牙鲆cbx2基因的分子特征與組織表達(dá)

王新艷 張俊玲，2，3 施志儀，2，3

（1. 上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；3. 上海海洋大學(xué) 上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

色素框同源蛋白（Chromobox homolog，CBX）是組成多梳蛋白復(fù)合體（Polycomb group complex，PcG）的主要核心蛋白［1-4］，目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)該蛋白家族包含CBX2、CBX4、CBX6、CBX7和CBX8 5個(gè)成員［5］。CBXs各蛋白雖然具有共同保守的結(jié)構(gòu)域，但各個(gè)成員的分子大小、組織分布及生物學(xué)功能卻存在較大的差異。由于近年來CBX2在哺乳動物人和小鼠性發(fā)育中作用的發(fā)現(xiàn)，逐漸成為研究的熱點(diǎn)［5］。

cbx2基因最早于1992年在果蠅中被發(fā)現(xiàn)［6］，在1997年被確認(rèn)是PcG復(fù)合體的組成成分［7］。該復(fù)合體作為轉(zhuǎn)錄抑制物廣泛參與細(xì)胞周期調(diào)控、X-染色體失活、干細(xì)胞分化、衰老及腫瘤發(fā)生等重要生命過程［8-10］。在人和鼠中，cbx2基因主要在性腺中表達(dá)，尤其在精巢中的表達(dá)量較高。Katoh-Fukui等［11］發(fā)現(xiàn)，在小鼠中對M33（cbx2）基因缺失或進(jìn)行擾亂，會產(chǎn)生雄鼠向雌鼠轉(zhuǎn)變的性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象；在人類中，cbx2基因的缺失則會導(dǎo)致46，XY性別發(fā)育障礙（Disorders of sex development，DSD）［12］，最新研究發(fā)現(xiàn)，cbx2基因有兩個(gè)亞型cbx2.1和cbx2.2，cbx2.1即為上述的cbx2，cbx2.2如果發(fā)生突變也會喪失對性別發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的46，XY DSD缺陷［13］。這些研究表明cbx2可能通過調(diào)節(jié)性別發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而在哺乳動物（人和小鼠）的性發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。但迄今為止，關(guān)于cbx2在低等脊椎動物，尤其是魚類性別分化和性腺發(fā)育中的作用未見報(bào)道。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）隸屬于鰈形目（Pleuronectiforms），是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一，雌性個(gè)體較雄性個(gè)體大且生長快［14］，其性腺發(fā)育與分化的分子機(jī)制一直是近年來魚類生殖發(fā)育研究的重點(diǎn)。鑒于cbx2基因在哺乳動物性發(fā)育中的重要作用，本研究利用PCR克隆和生物信息學(xué)方法鑒定了牙鲆cbx2基因，并采用RT-PCR技術(shù)分析了其在牙鲆不同組織的表達(dá)，旨為進(jìn)一步闡明cbx2基因在牙鲆性腺發(fā)育和分化中的功能奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

牙鲆成魚購自上海市銅川路水產(chǎn)市場，解剖取其精巢、卵巢、腦、肝臟、肌肉、胃及鰓組織。各組織樣品經(jīng)焦碳酸二乙酯處理水沖洗干凈，立即置于Trizol（Invitrogen）中勻漿，再用于總RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 牙鲆cbx2基因的分子克隆 通過查詢NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），我們獲得了來自牙鲆的cbx2cDNA（XM_020094544）序列，該cDNA序列包括完整的開放閱讀框（Open reading frame，ORF）。為保證克隆cDNA序列的準(zhǔn)確性，設(shè)計(jì)3對基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，經(jīng)拼接得到其全長cDNA并推導(dǎo)的氨基酸序列，見圖1。

1.2.2cbx2基因的生物信息學(xué)分析 首先通過ExPASy-ProtParam在線分析牙鲆CBX2蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與疏水性；利用SignalP 4.1預(yù)測其是否具有蛋白跨膜區(qū)和蛋白信號肽；利用SMART和swissmodel預(yù)測CBX2蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)。

然后在NCBI中查閱各物種cbx2同源基因信息，并進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)比較分析；采用BioEdit對牙鲆CBX2與其他物種進(jìn)行氨基酸序列比對，并利用MEGA5.1構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹。其他物種同源基因的序列登錄號如下：杜氏鰤（Seriola dumerili），XP_022595013.1； 尖 吻 鱸（Lates calcarifer），XP_018518344.1； 大 黃 魚（Larimichthys crocea），XP_019117076.1；尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus），XP_005469121.1；半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis），XP_008327382.1；大 西 洋 鮭（Salmo salar）， 青鳉（Oryzias latipes），NP_001098386.1； 人（Homo sapiens），NP_005180.1； 斑 馬 魚（Danio rerio），NP_919354.1；小鼠（Mus musculus）NP_031649；熱帶爪蟾（Xenopus tropicalis），XP_017949680。

最后，通過 Ensembl Genome Browser（http：//www.ensembl.org/index.html）確定cbx2及其相鄰基因在染色體上的定位。

1.2.3 RT-PCR檢測cbx2基因的組織表達(dá) 上述總RNA經(jīng)DNase I（Promega）處理以去除基因組DNA，然后在M-MLV reverse transcriptase（Promega）作用下合成cDNA第一條鏈。使用Primer5.0設(shè)計(jì)牙鲆cbx2基因和內(nèi)參基因18s的PCR引物，cbx2的上下游引物序列分別為：GTCACAGATGTCACCGCTAATC和 TCAGAACCCAAATCCCCTC，18s的 上 下 游引物序列分別為：AGTTGGTGGAGCGATTTG和CTCGGCGAAGGGTAGACA。

PCR反應(yīng)在C1000 TouchTM Thermal Cycler（Bio-Rad）上進(jìn)行，其反應(yīng)體系為：cDNA1μL，上下游引物1 μL，Taq PCR Master Mix（上海生物工程公司）10 μL及 7 μL滅菌水。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃2 min；95℃ 30 s；60℃ 30 s；72℃ 30 s；進(jìn)行35個(gè)循環(huán)反應(yīng)；然后72℃延伸5 min。獲得的PCR產(chǎn)物用于2%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、拍照，以檢測cbx2在牙鲆各組織的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 cbx2 cDNA的序列克隆及其同源基因結(jié)構(gòu)比較

經(jīng)PCR克隆和測序獲得的牙鲆cbx2cDNA序列如圖1所示，其開放閱讀框長為1 584 bp，編碼527個(gè)氨基酸。

圖1 牙鲆cbx2 cDNA及推導(dǎo)的氨基酸序列

脊椎動物cbx2同源基因結(jié)構(gòu)比較分析發(fā)現(xiàn)，cbx2基因在哺乳動物人和小鼠中包含6個(gè)外顯子，其編碼區(qū)與非編碼區(qū)在整個(gè)基因的分布大致相同；而在珠雞（Numida meleagris）、熱帶爪蟾、斑馬魚、青鳉、羅非魚（Oreochromisspp.）和牙鲆中則只有5個(gè)外顯子，其中牙鲆、青鳉、尼羅羅非魚的cbx2基因的編碼區(qū)與非編碼區(qū)排列分布更為相似，均具有較小的外顯子1、2、3、4和大的外顯子5，外顯子還包含了一個(gè)較大的3’-非翻譯區(qū)（Untranslated region，UTR）。

2.2 CBX2蛋白的空間結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析

圖2 脊椎動物cbx2基因結(jié)構(gòu)的比較分析

SMART和SWISS-MODEL預(yù)測牙鲆CBX2蛋白的二級與三級結(jié)構(gòu)如圖3，其二級結(jié)構(gòu)中包含1個(gè)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域和4個(gè)低復(fù)雜結(jié)構(gòu)域（紫色區(qū)域），該染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域是真核生物蛋白質(zhì)模體之一，高度保守，含30-50個(gè)氨基酸，常結(jié)合甲基化氨基酸殘基，存在于動植物細(xì)胞核內(nèi)參與調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的若干蛋白質(zhì)中。三級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，牙鲆CBX2蛋白包含13.28%的α-螺旋、11.20%的延伸鏈、3.24%的β轉(zhuǎn)角和72.11%的不規(guī)則卷曲，其中以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，不均勻地分布于整個(gè)蛋白質(zhì)多肽鏈上。

圖3 牙鲆CBX2蛋白的二級及三級結(jié)構(gòu)

經(jīng)SignalP 4.1分析，CBX2蛋白無信號肽、無跨膜區(qū)域，表明該蛋白既不是分泌蛋白質(zhì)也不是跨膜蛋白質(zhì)。在其編碼的527個(gè)氨基酸序列中包含20種常見的氨基酸，其中Ser（S）含量最高（15.9%），其次為 Lys（K）（9.7%），而 Pyl（O）和 Sec（U）的含量為0。通過ExPASy-ProtParam分析得到其分子式為C2418H3966N752O805S8，分子量為56 578.98 K，等電點(diǎn)為10.03，是一種不穩(wěn)定的堿性親水性蛋白。

2.3 牙鲆cbx2基因的同源性與系統(tǒng)進(jìn)化分析

氨基酸序列比對分析（圖4）發(fā)現(xiàn)，牙鲆cbx2基因cDNA 推導(dǎo)出的氨基酸序列與杜氏鰤的同源性最高，為89%；其次是尖吻鱸和大黃魚，其同源性分別為88%和85%；與尼羅羅非魚、半滑舌鰨和大西洋鮭的同源性分別為77%、68%和60%，與青鳉、斑馬魚的同源性僅有57%和53%；與兩棲類和哺乳動物的同源性較低，如與熱帶爪蟾的同源性為42.51%，與人類和小鼠分別為41%和40.52%。但是，CBX2蛋白的同源結(jié)構(gòu)域在脊椎動物是保守的，尤其是在魚類中高度一致。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，牙鲆CBX2與所有魚類聚為一支（圖5）。基因同線性分析顯示了cbx2基因與相鄰基因在染色體上的相對位置，雖然在魚類中與cbx2基因相鄰的基因被定名的較少，但在哺乳類的人類、小鼠和鳥類的珠雞中，與cbx2基因鄰近的基因較為一致，均有cbx8和enpp7基因（圖6）。

2.4 cbx2基因在牙鲆中的組織表達(dá)

RT-PCR結(jié)果（圖7）顯示，cbx2基因在成體牙鲆的各個(gè)組織中均有表達(dá)，但在不同組織的表達(dá)水平差異顯著。其中牙鲆cbx2基因在精巢中表達(dá)量最高，卵巢次之，在腦中也有較高的表達(dá)，但在肌肉、胃、鰓和肝臟中的表達(dá)則較低。

3 討論

本研究通過分子克隆與生物信息學(xué)方法鑒定了牙鲆cbx2基因，基因結(jié)構(gòu)、氨基酸同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明cbx2基因在脊椎動物進(jìn)化中較為保守，理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示牙鲆CBX2蛋白是一種偏堿性的親水性蛋白，編碼該蛋白的氨基酸中以絲氨酸（Sr）的含量為最高，而絲氨酸富集區(qū)是磷酸化的主要位點(diǎn)［15］。研究表明該絲氨酸富集區(qū)的殘基正是CBX2的磷酸化位點(diǎn)，且在細(xì)胞內(nèi)是穩(wěn)定磷酸化的［16］。從魚類到人類的進(jìn)化中，絲氨酸富集區(qū)的長度有所減少，其在魚類中一般有 24 個(gè)絲氨酸殘基，而在人類中有一個(gè)延伸的 16 個(gè)絲氨酸殘基［17］。在成年小鼠的肝細(xì)胞中，CBX2 的鼠同源物 M33穿梭于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間，在快速增殖的細(xì)胞中M33蛋白僅在細(xì)胞核中以高度磷酸化的形式存在，而在休眠細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，M33則主要以去磷酸化的形式存在［8］?？臻g結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，牙鲆CBX2蛋白以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，其二級結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域和4個(gè)低復(fù)雜結(jié)構(gòu)域。研究表明，該染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域常結(jié)合甲基化氨基酸殘基，主要調(diào)控異染色質(zhì)與基因表達(dá)，此外還與H3K27me3結(jié)合，H3K27me3是另一種典型的表觀遺傳基因沉默標(biāo)記，常位于發(fā)育相關(guān)基因的啟動子區(qū)［18］，這表明CBX2蛋白在表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。

圖4 牙鲆CBX2和其他物種的氨基酸序比對分析

圖6 脊椎動物cbx2基因的同線分析

圖7 牙鲆cbx2基因的組織表達(dá)

性別分化與性腺發(fā)育一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，目前關(guān)于cbx2基因在性發(fā)育中的研究主要集中在人類和小鼠中，而在低等脊椎動物包括魚類中幾乎未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，cbx2基因在牙鲆精巢的表達(dá)量最高，在卵巢和腦中也有較高的表達(dá)，而在其他組織的表達(dá)量較低?；?014年Fagerberg等［19］的RNA測序，數(shù)據(jù)分析顯示在人類正常組織中，cbx2在精巢的表達(dá)量最高，卵巢、胎盤次之，在肺中也有一定量的表達(dá)，而在其他組織中表達(dá)量較低；同樣基于2014年Yue等［20］在小鼠中的測序，顯示cbx2在腦、四肢表達(dá)量較高，在卵巢和性腺也有較高的表達(dá)，但在其他組織表達(dá)量則較低。研究表明，cbx2基因在哺乳動物的細(xì)胞周期變化［8，21］、減數(shù)分裂、同源染色體的聯(lián)會和生殖細(xì)胞增殖分化中發(fā)揮著較為重要的作用［22］。Katoh-Fukui等［23］早在 1998年發(fā)現(xiàn)，在小鼠中通過對m33（cbx2）基因進(jìn)行擾亂或基因缺失，會產(chǎn)生雄性小鼠向雌性轉(zhuǎn)變的性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象，且由于m33的突變會導(dǎo)致雌性小鼠胚胎的生殖脊發(fā)育遲緩，性腺生長的缺陷在Y染色體特定的SRY（Sex region of Y chromosome）表達(dá)時(shí)會顯現(xiàn)出來，暗示m33（cbx2）缺失可能是通過干擾SRY上游的某些因子從而導(dǎo)致了性反轉(zhuǎn)，因而推測m33（cbx2）可能是小鼠性別決定的重要基因［11］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在m33（cbx2）基因敲除的小鼠中，m33（cbx2）是ad4bp/sf1表達(dá)的上游調(diào)控基因，能刺激靶基因同向表達(dá)；在人類中的研究表明cbx2通過激活相關(guān)的啟動子區(qū)能刺激靶基因sf1/nr5a1的表達(dá)，如果cbx2突變將失去對靶基因sf1/nr5a1的調(diào)控，從而引起性別發(fā)育異常［12］。這與先前報(bào)道的CBX2作為PcGs的組成成分，是組蛋白表觀遺傳修飾的轉(zhuǎn)錄抑制因子不同，cbx2還可作為基因轉(zhuǎn)錄的激活因子發(fā)揮作用。事實(shí)上，cbx2一方面為精巢中雄性表達(dá)的特性基因；另一方面還通過調(diào)控Foxl2和Wnt4信號通路進(jìn)而抑制雌性的某些信號通路［24］。因此，cbx2基因在牙鲆精巢和卵巢中的高表達(dá)，提示了該基因在牙鲆性腺發(fā)育中可能發(fā)揮著重要的作用，而具體的功能和作用機(jī)制非常值得進(jìn)一步深入的研究。

4 結(jié)論

本研究通過PCR克隆和測序獲得了牙鲆cbx2基因的cDNA序列，采用多種生物信息學(xué)方法明確了其分子特性，并利用RT-PCR技術(shù)證明了其在牙鲆性腺（尤其是精巢）組織具有較高的表達(dá)，初步探討了cbx2基因在牙鲆性腺發(fā)育中的作用。