戊糖片球菌S44胞外多糖抗氧化活性分析

陳佩，黨輝，郭紅軍，翟彩寧

（1.陜西廣播電視大學(xué)益生菌功能及應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 西安 710119；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharides of lactic acid bacteria，LAB EPS）是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞外的一種糖類化合物，是乳酸菌在長進化過程中適應(yīng)環(huán)境的產(chǎn)物，是無毒的有機體，對人體健康有益[1]。LAB EPS 不僅可以保護菌體而且因其具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗炎以及抗氧化等作用[2-4]，在諸如化妝品、制藥、食品等生物技術(shù)方面得以應(yīng)用。

生命體中源源不斷地產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），包括羥自由基，超氧陰離子自由基和過氧化氫等非自由基。它們在體內(nèi)可產(chǎn)生一種負面作用，即氧化應(yīng)激[5]。氧化應(yīng)激會導(dǎo)致機體的各種組織和器官的功能逐漸下降，加速機體衰老和死亡，因此老化的速度可通過氧化損傷的衰減被延遲[6]。依據(jù)自由基老化理論，可以利用抗氧化劑中斷產(chǎn)生活性氧的反應(yīng)[7]，但是長期使用抗氧化劑會給機體帶來一系列的副作用，如高血糖、高血壓和癌癥等。因此尋找開發(fā)更安全有效的天然抗氧化劑是非常必要的[8]。越來越多的報道表明乳酸菌的胞外多糖具有抗氧化活性，乳酸菌胞外多糖抗氧化研究正逐步興起。

研究所選用的菌株戊糖片球菌S44，是本實驗室從陜南泡菜中篩選出的一株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌[9]，研究主要評價了戊糖片球菌S44 胞外多糖的體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

戊糖片球菌S44：分離自陜南地區(qū)農(nóng)戶自制泡菜；人肝癌細胞系HepG2 細胞株：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基、雙抗（青、鏈霉素）、0.25%胰酶、胎牛血清、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸：美國Gibico 公司；乳酸細菌液體培養(yǎng)基（De Man，Rogosa and Sharpe，MRS）：青島海博生物技術(shù)有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國 sigma 公司；過氧化氫、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、1，10-鄰菲羅啉均為分析純：中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。

恒溫培養(yǎng)箱（DHP9012）：上海一恒科技有限公司；CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher HERAcell150i cell）：美國Thermo 公司；超凈臺（SW-CJ-1CV）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；冷凍離心機（5415R）：德國Eppendorf 公司；紫外可見分光光度計（UV-2100）：尤尼科上海有限公司；透析袋（MD16，截留分子量為8 000 D～14 000 D）：北京索萊寶科技有限公司；倒置顯微鏡（CX41-12C02）：日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 戊糖片球菌S44 的制備

將凍存于-80 ℃的戊糖片球菌S44 接入MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)活化3 代后用于后續(xù)試驗。

1.2.2 胞外多糖的制備

將菌種接至200 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h 后將發(fā)酵液在 4 ℃，10 000×g 離心 20 min，棄沉淀；上清液中加入配制好的三氯乙酸（體積分數(shù)為80%）至終濃度（三氯乙酸體積分數(shù)）為4%，4℃下靜置過夜；再于 4 ℃，10 000×g 離心 20 min，棄沉淀。上清液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃濃縮至原體積的1/3，加入4 倍95%的乙醇于4 ℃靜置過夜，同上條件下離心20 min 后取沉淀溶于雙蒸水（double distilled water，ddH2O）中，并用ddH2O 透析3 d，每8 h 換水，收集透析液后真空冷凍干燥，得到戊糖片球菌胞外多糖。

1.2.3 總糖量的測定

參照文獻[10]的方法有所改動。將冷凍干燥后的戊糖片球菌胞外多糖用ddH2O 溶解，利用苯酚-硫酸法測定胞外多糖產(chǎn)量。以葡萄糖為標準品制作標準曲線，得到回歸方程，并通過回歸方程計算戊糖片球菌的胞外多糖產(chǎn)量。

1.2.4 多糖溶液的制備

根據(jù)以上結(jié)果，配制1 mg/mL 的多糖母液，梯度稀釋，最終濃度為 0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 備用。

1.2.5 胞外多糖清除DPPH 自由基能力的測定

參考文獻[11]的方法稍有修改。反應(yīng)體系中加入1 mL 樣品溶液，再加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH 的無水乙醇，震蕩充分混勻，室溫下（25 ℃）避光靜置反應(yīng)30 min，測定 517 nm 波長處的樣品吸光度（OD 值）為A樣；用等體積的ddH2O 代替樣品溶液作為對照組A對，并以無水乙醇作為空白測定其吸光值為A空，以VC為陽性對照。計算DPPH 自由基清除率如下：

1.2.6 胞外多糖清除羥自由基能力的測定

參照文獻[12]的方法稍有修改。1 mL 2.5 mmol/L 的1，10-鄰菲羅啉，1 mL pH 7.4 的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）和1 mL 水充分混勻后，再加入1 mL 2.5 mmol/L 的硫酸亞鐵，充分混勻后，加入1 mL 20 mmol/L 的過氧化氫，37 ℃中水浴1.5 h，在536 nm 處測定其OD 值為A空。把1 mL 水替換為1 mL 樣品液記為A樣，將1 mL 的過氧化氫替換為1 mL的水記為A對，以VC為陽性對照。按照如下公式計算多糖清除羥自由基的能力：

1.2.7 胞外多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

參照文獻[13]的方法稍有修改。分別加入濃度為0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的樣品溶液 1 mL，測定其在320 nm 處的吸光值，以VC為陽性對照。按照如下公式計算多糖對超氧陰離子自由基的清除作用：

式中：A樣為加入樣品和鄰苯三酚的吸光度；A對為加入樣品，但不加鄰苯三酚的吸光度；A空為不加樣品，但加入鄰苯三酚的吸光度。

1.2.8 胞外多糖還原能力的測定

參考文獻[14]的方法稍有修改。0.5 mL 不同濃度的樣品中加入1 %鐵氰化鉀0.5 mL，0.5 mL PBS（pH 6.6），震蕩充分混勻，于50 ℃中水浴20 min，在冰浴中急速冷卻后，加入0.5 mL 10%的三氯乙酸，3 000 r/min離心10 min，取其1 mL 上清后加入1 mL 0.1%的FeCl3，反應(yīng)10 min 后在700 nm 波長下測定樣品的OD 值，以VC為陽性對照。A700nm值越大，代表還原能力越強。

1.2.9 胞外多糖對HepG2 細胞抗氧化能力的影響

細胞培養(yǎng)：將HepG2 細胞按常規(guī)方法復(fù)蘇后，置于含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺和1 %雙抗的低糖DMEM 培養(yǎng)液中，37 ℃，5 %CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，隔天更換一次培養(yǎng)液，待細胞貼壁融合率達80%左右時，用含0.02%EDTA 的0.25%胰酶消化細胞，按1∶3 傳代。取對數(shù)生長期細胞進行試驗。

HepG2 細胞氧化損傷模型的建立：參照文獻[15]的方法有所改動，將對數(shù)生長期中的HepG2 細胞按照2×105個/mL 接種到 96 孔板中，每孔 100 μL，37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，加入含過氧化氫終濃度分別為0.10 mmol/L 的DMEM 培養(yǎng)液，作用2 h，棄上清，以噻唑藍比色法檢測細胞活力并以此建立氧化損傷模型。

胞外多糖對HepG2 細胞抗氧化功能的影響測定：參照文獻[16]的方法有所改動，用0.25%的胰蛋白酶消化收集生長處于對數(shù)生長期的HepG2 細胞，以2×105個/mL 的細胞密度接種于6 孔培養(yǎng)板，每孔2 mL培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2，培養(yǎng) 24 h 后，分組處理：空白對照組，加入2 mL DMEM 完全培養(yǎng)液；模型組，加入含過氧化氫的DMEM 培養(yǎng)液；樣品組，同時加入含過氧化氫的DMEM 培養(yǎng)液和不同濃度的胞外多糖樣品溶液。培養(yǎng)24 h 后，除去培養(yǎng)上清，每孔用PBS 洗滌3 次，然后每孔加1 mL 1%的Triton X-100，用吸管充分吹勻，2 000 r/min 離心15 min，收集上清即為細胞裂解液，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

指標測定：測定方法參照MDA、SOD 和T-AOC 測定試劑盒說明書進行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 16.0 進行One－Way ANOVA，Tukey＇s 多重檢驗（P＜0.05），數(shù)值以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖量測定

胞外多糖的含量采用苯酚-硫酸法測定，以葡萄糖為標準品得到回歸為y=0.068 1x-0.002，R2=0.999 6，曲線擬合良好，戊糖片球菌S44 胞外多糖產(chǎn)量為（190.75±6.24）mg/L。

2.2 胞外多糖清除DPPH自由基的能力

DPPH 是一種人工合成的穩(wěn)定的自由基，其在517 nm 處具有較強的吸收峰，測定方法簡單，反應(yīng)時間較短。雖然DPPH 并不是人體實際能夠生成的一種自由基，但對DPPH 自由基的清除率在一定程度上仍然可以有效的評價抗氧化劑的抗氧化活性。因此測定DPPH 自由基的清除能力是測定抗氧化性的重要方法[17]。戊糖片球菌S44 胞外多糖對DPPH 自由基的清除能力見表1。

表1 胞外多糖清除DPPH自由基的能力Table 1 Scavenging activity of EPS against DPPH radical

表1結(jié)果表明戊糖片球菌S44 胞外多糖對DPPH自由基的清除能力與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，隨著胞外多糖濃度的增加，DPPH 自由基的清除率也逐漸增大。當胞外多糖的濃度為0.5 mg/mL 時，其DPPH 自由基的清除率比濃度為0.2 mg/mL時顯著增加了85.85 %（P＜0.05）。與同濃度的VC相比，胞外多糖對DPPH 自由基的清除率均小于VC。楊晨璐等[3]研究表明植物乳桿菌的胞外多糖表現(xiàn)出較高的DPPH 自由基清除能力，清除率可達90%以上。張玲秀等[18]從家蠅體內(nèi)篩選出兩株高產(chǎn)胞外多糖的芽孢桿菌，其所產(chǎn)胞外多糖對DPPH 自由基具有顯著的清除作用，清除率達到20%以上。由此推斷，可能是菌株的特異性影響了其所產(chǎn)胞外多糖對DPPH 自由基的清除能力。

2.3 胞外多糖清除羥自由基的能力

羥自由基是活性氧自由基的一種，它具有最強的反應(yīng)活性，是僅次于氟的一種非選擇性氧化劑。能誘導(dǎo)核酸、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸等生物大分子發(fā)生嚴重損傷。羥自由基清除劑的加入可以有效降低或緩解這些有害效應(yīng)，因此清除羥自由是抗氧化中很重要的一個指標[19]。鄰二氮菲-Fe2+是一種氧化還原指示劑，F(xiàn)e2+與過氧化氫反應(yīng)后產(chǎn)生羥自由基，其具有很強的氧化能力。鄰二氮菲-Fe2+被羥自由基氧化后生成鄰二氮菲-Fe3+，導(dǎo)致其在536 nm 波長處的最大吸收值減少。加入抗氧化劑之后，因羥自由基的濃度減少，所以體系中的吸光值隨之升高[20]。因此羥自由基的變化量可以根據(jù)加入樣品前后吸光值的大小變化來評價，以此來判定胞外多糖清除羥自由基的能力。戊糖片球菌S44 胞外多糖對羥自由基的清除能力見表2。

表2 胞外多糖清除羥自由基的能力Table 2 Scavenging activity of EPS against hydroxyl radical

隨著胞外多糖的濃度增加，對羥自由基的清除率呈上升趨勢，并且具有明顯的劑量依賴關(guān)系。同濃度胞外多糖對羥自由基的清除率均高于VC的清除率，當樣品濃度為0.5 mg/mL 時，胞外多糖對羥自由基的清除率可達80.14%。顏炳祥等[21]通過對乳酸乳球菌亞種的胞外多糖進行硒化，顯著增強了胞外多糖對羥自由基的清除能力，使其對羥自由基的清除能力提高了34.99%，并且抑制羥自由基的能力與濃度呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。故戊糖片球菌S44 胞外多糖在清除羥自由基方面也具有一定的提升空間。

2.4 胞外多糖清除超氧陰離子自由基的能力

超氧陰離子自由基是人體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基，能引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，加快機體的衰老過程，并可誘發(fā)一系列病變，嚴重危害人體健康。利用鄰苯三酚在堿性條件下能迅速氧化并釋放超氧陰離子自由基，生成有色中間產(chǎn)物的特性進行超氧陰離子自由基清除的活性檢測。胞外多糖清除超氧陰離子自由基活性的結(jié)果如表3所示。

表3 胞外多糖清除超氧陰離子自由基的能力Table 3 Scavenging activity of EPS against superoxide anion free radical

從表3中可看出，隨著胞外多糖濃度的升高，其清除超氧陰離子自由基的能力也隨之增加，濃度與清除率呈正相關(guān)。與同濃度的VC相比，胞外多糖對超氧陰離子自由基的清除率均小于VC。紀鵑[22]從新疆酸奶中篩選到一株瑞士乳桿菌，其所產(chǎn)胞外多糖對超氧自由基的清除活性與其濃度呈劑量依賴性，此結(jié)果與我們的研究結(jié)果一致。

2.5 胞外多糖的還原能力

還原力是測定抗氧化能力的另一個重要指標，具有還原力的物質(zhì)是通過提供氫原子來中斷過氧化物的形成，破壞自由基反應(yīng)鏈，以防止氧化反應(yīng)[19]。還原能力是以普魯士藍的生成量為指標，由赤血鹽（鐵氰化鉀）還原生成黃血鹽，再與Fe3+作用后生成普魯士藍，在700 nm 波長處測定其吸光值大小判定還原能力。胞外多糖的還原能力見表4。

表4 胞外多糖的還原能力Table 4 The reducing ability of EPS

從表4中可看出，樣品的濃度與其還原能力有著劑量依賴關(guān)系，即還原力隨著濃度的提高而增強。當濃度為0.5 mg/mL 時，胞外多糖的還原能力比濃度為0.2 mg/mL 時提高了88.57%。與同濃度的VC相比，胞外多糖的還原能力均小于VC，濃度為0.5 mg/mL 時，VC的還原力是胞外多糖的2.85 倍。

2.6 胞外多糖對HepG2細胞抗氧化功能的影響

T-AOC 是一個全面反映機體抗氧化能力的指標，涵蓋了兩種作用體系的綜合結(jié)果，可以直觀地表征細胞抵御氧化損傷的能力。SOD 是一種重要的抗氧化酶，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，其活性高低可間接反映組織自由基的含量和細胞受損程度[23]。MDA 含量是細胞氧化損傷的一個重要檢測指標，可通過測定MDA 的含量，了解機體內(nèi)膜脂質(zhì)過氧化的程度。胞外多糖對HepG2 細胞抗氧化活性的影響見表5。

表5 胞外多糖對HepG2細胞抗氧化活性的影響Table 5 The effects of EPS on antioxidant activities in HepG2 cells

續(xù)表5 胞外多糖對HepG2細胞抗氧化活性的影響Continue table 5 The effects of EPS on antioxidant activities in HepG2 cells

表5可看出，與對照組相比，模型組的T-AOC 和SOD 的活力分別顯著降低了57.70 %和20.83 %（P＜0.05），MDA 的含量顯著增加了 48.48%（P＜0.05），此結(jié)果表明，經(jīng)過過氧化氫誘導(dǎo)的HepG2 細胞氧化損傷明顯。與模型組相比，加入不同濃度的胞外多糖后，細胞中T-AOC 的活力顯著提高，且隨著濃度的增加，活力也隨之增大。當胞外多糖濃度為0.3 mg/mL 時，細胞中 T-AOC 的活力恢復(fù)至（4.33±0.06）U/mL，與對照組相比已無顯著性差異（P＞0.05）。當胞外多糖濃度為0.4 mg/mL 時，細胞中SOD 的活力比模型組顯著升高30.92%（P＜0.05），并與對照組無顯著差異。與模型組相比，加入不同濃度的胞外多糖后，細胞中MDA 的含量顯著降低。當胞外多糖濃度為0.5 mg/mL 時，細胞中MDA 的含量與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。Zhang 等[24]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌C88 的胞外多糖可以抑制過氧化氫誘導(dǎo)的Caco-2 細胞中MDA 的形成，同時提高了SOD 和T-AOC 的活力，此與本研究結(jié)果一致。戊糖片球菌S44 胞外多糖能夠緩解HepG2 細胞的氧化損傷，推測其可能是胞外多糖增強了細胞中酶和非酶系統(tǒng)的抗氧化活性，減少了脂質(zhì)過氧化。

3 結(jié)論

對戊糖片球菌S44 的胞外多糖在體外的抗氧化能力進行了研究，測定了其胞外多糖對DPPH 自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力，及其還原能力的大小。同時，評價了胞外多糖對由過氧化氫誘導(dǎo)的HepG2 細胞的氧化損傷的保護作用。結(jié)果表明，胞外多糖對DPPH 自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基均有較好的清除能力，對羥自由基的清除率可達80%以上。并且，胞外多糖能夠緩解由過氧化氫誘導(dǎo)的HepG2 細胞的氧化損傷，提高了細胞中SOD 和TAOC 的活力，抑制了MDA 的形成。因此，戊糖片球菌S44 可作為潛在的抗氧化性能的食品添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)生產(chǎn)中。