中華鱉MyoD1基因SNP鑒定及其與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

黃龍 吳本麗 何吉祥 陳靜 宋光同 汪翔 張燁 武松

（1. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，合肥 230031；2. 水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031）

中華鱉生長(zhǎng)性狀受肌肉發(fā)育等諸多遺傳和環(huán)境因素的影響。生長(zhǎng)性狀的遺傳力低，傳統(tǒng)雜交改良周期長(zhǎng)，尋找控制中華鱉生長(zhǎng)性狀的主效基因及其遺傳標(biāo)記，使用標(biāo)記輔助選擇加快選育進(jìn)程，這對(duì)提高中華鱉生長(zhǎng)性狀具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因?qū)χ腥A鱉肌肉生長(zhǎng)具有調(diào)控作用［1］，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，新的生長(zhǎng)性狀候選基因不斷被挖掘，如GRBP2基因和THSP基因［2］。同時(shí)，仍然有較多報(bào)道從基因功能來(lái)推測(cè)基因可能影響生長(zhǎng)性狀，通過(guò)擴(kuò)增多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析來(lái)證明SNP與生長(zhǎng)性狀的關(guān)系，如IGF2基因［3］和GHRL基因［4］。這些研究使得生長(zhǎng)性狀可利用的標(biāo)記不斷增加。

MyoD1（Myogenic differentiation 1） 是 生 肌 調(diào)節(jié)因子家族（MRFs）的重要成員，在肌形成早期階段參與決定肌形成的發(fā)生［5-6］。該基因與肌肉基因啟動(dòng)子的特異性區(qū)域（E-BOX）相結(jié)合后激活肌肉特異性轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肌前體細(xì)胞的增殖和分化，可使成纖維細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞，并最終分化為成熟肌纖維［7］。目前，在金頭鯛（Sparus aurata）［8］、 鱈（Gadus macrocephalus）［9］、 文 昌 魚(yú)（Branchiostoma belcheri）［10］、 黃 顙 魚(yú)（Pelteobagrus fulvidraco）［11］、 鱖 魚(yú)（Siniperca chuatsi）［12］和 長(zhǎng)絲裂腹魚(yú)（Schizothorax dolichonema）［13］等水產(chǎn)動(dòng)物已完成MyoD基因的克隆、序列分析和表達(dá)等研究。鑒于MyoD1基因是影響動(dòng)物生長(zhǎng)性狀的重要候選基因，且中華鱉MyoD1基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)直接測(cè)序法檢測(cè)MyoD1基因多態(tài)位點(diǎn)，以期獲得與中華鱉生長(zhǎng)相關(guān)的SNP，為中華鱉分子標(biāo)記輔助選育奠定工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)中華鱉取自安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所稻田養(yǎng)鱉基地，隨機(jī)選擇同批繁殖、同塊稻田養(yǎng)殖的2冬齡健康中華鱉共178只（其中雄性135只，雌性43只）。測(cè)量樣本體質(zhì)量、背甲長(zhǎng)、背甲寬、腹甲長(zhǎng)、腹甲寬、裙邊后側(cè)寬和體高7項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)。同時(shí)剪取200 mg左右的裙邊組織，按照天根生化科技（北京）有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)提取中華鱉組織DNA，使用瓊脂糖和紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA質(zhì)量和濃度，-20℃保存。2×TaqPCR master mix和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司；引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成；瓊脂糖為Sigma公司（美國(guó)）產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1MyoD1基因的擴(kuò)增及突變位點(diǎn)基因分型 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的中華鱉MyoD1基因序列（GenBank登錄號(hào)：NW_005858157.1）設(shè)計(jì)4對(duì)引物（表1），以中華鱉基因組DNA為模板，采用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增MyoD1基因的各個(gè)片段。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20.0 μL，PCR反應(yīng)體系包括10.0 μL 2×TaqPCR master mix、上下游引物（20 μmol/L）各 0.5 μL、模板 DNA 0.5 μL，加 dd H2O 至 20.0 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物純化后送至生工生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，獲得SNP位點(diǎn)。

表1 中華鱉MyoD1基因擴(kuò)增引物

1.2.2 構(gòu)建連鎖圖譜 利用Haploview軟件進(jìn)行SNP位點(diǎn)間連鎖分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用Picalc程序包計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC），利用Popgene 32軟件計(jì)算觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和哈溫平衡常數(shù)。采用SPSS 20軟件的GLM程序?qū)yoD1基因SNP與生長(zhǎng)性狀的進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，因變量為中華鱉7項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)，自變量為篩選到的突變位點(diǎn)不同基因型。其生物統(tǒng)計(jì)模型為：Yij=μ+Gi+Sj+eij，式中，Yij表示某性狀第i個(gè)標(biāo)記在第j個(gè)個(gè)體上的觀測(cè)值，μ表示試驗(yàn)觀測(cè)的所有個(gè)體平均值，Gi表示第i個(gè)標(biāo)記的基因型效應(yīng)，Sj表示第i個(gè)標(biāo)記的性別效應(yīng)，eij表示對(duì)應(yīng)個(gè)體觀測(cè)值的隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 MyoD1基因突變位點(diǎn)篩選

通過(guò)序列比對(duì)，MyoD1基因有6個(gè)堿基位置發(fā)生突變，其中2個(gè)突變發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)域（T-49G和A-38G），2個(gè)突變發(fā)生在內(nèi)含子1（C91T和A187T），1個(gè)位點(diǎn)突變發(fā)生在外顯子2（C880T），還有1個(gè)突變發(fā)生在外顯子2下游區(qū)域（T1522A）。其中，C880T位點(diǎn)為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致所編碼的氨基酸由丙氨酸（A）突變?yōu)槔i氨酸（V），核酸位置以所參考序列的第一個(gè)堿基為參考值1。等位基因頻率和基因型頻率，見(jiàn)表2。

2.2 MyoD1基因突變位點(diǎn)在中華鱉群體中的遺傳結(jié)構(gòu)分析

對(duì)178只中華鱉MyoD1基因的6個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，統(tǒng)計(jì)其遺傳參數(shù)（表2）。結(jié)果表明，多態(tài)信息含量（PIC）為0.168 9-0.373 0，期望雜合度（He）為0.186 8-0.497 4，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.228 9-1.984 0，PIC和He多數(shù)處于0.25-0.50之間（除C880T位點(diǎn)），說(shuō)明多數(shù)SNP位點(diǎn)具有中度多態(tài)性。經(jīng)卡方適合性檢驗(yàn)，MyoD1基因除A187T 位點(diǎn)外，其余5個(gè)位點(diǎn)在中華鱉群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.3 MyoD1基因SNP位點(diǎn)間的連鎖分析

利用Haploview軟件對(duì)中華鱉群體的MyoD1基因的6個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析，并且構(gòu)建連鎖圖譜，結(jié)果如圖1可以看出，6個(gè)SNPs之間r2均沒(méi)有大于或等于0.8，說(shuō)明中華鱉群體連鎖不緊密，沒(méi)有形成連鎖區(qū)塊，故按照單標(biāo)記分析進(jìn)行突變位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析。

表2 中華鱉MyoD1基因6個(gè)SNPs等位基因及基因型頻率

表3 中華鱉MyoD1基因SNP位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)

圖1 中華鱉MyoD1基因6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)連鎖不平衡分析

2.4 MyoD1基因突變位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

采用一般線性模型分析中華鱉MyoD1基因6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)不同基因型與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性（表4）。T-49G位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的背甲寬存在顯著差異（P＜0.05），突變型（GG）顯著大于野生型（TT），為優(yōu)勢(shì)基因型；A-38G位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的背甲寬存在顯著差異（P＜0.05），突變型（AG）顯著大于野生型（AA），為優(yōu)勢(shì)基因型；A187T位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的體高存在顯著差異（P＜0.05），突變型（TT）顯著大于野生型（AA），為優(yōu)勢(shì)基因型；T1522A位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的體質(zhì)量存在顯著差異（P＜0.05），突變型（AA）顯著大于野生型（TT）和雜合型（TA），為優(yōu)勢(shì)基因型。

表4 中華鱉MyoD1基因與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

基因組中的SNPs多數(shù)位于非編碼區(qū)域，因受到選擇壓力較小容易積累變異，而外顯子變異率僅為周圍序列的1/5［14-16］。本研究中，MyoD1基因在中華鱉群體中共檢測(cè)到6個(gè)SNP位點(diǎn)，其中T-49G和A-38G位點(diǎn)位于基因啟動(dòng)子區(qū)域，C91T和A187T位點(diǎn)位于基因內(nèi)含子1，C880T位于基因外顯子2，T1522A位于基因外顯子2下游區(qū)域。雖然基因非編碼區(qū)的突變位點(diǎn)不參與氨基酸編碼，但會(huì)改變基因表達(dá)效率進(jìn)而影響機(jī)體的生命活動(dòng)［17-19］。C880T位點(diǎn)僅存在CC和CT基因型，可能是實(shí)驗(yàn)群體經(jīng)多代選育，人工選擇使部分等位基因頻率發(fā)生改變，需擴(kuò)大樣本群體做進(jìn)一步研究。

生肌調(diào)節(jié)因子家族由MyoD、Myf5、MyoG和MrF44個(gè)成員組成，在肌肉生成、肌原纖維蛋白合成及肌纖維數(shù)量調(diào)節(jié)等方面起到重要作用，其中，MyoD基因在骨骼肌發(fā)育過(guò)程起關(guān)鍵的正向調(diào)控作用，促進(jìn)骨骼肌的形成和分化［20-21］。研究表明，MyoD基因突變體會(huì)引起斑馬魚(yú)胚胎期體節(jié)肌肉減少［22］。MyoD基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性能的關(guān)聯(lián)研究在水產(chǎn)動(dòng)物中報(bào)道不多。于凌云等［23］在獲取大口黑鱸MyoD基因序列后篩選出7個(gè)與生長(zhǎng)性狀相關(guān)聯(lián)的突變位點(diǎn)；陳松波等［24］在牙鲆MyoD基因內(nèi)含子1上發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP對(duì)體重、體長(zhǎng)和體高等生長(zhǎng)性狀影響顯著；Chen等［25］分析了MyoD1a基因和MyoD1b基因在虹鱒群體的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)肉質(zhì)性狀有顯著影響；陳靜等［26］在草魚(yú)MyoD基因內(nèi)含子1上發(fā)現(xiàn)SNP在體質(zhì)量、體寬、體高和眼間距等生長(zhǎng)性狀存在顯著差異。

在本研究中MyoD1基因多態(tài)性位點(diǎn)與中華鱉生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析結(jié)果表明，基因啟動(dòng)子區(qū)域T-49G位點(diǎn)的不同基因型在背甲寬存在顯著差異（P＜0.05），GG基因型顯著大于TT基因型；基因啟動(dòng)子區(qū)域A-38G位點(diǎn)的不同基因型在背甲寬存在顯著差異（P＜0.05），AG基因型顯著大于AA基因型；內(nèi)含子1 A187T位點(diǎn)的不同基因型在體高存在顯著差異（P＜0.05），TT基因型均顯著大于AA基因型，體重、背甲長(zhǎng)、背甲寬、腹甲長(zhǎng)、腹甲寬、裙邊后側(cè)寬雖無(wú)顯著差異，但TT基因型也均大于AA和AT基因型。外顯子2下游區(qū)域T1522 A位點(diǎn)的不同基因型在體質(zhì)量存在顯著差異（P＜0.05），AA基因型顯著大于TT和TA基因型。因此，MyoD1基因可作為研究中華鱉生長(zhǎng)性狀的候選基因，下一步工作要增加關(guān)聯(lián)的樣本數(shù)，著重分析T-49G、A-38G、A187T和T1522A位點(diǎn)的影響效用，進(jìn)一步篩選出中華鱉分子標(biāo)記輔助選育的有效標(biāo)記。

4 結(jié)論

本研究在中華鱉MyoD1基因上鑒定出6個(gè)SNP位 點(diǎn)（T-49G、A-38G、C91T、A187T、C880T和T1522A），其中C880T位于外顯子上，屬于錯(cuò)義突變。除A187T 位點(diǎn)外，其余5個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg定律。分析各位點(diǎn)與中華鱉生長(zhǎng)性狀之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，T-49G位點(diǎn)GG基因型個(gè)體的背甲寬顯著大于TT基因型，A-38G位點(diǎn)AG基因型個(gè)體的背甲寬顯著大于AA基因型，A187T位點(diǎn)TT基因型個(gè)體的體高顯著大于AA基因型，T1522A位點(diǎn)AA基因型個(gè)體的體質(zhì)量顯著大于TT、TA基因型，其余位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的生長(zhǎng)性狀均不存在顯著差異。