序列鏈的置換,可以大幅提高核苷酸的定點(diǎn)編輯的效率[40]。此外,引導(dǎo)RNA的保守序列部分為新CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)掘提供重要的信息和證據(jù)[41]。

    猜你喜歡
    雙鏈核苷酸分子
    單核苷酸多態(tài)性與中醫(yī)證候相關(guān)性研究進(jìn)展
    徐長(zhǎng)風(fēng):核苷酸類似物的副作用
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:28
    昆蟲(chóng)共生細(xì)菌活體制造雙鏈RNA
    海外星云 (2021年21期)2021-01-19 14:17:31
    分子的擴(kuò)散
    Acknowledgment to reviewers—November 2018 to September 2019
    “精日”分子到底是什么?
    新民周刊(2018年8期)2018-03-02 15:45:54
    米和米中的危險(xiǎn)分子
    高新區(qū)科技企業(yè)孵化網(wǎng)絡(luò)“雙層雙鏈”結(jié)構(gòu)研究
    臭氧分子如是說(shuō)
    廣東人群8q24rs1530300單核苷酸多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂的相關(guān)性研究
    网址你懂的国产日韩在线| 国产91av在线免费观看| 内地一区二区视频在线| 九九爱精品视频在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| av福利片在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 亚洲欧美精品综合久久99| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 黄色配什么色好看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 精品人妻视频免费看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美一区二区亚洲| 最近在线观看免费完整版| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲七黄色美女视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 最近2019中文字幕mv第一页| 精品久久久久久成人av| 国产在线男女| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久久精品大字幕| 黄色日韩在线| 久久精品91蜜桃| 欧美激情国产日韩精品一区| 国内精品久久久久精免费| av在线老鸭窝| 国产美女午夜福利| 69人妻影院| 长腿黑丝高跟| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美极品一区二区三区四区| 色尼玛亚洲综合影院| 免费看日本二区| 国产精品一区www在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 性色avwww在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 日本爱情动作片www.在线观看 | 亚洲va在线va天堂va国产| 两个人视频免费观看高清| 色综合站精品国产| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品无大码| 国产成人精品久久久久久| 国产精品1区2区在线观看.| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产伦精品一区二区三区四那| 晚上一个人看的免费电影| 午夜激情福利司机影院| 99久国产av精品国产电影| 一个人观看的视频www高清免费观看| 九九热线精品视视频播放| 在线免费观看的www视频| 久久精品国产清高在天天线| 久久精品影院6| 精品午夜福利在线看| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲五月天丁香| 久久人人爽人人片av| 成人一区二区视频在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产精品免费一区二区三区在线| 成年女人永久免费观看视频| 久久中文看片网| 变态另类丝袜制服| 男女之事视频高清在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲av.av天堂| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 午夜精品在线福利| 老司机福利观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 俺也久久电影网| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品久久电影中文字幕| 99精品在免费线老司机午夜| 看免费成人av毛片| 亚洲av中文av极速乱| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲综合色惰| 午夜老司机福利剧场| 国产视频内射| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲欧美成人精品一区二区| 一级黄色大片毛片| 国产乱人视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品亚洲一级av第二区| 一进一出好大好爽视频| 男女之事视频高清在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲最大成人av| 中文字幕久久专区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久精品国产亚洲av天美| 一边摸一边抽搐一进一小说| 岛国在线免费视频观看| av在线天堂中文字幕| 欧美性猛交黑人性爽| 久久久久久国产a免费观看| 精品国产三级普通话版| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久99热这里只有精品18| 在线观看av片永久免费下载| 悠悠久久av| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 欧美激情久久久久久爽电影| 九九在线视频观看精品| 在线国产一区二区在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 午夜日韩欧美国产| 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品三级大全| 亚洲国产色片| 热99re8久久精品国产| 亚洲国产色片| 美女cb高潮喷水在线观看| av在线天堂中文字幕| 俄罗斯特黄特色一大片| 哪里可以看免费的av片| 日韩三级伦理在线观看| 久久中文看片网| 亚洲av免费在线观看| 久久中文看片网| 男女下面进入的视频免费午夜| 黄片wwwwww| 亚洲综合色惰| 日韩制服骚丝袜av| 黑人高潮一二区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 久久久国产成人精品二区| 伦精品一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产亚洲91精品色在线| 国内精品宾馆在线| 国产精品一区二区免费欧美| 成人av一区二区三区在线看| 成年女人永久免费观看视频| aaaaa片日本免费| 欧美潮喷喷水| 成人毛片a级毛片在线播放| 美女黄网站色视频| 麻豆国产av国片精品| 真实男女啪啪啪动态图| 看十八女毛片水多多多| 国语自产精品视频在线第100页| 国产探花极品一区二区| 91在线观看av| 日韩成人伦理影院| 看免费成人av毛片| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲最大成人中文| 中文资源天堂在线| 搞女人的毛片| 乱码一卡2卡4卡精品| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美潮喷喷水| 女同久久另类99精品国产91| 免费电影在线观看免费观看| 春色校园在线视频观看| 久久久久久久久久久丰满| 久久鲁丝午夜福利片| 中文字幕av成人在线电影| 国产精品一及| 99久久精品国产国产毛片| 日本三级黄在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产免费男女视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 超碰av人人做人人爽久久| 最近的中文字幕免费完整| av卡一久久| 精品日产1卡2卡| 在线播放无遮挡| 美女免费视频网站| 嫩草影院入口| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩欧美在线乱码| 亚洲美女黄片视频| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲成人av在线免费| 亚洲经典国产精华液单| 精品一区二区免费观看| 插阴视频在线观看视频| 99热精品在线国产| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲av成人av| 插阴视频在线观看视频| 99精品在免费线老司机午夜| 日本免费一区二区三区高清不卡| or卡值多少钱| 夜夜夜夜夜久久久久| 日韩欧美在线乱码| av中文乱码字幕在线| 亚洲无线在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲国产精品合色在线| 少妇的逼水好多| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 亚洲中文日韩欧美视频| 美女大奶头视频| АⅤ资源中文在线天堂| 国产人妻一区二区三区在| 99热精品在线国产| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 天美传媒精品一区二区| 中文字幕免费在线视频6| 国产高清不卡午夜福利| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 精品久久久噜噜| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产男靠女视频免费网站| 久久精品人妻少妇| 无遮挡黄片免费观看| 精品一区二区免费观看| 国产精品福利在线免费观看| 国产高清激情床上av| 麻豆国产97在线/欧美| 日日撸夜夜添| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 成人漫画全彩无遮挡| 一本久久中文字幕| 欧美中文日本在线观看视频| 久久久精品大字幕| 白带黄色成豆腐渣| 日韩三级伦理在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 免费av观看视频| 国产高潮美女av| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲av中文av极速乱| 超碰av人人做人人爽久久| 校园春色视频在线观看| av.在线天堂| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成人av在线播放网站| 中国美白少妇内射xxxbb| 美女大奶头视频| 一区二区三区免费毛片| av专区在线播放| 国产三级在线视频| or卡值多少钱| 高清毛片免费看| 国产老妇女一区| 欧美精品国产亚洲| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产av一区在线观看免费| 国产精品一区二区性色av| a级毛片a级免费在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产探花极品一区二区| av免费在线看不卡| 国产成人a∨麻豆精品| 国产在线精品亚洲第一网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 69人妻影院| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 久久人人精品亚洲av| 久久韩国三级中文字幕| 国产精品伦人一区二区| 国产精品福利在线免费观看| 男插女下体视频免费在线播放| 免费人成在线观看视频色| 午夜影院日韩av| 1024手机看黄色片| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 床上黄色一级片| 亚洲欧美精品综合久久99| 插逼视频在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 久99久视频精品免费| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 99久久精品热视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 不卡一级毛片| 天美传媒精品一区二区| 精品久久久噜噜| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美人与善性xxx| 国产精品日韩av在线免费观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲内射少妇av| 综合色av麻豆| av黄色大香蕉| 此物有八面人人有两片| 国产人妻一区二区三区在| 日韩国内少妇激情av| 五月伊人婷婷丁香| av卡一久久| 国产单亲对白刺激| 亚洲天堂国产精品一区在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 2021天堂中文幕一二区在线观| 日韩av在线大香蕉| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲真实伦在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 久久久国产成人精品二区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产黄a三级三级三级人| 干丝袜人妻中文字幕| 国产成人freesex在线 | 免费人成视频x8x8入口观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美zozozo另类| 国产精品一区二区免费欧美| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 一本久久中文字幕| 亚洲最大成人中文| 成人特级av手机在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 国内精品美女久久久久久| 香蕉av资源在线| 99在线人妻在线中文字幕| 精品午夜福利视频在线观看一区| 三级国产精品欧美在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 日本一本二区三区精品| 国产一区二区三区av在线 | 久99久视频精品免费| 国产成人freesex在线 | 丝袜喷水一区| 久久国产乱子免费精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美日韩综合久久久久久| 色哟哟·www| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 伦理电影大哥的女人| 深夜精品福利| 免费在线观看成人毛片| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久久久久国产a免费观看| 免费观看的影片在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 国产探花在线观看一区二区| ponron亚洲| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲精品国产av成人精品 | 中文亚洲av片在线观看爽| 日韩三级伦理在线观看| av女优亚洲男人天堂| 国内精品一区二区在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 内射极品少妇av片p| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 精品久久久噜噜| 亚州av有码| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美精品国产亚洲| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲三级黄色毛片| 色综合站精品国产| 久久久久久久久中文| 日韩三级伦理在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 日本成人三级电影网站| 搡老妇女老女人老熟妇| 日韩大尺度精品在线看网址| 婷婷色综合大香蕉| 熟女人妻精品中文字幕| 全区人妻精品视频| 麻豆乱淫一区二区| 身体一侧抽搐| 丝袜美腿在线中文| 久久久久久久久久成人| 亚洲av成人av| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲真实伦在线观看| 丰满乱子伦码专区| 在线免费十八禁| 欧美人与善性xxx| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中出人妻视频一区二区| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 免费看光身美女| 丰满乱子伦码专区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 少妇高潮的动态图| a级毛片a级免费在线| 国产 一区 欧美 日韩| 日本色播在线视频| 久久久国产成人免费| 一个人看的www免费观看视频| 国产成人影院久久av| 欧美+日韩+精品| 色吧在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 大型黄色视频在线免费观看| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 精品人妻视频免费看| 男人和女人高潮做爰伦理| 少妇高潮的动态图| 嫩草影院新地址| 人人妻人人看人人澡| 久久久久久伊人网av| 久久久国产成人精品二区| 大型黄色视频在线免费观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 韩国av在线不卡| 国产成人精品久久久久久| 天堂动漫精品| 国产精品永久免费网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 免费高清视频大片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 色噜噜av男人的天堂激情| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 亚洲精品一区av在线观看| 99riav亚洲国产免费| 三级国产精品欧美在线观看| 美女内射精品一级片tv| 亚洲人成网站在线播| 男人舔奶头视频| 亚洲av免费高清在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 成人午夜高清在线视频| 国产高清不卡午夜福利| 99久久无色码亚洲精品果冻| 免费无遮挡裸体视频| 床上黄色一级片| 日本三级黄在线观看| 国产精品无大码| 最后的刺客免费高清国语| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲欧美日韩东京热| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产老妇女一区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 三级毛片av免费| 中文在线观看免费www的网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产高清激情床上av| 精品欧美国产一区二区三| 欧美日本视频| 国产精品无大码| 国内精品宾馆在线| 日韩在线高清观看一区二区三区| 在线观看av片永久免费下载| 超碰av人人做人人爽久久| 欧美潮喷喷水| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲无线观看免费| 插逼视频在线观看| 成人特级av手机在线观看| 97热精品久久久久久| 精品久久久噜噜| 久久热精品热| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久人妻av系列| 身体一侧抽搐| 综合色丁香网| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产午夜福利久久久久久| 久久中文看片网| 免费观看的影片在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩精品中文字幕看吧| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美人与善性xxx| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩国内少妇激情av| 一个人看视频在线观看www免费| 十八禁网站免费在线| 日韩欧美国产在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 国产高清视频在线观看网站| 99在线视频只有这里精品首页| 国产探花极品一区二区| 久久久久久大精品| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 色视频www国产| 久久热精品热| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产免费男女视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美中文日本在线观看视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 成人av在线播放网站| 免费在线观看影片大全网站| 插阴视频在线观看视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 嫩草影院新地址| 中文字幕av在线有码专区| 在线观看一区二区三区| 国产中年淑女户外野战色| 身体一侧抽搐| 在线免费十八禁| 永久网站在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美潮喷喷水| 在线免费观看的www视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产高清视频在线播放一区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲18禁久久av| 又爽又黄a免费视频| 国产精品av视频在线免费观看| 国产69精品久久久久777片| 日韩一本色道免费dvd| 99在线视频只有这里精品首页| 永久网站在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 成年女人看的毛片在线观看| 18禁在线播放成人免费| 久久九九热精品免费| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲18禁久久av| 真实男女啪啪啪动态图| 色噜噜av男人的天堂激情| 老司机午夜福利在线观看视频| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产真实乱freesex| 老熟妇仑乱视频hdxx| 51国产日韩欧美| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产午夜福利久久久久久| 午夜精品在线福利| 亚洲电影在线观看av| 午夜福利视频1000在线观看| 一级黄色大片毛片| 秋霞在线观看毛片| 色吧在线观看| 久久久久久久久久成人| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产精品无大码| 成人美女网站在线观看视频| 国产高清有码在线观看视频| 1000部很黄的大片| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 精品久久国产蜜桃| 成年版毛片免费区| 一进一出抽搐动态| 久久久久久久久大av| 亚洲性久久影院| 国产精华一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久久久久九九精品二区国产| 午夜福利成人在线免费观看| 99在线人妻在线中文字幕| 国内精品一区二区在线观看| 一进一出抽搐动态| 91麻豆精品激情在线观看国产| 91狼人影院| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲三级黄色毛片| 欧美成人a在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产在线精品亚洲第一网站| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲欧美精品自产自拍| 99久国产av精品| 长腿黑丝高跟| 一个人看的www免费观看视频| 久久精品国产亚洲网站| 国产精品,欧美在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 在线免费十八禁| www.色视频.com| 欧美高清成人免费视频www| 最近手机中文字幕大全| www日本黄色视频网| 赤兔流量卡办理| 在线观看午夜福利视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 成人综合一区亚洲| 亚洲精品影视一区二区三区av| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产色婷婷99| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品国内亚洲2022精品成人| 日韩av在线大香蕉| av在线观看视频网站免费| 老女人水多毛片| 国产黄色小视频在线观看| 22中文网久久字幕| 亚洲第一电影网av| 日本免费a在线| 在线观看av片永久免费下载| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久精品人妻少妇| 99热这里只有是精品50| 亚洲性夜色夜夜综合|