拮抗匍枝根霉的生防菌R1B的篩選鑒定和抑菌活性分析

武利勤 尚宏忠 顧?？?/p>

（1. 北京市輻射中心射線束技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100875；2. 北京師范大學(xué)核科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100875）

梨是我國(guó)栽培歷史久、面積大、產(chǎn)量高的果樹(shù)之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)梨是我國(guó)第3大水果，目前全國(guó)年產(chǎn)量占全世界產(chǎn)量的75%［1］。梨果實(shí)在貯藏期間，時(shí)刻會(huì)受到病害的威脅，其中梨軟腐病主要由匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）引起［2］，主要危害梨果實(shí)，在果實(shí)傷口多、貯藏期溫度高時(shí)發(fā)生較重。高溫時(shí)，5-6 d內(nèi)可使病果全部軟腐，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。匍枝根霉可以侵染多種果蔬，引起的軟腐病已經(jīng)成為一種世界性病害。

新鮮水果采后腐爛是一個(gè)全球性的問(wèn)題。目前生產(chǎn)上常采用化學(xué)藥劑防治梨采后病害，這樣不僅造成環(huán)境污染，而且增加了農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥的殘留量，給人類健康帶來(lái)潛在危害，同時(shí)也易誘導(dǎo)致病菌抗藥性的產(chǎn)生而無(wú)法控制病害。生物防治利用物種間的拮抗作用來(lái)減少病害的發(fā)生，對(duì)人畜安全、環(huán)境兼容性好、病蟲(chóng)害不易產(chǎn)生抗藥性，因而具有化學(xué)殺菌劑不具有的優(yōu)勢(shì)，正逐步成為代替化學(xué)殺菌劑的最佳方式。獲得高效拮抗菌是生物防治的基礎(chǔ)?？莶菅堪麠U菌（Bacillus subtilis）是最早被報(bào)道用來(lái)防治柑橘病害的細(xì)菌［3］。隨著研究的深入，人們已篩選并報(bào)道多種對(duì)果蔬采后病害具有防治效果的拮抗菌，主要是酵母菌、芽胞桿菌、假單胞菌和木霉菌［4］。幾株微生物拮抗菌已經(jīng)被授權(quán)專利并商業(yè)應(yīng)用，如Aspire（Candida oleophila，USA）、Biosave（Pseudomonas syringae，USA）、“Shemer”（MetschnikowiaFructicola，Israel）等［4］。微生物拮抗菌可以產(chǎn)生具有高拮抗活性的廣譜抗菌物質(zhì)，具有極強(qiáng)的抗逆能力，同時(shí)具有無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)致病性、對(duì)人畜安全、環(huán)境相容性好等特點(diǎn)，滿足了消費(fèi)者對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和安全性的要求。

本研究擬從本實(shí)驗(yàn)室分離保存的來(lái)源于霍山石斛、花生及蘭州百合的65株內(nèi)生菌中，篩選對(duì)梨軟腐病菌有較好拮抗活性的菌株，并對(duì)篩選得到的高活性拮抗菌，初步探討其抑菌物質(zhì)，為梨軟腐病菌的防治提供生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株、植物材料和培養(yǎng)基 來(lái)自霍山石斛的內(nèi)生菌 22 株，花生內(nèi)生菌 25 株，蘭州百合內(nèi)生菌 18 株，以及梨軟腐病菌（Rhizopus stolonifer）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化鈉 10 g，水 1 L，pH 值 7.4-7.6。用于細(xì)菌的培養(yǎng)。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 15 g、水 1 L，pH值自然。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、水 1 L，pH 值自然。用于真菌的培養(yǎng)。121℃滅菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 梨軟腐病拮抗內(nèi)生菌的篩選 拮抗內(nèi)生菌的篩選采用對(duì)峙培養(yǎng)法，直徑 8 mm 的軟腐病病菌接種在直徑 9 cm 的 PDA 平板一側(cè)，相對(duì)的一側(cè)劃線接種不同的內(nèi)生菌株，兩接種點(diǎn)相距3-4 cm，病原菌單獨(dú)接種在 PDA 平板上做對(duì)照，均設(shè)3個(gè)重復(fù)，在25℃條件下培養(yǎng)，2 d后測(cè)量抑菌帶寬度。

1.2.2 菌株R1B對(duì)梨軟腐病菌菌絲生長(zhǎng)的影響 在PDA 培養(yǎng)基上活化梨軟腐病菌匍枝根霉，用 8 mm的槍頭在生長(zhǎng) 2 d的匍枝根霉邊緣打取菌餅，研碎后接種于盛有 50 mL 的 1/10 PDB 培養(yǎng)基中，25℃，150 r/min 培養(yǎng) 2 d后，加入過(guò)夜培養(yǎng)的R1B菌懸液，使終濃度為 1×107CFU/mL，并以單獨(dú)接種在接種在 1/10 PDB 培養(yǎng)基中的軟腐病菌做對(duì)照。3 個(gè)重復(fù)，在 25℃ 條件下培養(yǎng)后鏡檢菌絲生長(zhǎng)狀況。

1.2.3 菌株 R1B防治梨果實(shí)軟腐病的效果測(cè)定 河北水晶梨購(gòu)自市場(chǎng)，選取外觀整齊、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)外傷的果實(shí)，先用自來(lái)水沖洗干凈，然后用75%酒精棉球擦拭消毒，晾干后備用。菌株R1B 活化后，接種在盛有50 mL LB 液體培養(yǎng)基中的搖瓶中，30℃，150 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)備用。梨軟腐病菌接種在PDA平板中培養(yǎng)5 d，在平板中加入無(wú)菌水刮下軟腐病菌孢子，然后利用血球計(jì)數(shù)器計(jì)算孢子數(shù)目，用無(wú)菌水將軟腐病菌孢子濃度調(diào)整到1×105spores/mL。用1 mL 槍頭在梨果實(shí)表面赤道部位對(duì)稱打兩個(gè)直徑8 mm、深度3 mm 的傷口，在傷口內(nèi)分別接種30 μL 5×107CFU/mL 的 R1B菌懸液（R1B處理組）和等量無(wú)菌水（對(duì)照組），每處理8個(gè)果實(shí)，重復(fù)3 次，室溫放置1 d。然后分別在R1B處理組和對(duì)照組的傷口處接種梨軟腐病菌孢子懸液 30 μL，接種處理后放入 PE 密閉箱中在 25℃，RH ＞90%條件下培養(yǎng)，定時(shí)觀察并記錄結(jié)果，并計(jì)算平均發(fā)病率（%）和平均病斑直徑（mm）。利用Microsoft Excel 2010 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并采用t測(cè)驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P＜ 0.05）。

1.2.4 菌株R1B的鑒定 生理生化鑒定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［5］中芽孢菌屬的鑒定方法。分子生物學(xué)鑒定：菌株R1B16S rDNA 序列擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果分析按照武利勤等［6］的方法。R1B 基因組利用通用引物 27F 和 1492R 進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后由北京諾賽有限公司測(cè)序。獲得的 16S rDNA 基因序列在 GenBank 中進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，用 Clustal X 軟件進(jìn)行序列相似性分析，采用 MEGA 5 軟件以Neighbor-joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用 Bootstrap（1 000 次重復(fù)）進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2.5 脂肽類抗菌活性物質(zhì)合成相關(guān)基因的分析 參考Mora等［7］的方法，PCR擴(kuò)增菌株R1B 基因組 DNA，篩選其是否含有合成相關(guān)抗菌物質(zhì)的基因，包括srfAA（surfactin表面活性素），ituC（iturin伊枯草菌素），bmyB（bacyllomicin桿菌抗霉素），fenD（fengycin豐原素），spaS（subtilin枯草菌素），以及bacA（bacilysin溶桿菌素）。表1是使用的引物信息［7］。50 μL 的 PCR 反應(yīng)體系包括：Premix Taq 25 μL，濃度為 10 μM 的引物各 2 μL，DNA 2 μL（20 ng），ddH2O 補(bǔ)足至 50 μL。PCR 反應(yīng)條件為 ：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，退火1 min，70℃延伸1 min，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后70℃延伸5 min，其中srfAA，ituC，fenD，bacA和spaS退火溫度為58℃，bmyB退火溫度為55℃。擴(kuò)增產(chǎn)物由北京諾賽有限公司純化后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序獲得的基因序列利用BLAST在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性檢索及比對(duì)分析，并提交到 Genbank：bacA（MK174675）、ituC（MK174678）、bmyB（MK174676） 及fenD（MK174677）。

2 結(jié)果

2.1 梨軟腐病拮抗菌的篩選

從霍山石斛、花生及蘭州百合的葉片和根組織中分離獲得的內(nèi)生菌共 65 株，利用對(duì)峙培養(yǎng)法篩選拮抗軟腐病菌的內(nèi)生菌。軟腐病菌生長(zhǎng)迅速，1 d即可滿皿（圖 1-B），大多數(shù)內(nèi)生菌被軟腐病菌覆蓋吞噬，無(wú)拮抗活性；而菌株R1B表現(xiàn)出一定的抑菌作用，R1B 周圍有明顯的抑菌帶（0.5-1 cm），10 d后依然清晰（圖 1-A）。

表1 用于菌株R1B脂肽類抗菌活性物質(zhì)相關(guān)合成基因分析的引物［7］

圖1 菌株R1B對(duì)軟腐病菌的抑菌作用

2.2 菌株R1B對(duì)軟腐病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

結(jié)果如圖 2 所示，在菌株R1B作用下，軟腐病菌幾乎不能生長(zhǎng)，菌絲斷裂、自溶（圖2-A），而對(duì)照病菌菌絲生長(zhǎng)旺盛（圖2-B）。說(shuō)明菌株R1B可完全抑制軟腐病菌菌絲的生長(zhǎng)。

2.3 菌株R1B在防治梨果實(shí)軟腐病中的應(yīng)用

菌株R1B對(duì)梨果實(shí)軟腐病的防治作用如圖3、表 2 所示，接種軟腐病菌匍枝根霉后，對(duì)照組發(fā)病迅速，在接種軟腐病菌2 d后，對(duì)照組病斑直徑已達(dá)6-9 cm，R1B處理組可以完全抑制梨果實(shí)軟腐病的發(fā)生；4 d后，對(duì)照組梨果實(shí)全部腐爛，滲出大量的液體，且布滿黑色菌絲和孢子；而R1B處理組依然100% 抑制梨果實(shí)軟腐病的發(fā)生；12 d后R1B處理組開(kāi)始發(fā)病。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明R1B對(duì)梨果實(shí)軟腐病的發(fā)生有很好的防治作用。

圖2 菌株R1B處理后軟腐病菌菌絲形態(tài)的變化（放大倍數(shù)：400×）

圖3 菌株R1B對(duì)梨軟腐病的防治作用

表2 R1B對(duì)梨果實(shí)軟腐病的防治作用

2.4 菌株R1B的鑒定

2.4.1 菌株R1B的生理生化的鑒定 菌株R1B在LB 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng) 2 d的菌落扁平圓形，乳白色不透明，邊緣鋸齒狀，表面粗糙顆粒狀。菌株R1B的生理生化特性如表 3 所示，菌株R1B屬于好氧菌，甲基紅實(shí)驗(yàn)陰性，接觸酶反應(yīng)、明膠水解、淀粉水解、VP 實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性；可以很好地利用葡萄糖、蔗糖和甘露醇以及D-木糖和D-阿拉伯糖；可以在10% NaCl 中生長(zhǎng)，具有較高的耐鹽性；在50℃可以生長(zhǎng)，但在 28-37℃ 條件下生長(zhǎng)最好。根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，將菌株R1B初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌。

表3 菌株R1B的生理生化特性

2.4.2 菌株R1B16S rDNA 的分子鑒定 將獲得的菌株R1B 16S rDNA序列利用BLAST在GenBank中進(jìn)行同源比對(duì)分析，選擇同源性較高的序列作為參考序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果（圖4）顯示，菌株R1B屬于芽孢桿菌屬Bacillus，與Bacillus velezensis典型菌株MG846018聚為一簇，具有最近的親緣關(guān)系。

2.5 脂肽抗生素合成相關(guān)基因序列分析

圖4 菌株R1B的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

利用6對(duì)引物，分別PCR擴(kuò)增菌株R1B基因組DNA，獲得4條目標(biāo)片段。將其測(cè)序后進(jìn)行BLAST 同源性分析，結(jié)果表明從菌株R1B 擴(kuò)增的bacA基 因（MK174675） 與B. amyloliquefaciensRNB-92（AB973461）中溶桿菌素合成酶bacA基因的同源性為99%，bmyB基因（MK174676）與B.amyloliquefaciens（KY111359）桿菌抗霉素 D合成酶基因bmyB同源性為99%，擴(kuò)增獲得的ituC基因（MK174678）與B. siamensisH1401（MG009462）和B. subtilis（AB050629）中的伊枯草菌素 A合成酶基因ituC同源性為98% 和99%，擴(kuò)增的fenD基因（MK174677）與B. amyloliquefaciens32a（KP453873）中的豐原素合成酶基因fenD同源性為97%。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，菌株R1B基因組中可能存在溶桿菌素、桿菌抗霉素、伊枯草菌素、豐原素合成的操縱子序列，菌株Y1B可能產(chǎn)生抗菌二肽溶桿菌素和2類脂肽類抗菌物質(zhì)。

3 討論

果蔬軟腐病可在世界范圍內(nèi)發(fā)生，軟腐病菌匍枝根霉寄主廣泛，可危害多種果蔬，其生長(zhǎng)迅速，短時(shí)間內(nèi)可引起果蔬的大量腐爛造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前生產(chǎn)上主要采用化學(xué)農(nóng)藥來(lái)防治軟腐病。由于全球?qū)瘜W(xué)殺蟲(chóng)劑的濫用以及由此引起的對(duì)健康和環(huán)境嚴(yán)重的副作用的擔(dān)心，迫切需要采取環(huán)境友好的生物防治方式［8-9］。能產(chǎn)生多種廣譜性的抗菌活性物質(zhì)［10］，并且抗逆性強(qiáng)，在惡劣的條件下可以形成孢子度過(guò)不利的環(huán)境條件保存活力，相比其他生防菌具有明顯優(yōu)勢(shì)的芽孢桿菌［11］是有希望能應(yīng)用于生物防治的微生物。

本研究通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離保存的多種植物內(nèi)生菌進(jìn)行篩選，獲得了一株來(lái)自石斛的具有較好抑菌效果的菌株 R1B，通過(guò)生理生化和分子鑒定，表明菌株R1B與貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis具有最近的親緣關(guān)系。前期研究表明，貝萊斯芽孢桿菌對(duì)多種植物病原菌具有抑菌活性，孫平平等［12］報(bào)道貝萊斯芽孢桿菌 L-1 能夠顯著抑制梨灰霉與青霉菌的擴(kuò)展；張新剛等［13］報(bào)道貝萊斯芽孢桿菌SFJ1可以防治黃瓜灰霉病；杜淑濤等［14］發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌DL-59對(duì)白菜黑斑病具有良好的防治效果。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期的研究結(jié)論一致，在菌株R1B作用下，菌絲斷裂自溶，幾乎完全不能生長(zhǎng)；R1B對(duì)梨果實(shí)軟腐病的發(fā)生也具有良好的防治作用，在接種軟腐病菌 4 d后，對(duì)照組梨果實(shí)全部腐爛，而R1B處理組完全抑制梨果實(shí)軟腐病的發(fā)生，說(shuō)明菌株R1B在梨采后病害的生物防治方面有一定的開(kāi)發(fā)利用潛力。

芽孢桿菌的拮抗活性主要是通過(guò)產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)來(lái)發(fā)揮作用，包括非核糖體途徑合成的抗菌多肽類、脂肽類和聚酮類化合物以及核糖體途徑合成的抗菌蛋白如細(xì)菌素等［15］，這些活性物質(zhì)的產(chǎn)生與其生防效果具有密切的關(guān)系。脂肽類化合物是芽孢桿菌產(chǎn)生的主要的抑菌活性物質(zhì)，主要包括表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）、豐原素（Fengycin）三大家族，其中伊枯草菌素、豐原素對(duì)真菌有強(qiáng)烈的拮抗作用［15］，而表面活性素可以幫助芽孢桿菌在宿主上定殖［16］。通過(guò)PCR擴(kuò)增菌株R1B基因組DNA，我們發(fā)現(xiàn)菌株R1B基因組中可能存在桿菌抗霉素（Bacyllomicin）、伊枯草菌素（Iturin）、豐原素（Fengycin）合成的操縱子序列，菌株R1B可能產(chǎn)生2大類脂肽類抗菌物質(zhì)伊枯草菌素（Iturin）和豐原素（Fengycin）。

非核糖體合成的活性抗菌物質(zhì)除了脂肽類外還包括許多其他次生代謝產(chǎn)物，如抗菌二肽溶桿菌素（Bacilysin）結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，僅由2個(gè)氨基酸組成，其可以抑制真菌和細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，導(dǎo)致微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，從而使細(xì)胞溶解死亡，對(duì)細(xì)菌和真菌都具有廣譜抗菌活性［17］，因此在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用潛力。我們通過(guò)PCR探測(cè)到菌株R1B基因組中含有溶桿菌素合成的基因序列，R1B可能產(chǎn)生溶桿菌素發(fā)揮抗菌活性。

核糖體途徑合成的細(xì)菌素是一類具有抗菌生物活性的蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)［18］，枯草菌素（Subtilin）是迄今為止研究得比較清楚的細(xì)菌素之一。因其具有高效抗菌活性和無(wú)殘留毒副作用而被廣泛地應(yīng)用，并且細(xì)菌素?zé)o耐藥性，極有可能替代傳統(tǒng)抗生素應(yīng)用于生物醫(yī)藥和生物防治領(lǐng)域［19-20］。但是我們?cè)谟肞CR探測(cè)時(shí)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)R1B基因組中含有合成枯草菌素的基因簇，說(shuō)明R1B的抗菌活性可能是通過(guò)產(chǎn)生抗菌二肽溶桿菌素以及伊枯草菌素和豐原素發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

通過(guò)篩選不同植物來(lái)源的內(nèi)生菌發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于霍山石斛的菌株R1B具有顯著的抗菌活性，可以強(qiáng)烈抑制梨軟腐病菌匍枝根霉的生長(zhǎng)，對(duì)梨軟腐病具有良好的防治效果，具有開(kāi)發(fā)成生物農(nóng)藥的潛力。經(jīng)鑒定R1B與貝萊斯芽孢桿菌具有最近的親緣關(guān)系。通過(guò)PCR探測(cè)R1B基因組，結(jié)果表明R1B可能產(chǎn)生抗菌二肽溶桿菌素以及伊枯草菌素和豐原素，而該菌株的抑菌活性是僅取決于其中一種活性物質(zhì)，還是不同活性物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果，還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明。