機(jī)械損傷日本結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的初步分析

趙方東 曾會明

（北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京 100083）

日本結(jié)縷草抗逆性較強(qiáng)，在草坪方面應(yīng)用廣泛。在維持其草坪景觀以及運動場需求方面，草坪修剪能夠增強(qiáng)抗逆能力以及刺激基部分蘗，因此研究日本結(jié)縷草應(yīng)對機(jī)械損傷的自我修復(fù)和促進(jìn)芽分化的分子機(jī)制具有重要的借鑒意義。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，植物部分基因在應(yīng)答外界不同環(huán)境變化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面至關(guān)重要。相關(guān)研究指出，轉(zhuǎn)錄因子通常以家族形式出現(xiàn)，并直接或者間接地作用于目標(biāo)基因的順式作用元件上，正調(diào)控或負(fù)調(diào)控該基因的表達(dá)，從而應(yīng)答外界逆境脅迫。在機(jī)械損傷過程中，AP2/EREBP、NAC以及WRKY轉(zhuǎn)錄因子起重要作用［1-3］。植物在遭受干旱、冷害以及高鹽脅迫時，因細(xì)胞失水造成的機(jī)械損傷能夠引起AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)答，進(jìn)而調(diào)控抗逆基因［3-4］。對于NAC轉(zhuǎn)錄家族來說，NAC不僅能夠調(diào)節(jié)植株衰老以及營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運［2，5］，也能響應(yīng)干旱、高鹽、植物激素等誘導(dǎo)因子以及病害和組織損傷防御［6-7］。植物的WRKY是在植物中分布較為廣泛地一類轉(zhuǎn)錄因子，不僅響應(yīng)高溫、高鹽、冷害、機(jī)械損傷等非生物脅迫，也應(yīng)答病菌、蟲害等生物脅迫以及受到水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控［8-11］。但是對于日本結(jié)縷草應(yīng)對機(jī)械損傷的自我調(diào)控機(jī)制來說，相關(guān)的AP2/EREBP、NAC以及WRKY轉(zhuǎn)錄因子還未挖掘。

通過對不同脅迫時間的機(jī)械損傷轉(zhuǎn)錄組的分析，發(fā)現(xiàn)眾多轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)量較大，人工分析效率低且出錯率較高。通過使用Mapman工具的使用，可大大提高對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的便捷，且能夠?qū)ζ潋炞C。

本研究通過將轉(zhuǎn)錄組拼接得到的序列進(jìn)行比對，將其數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為Mapman識別的探針I(yè)D，篩選AP2/EREBP、NAC和WRKY這三類轉(zhuǎn)錄因子的差異基因（DEG），并與轉(zhuǎn)錄組注釋相結(jié)合，為研究日本結(jié)縷草應(yīng)答機(jī)械損傷脅迫的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。為處理組，T8-T7為T8與T7時差異基因表達(dá)量之差，T9-T7為T9與T7時差異基因表達(dá)量之差，T8-T7/T9-T7為兩組差異基因表達(dá)熱圖。

1 材料與方法

1.1 材料

Li等［12］對日本結(jié)縷草機(jī)械損傷脅迫0（T7）、2（T8）和6 h（T9）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

1.2 方法

將組裝好的序列轉(zhuǎn)換為Mapman識別的探針I(yè)D，將其載入Mapman中，Mapman對蛋白或代謝物注釋編號，稱之為BIN，在Mapman數(shù)據(jù)庫收錄的每一個蛋白序列或代謝物序列都有一個ID，篩選歸類為AP2/EREBP、NAC以及WRKY的差異基因以及拼接的長度，將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的Swiss-Prot與Nr數(shù)據(jù)庫中的注釋進(jìn)行匹配，并通過Mapman將T8和T9較于T7的表達(dá)量差異可視化，T7（機(jī)械損傷0 h）為對照，T8（機(jī)械損傷2 h）與T9（機(jī)械損傷6 h）

2 結(jié)果

2.1 AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的DEG信息分析

通過mapman對轉(zhuǎn)錄組獲得的序列進(jìn)行匹配（表1），AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子獲得DEGs差異基因13個，其組裝的序列長度為464-3 533 bp。在轉(zhuǎn)錄組Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫注釋到8個擬南芥物種基因，另外5個unigenes注釋為水稻。除此之外，Nr數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄因子主要集中于谷子這一類農(nóng)作物，其中有一個基因未能得到明確的注釋結(jié)果；只有一個未得到注釋蛋白匹配到水稻中。與T7相比，在T8和T9時，大部分AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子呈上調(diào)趨勢，只有注釋為RAP-2-11的差異基因c47151.graph_c0表現(xiàn)為下調(diào)。機(jī)械損傷后日本結(jié)縷草葉片產(chǎn)生的相關(guān)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子，在適應(yīng)機(jī)械損傷機(jī)制中起著重要的調(diào)節(jié)作用，能夠增強(qiáng)抵抗高鹽、干旱以及病害的能力。

2.2 NAC轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的DEG信息分析

通過篩選共獲得Bin編號27.3.27的NAC轉(zhuǎn)錄因子差異基因8個（表2），其組裝成的轉(zhuǎn)錄本長度最短為316 bp，最長為1 882 bp。在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中，差異基因主要注釋為擬南芥，另2個差異基因分別注釋為野生型小麥和水稻。對于Nr數(shù)據(jù)庫，有4個差異基因注釋為谷子，其次，有2個差異基因注釋為玉米，最后的差異基因分別注釋為竹子和節(jié)節(jié)麥中。與T7相比，在T8和T9時，有2個差異基因分別注釋為NAC029（c41262.graph_c1）和NAC021（c48761.graph_c1），呈先下調(diào)再上調(diào)的趨勢，注釋為JUB1基因功能的c50533.graph_c3全程表達(dá)受到抑制，其余差異基因都是明顯地上調(diào)。

2.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子DEG信息分析

在擬南芥中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子包括74個植物特異性響應(yīng)植物脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，主要在病害防御，機(jī)械損傷響應(yīng)以及衰老過程中起著重要作用［1］。在篩選出的差異基因WRKY轉(zhuǎn)錄因子中，其共分為三大類WRKY即Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，即注釋為WRKY33的c24983.graph_c0和抗病X-TIR-NBS-LRR-X即注釋為WRKY19的c52334.graph_c1屬于Ⅰ類，在Ⅱ類又分為子群，即注釋為WRKY6的c26662.graph_c0為Ⅱb，注釋為WRKY75的c42847.graph_c1為Ⅱc，注釋為WRKY22的c46458.graph_c1和注釋為WRKY35的c45978.graph_c0為Ⅱe，注釋為WRKY15的c45668.graph_c2，注釋為WRKY40的c41229.graph_c0和c51787.graph_c0為Ⅱd，以及注釋為WRKY46的c46760.graph_c0和注釋為WRKY55的c41147.graph_c1屬于Ⅲ類。其序列長度分布為470-2 349 bp，在Nr數(shù)據(jù)庫中，有5個基因注釋到谷子中，其次注釋到高粱的基因有4個，其余的2個基因分別注釋到水稻和二穗短柄草中。這一類基因的大多數(shù)都與對照相比表達(dá)量上升，僅只有一個注釋為WRKY46的c46760.graph_c0表達(dá)量明顯下降。

表1 AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的DEG信息分析

表2 NAC轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的DEG信息分析

3 討論

日本結(jié)縷草由于在非生物脅迫和生物脅迫中具有較強(qiáng)的抗逆性，管理粗放，廣泛應(yīng)用于園林景觀以及運動場之中。然而目前對日本結(jié)縷草經(jīng)常受到修剪后適應(yīng)生長的特性機(jī)制不太了解，因此我們分析機(jī)械損傷日本結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中受機(jī)械損傷誘導(dǎo)的相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子AP2/EREBP，NAC以及WRKY在這損傷過程中的作用。

AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子在應(yīng)對非生物脅迫過程中都特異性地識別并綁定5′-［AG］CCGAC-3′的DAN序列，結(jié)合DRE元件介導(dǎo)高鹽和脫水誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，并調(diào)節(jié)植物對ABA、病原、高鹽、低溫以及干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)［4］；在機(jī)械損傷日本結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組中，發(fā)現(xiàn)有5個DREB類轉(zhuǎn)錄因子注釋到水稻中，而注釋到擬南芥中的轉(zhuǎn)錄因子有4個ERF類、3個RAP類以及1個WRI類，除了RAP2-11轉(zhuǎn)錄因子與對照相比表現(xiàn)出明顯地下調(diào)，大部分AR2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子差異性表達(dá)上調(diào)，意味著機(jī)械損傷后提高對非生物和生物脅迫的反應(yīng)能力，增強(qiáng)抗逆性。

表3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的DEG信息分析

有關(guān)研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子不僅作用于植物的生長發(fā)育器官模式建成，也響應(yīng)非生物脅迫和生物脅迫的應(yīng)答［13-18］。NAC029一方面能夠促進(jìn)ABA的產(chǎn)生進(jìn)而造成葉綠素的降解使植物表現(xiàn)出衰老的表型［5，13］，與JUB1延緩葉片衰老的功能相反［18］，另一方面還能夠響應(yīng)高鹽、干旱脅迫以及ABA處理，并且負(fù)調(diào)控MdDREB2A、MdCBF1和MdCBF4在干旱、高鹽和低溫脅迫的響應(yīng)［16-17］。在本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，NAC029和JUB1基因的表達(dá)在T8時都表現(xiàn)出較于T7明顯地下調(diào)，僅有NAC029的表達(dá)在T9時較T7明顯地上調(diào)，意味著葉片損傷部位的衰老與NAC029和JUB1相關(guān)，并且快速響應(yīng)非生物脅迫，全程上調(diào)NAC068調(diào)控細(xì)胞程序性死亡以阻止病原體入侵［6］。對于得到注釋為野生型小麥的NAM-B1的c42054.graph_c0來說，其功能主要負(fù)責(zé)促進(jìn)葉片衰老以及將其營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)移到正在生長中的谷粒中［2］，c46509.graph_c0 和 c48761.graph_c1 共同注釋為NAC021（NAC1），其主要被生長素誘導(dǎo)以及介導(dǎo)生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制促進(jìn)側(cè)根的生長，并且該轉(zhuǎn)錄因子激活下游生長素響應(yīng)基因DBP和AIR3［19］，加上NAC090和NAC008在應(yīng)答外界脅迫時參與植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生［20-21］，這些基因在損傷的日本結(jié)縷草葉片中顯著地上調(diào)，說明這些NAC轉(zhuǎn)錄因子在葉片損傷部位傳遞信號至莖端分生組織并共同調(diào)控其生長。

大多數(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在病菌侵染時被快速誘導(dǎo)，進(jìn)而通過SA途徑介導(dǎo)的抗病相關(guān)基因PR1快速地進(jìn)行防御，是一種植物系統(tǒng)獲得抗性的表現(xiàn)，比如OsWRKY6直接綁定水楊酸合成關(guān)鍵酶OsICS1，促進(jìn)SA的產(chǎn)生，使其激活OsPR10a提高植株的抗病性，而且在病害部位提高轉(zhuǎn)錄因子水平造成細(xì)胞程序性死亡組織阻止病菌進(jìn)一步侵染［10，22］?；钚匝酰≧OS）的增多也能夠誘導(dǎo)PeWRKY6-1的表達(dá)，隨之與衰老相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（SAG12-1）的表達(dá)量增多，造成ROS量多的葉片部位葉片衰老［23］，是植物自我防御的反應(yīng)機(jī)制。然而WRKY6和WRKY33在持續(xù)的蟲害中通過提高JA水平來防御自身［24-25］。同 樣，WRKY22、WRKY46、WRKY47、WRKY53以及WRKY75通過SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制正調(diào)控防御相關(guān)基因PR1對細(xì)菌和真菌產(chǎn)生基本的抗性［26-29］；WRKY18、WRKY40和WRKY60相互作用也在病害防御方面起著重要作用，其中WRKY40與WRKY18相互拮抗，使得WRKY18在對P.syringae的抗性方面由于WRKY40的轉(zhuǎn)錄抑制使植物易感?。?0］。除此之外，WRKY46還能快速響應(yīng)干旱脅迫、鹽脅迫以及氧化脅迫，能夠調(diào)控參與細(xì)胞間的滲透保護(hù)劑的形成和氧化還原態(tài)穩(wěn)態(tài)的相關(guān)基因的表達(dá)［11］。對于機(jī)械損傷日本結(jié)縷草葉片來說，只有注釋為WRKY46功能的c46760.graph_c0出現(xiàn)明顯的下調(diào)，由于機(jī)械損傷為非生物脅迫，該基因的下調(diào)導(dǎo)致ROS的大量積累，發(fā)生氧爆現(xiàn)象，進(jìn)而誘導(dǎo)相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行自我防御，并且促進(jìn)損傷部位的衰老來隔離外界環(huán)境對損傷部位的感染，起到對病菌感染的預(yù)防作用。

4 結(jié)論

通過將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)載入至mapman中得到的注釋與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫注釋相同，與部分Nr數(shù)據(jù)庫注釋相同。AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子有13個差異基因，NAC轉(zhuǎn)錄因子有8個差異基因，WRKY轉(zhuǎn)錄因子有11個差異基因，這三類轉(zhuǎn)錄因子在機(jī)械損傷T8和T9時都出現(xiàn)與T7相比較大的表達(dá)量差異。日本結(jié)縷草在遭受機(jī)械損傷時AP2/EREBP和WRKY類轉(zhuǎn)錄因子能夠增強(qiáng)對非生物脅迫和生物脅迫的應(yīng)答能力，增強(qiáng)抗逆性，并且NAC類轉(zhuǎn)錄因子傳遞信號至莖端分生組織并調(diào)控其生長。