馬乳酒樣乳桿菌（XL10）的分離、鑒定及對(duì)小鼠腸道菌群的影響

賈慶喜，邢竹青，2，孫也，王艷萍，*

（1．天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2．天津中醫(yī)藥大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300193）

開菲爾是一種由開菲爾粒發(fā)酵牛奶得到的一種傳統(tǒng)飲品，被認(rèn)為具有多種益生和食品加工特性，如促進(jìn)人體免疫調(diào)節(jié)能力、抵御疾病等。開菲爾粒[1]存在于自然界中，可用于發(fā)酵開菲爾的傳統(tǒng)發(fā)酵劑，是由一系列黏附在多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物上的乳酸菌、酵母菌和部分醋酸菌所組成的復(fù)合微生物共生粒狀復(fù)合物所構(gòu)成，能賦予開菲爾發(fā)酵乳所特有的口感、風(fēng)味以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。開菲爾粒的菌相非常的復(fù)雜且具有相互依賴，雖然很多研究人員致力于開菲爾粒的微生物菌相分析，但始終沒有得到全面的闡明[2-3]。

馬乳酒樣乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）是從開菲爾粒（Kefir）中微生物菌相構(gòu)成之一，它具有良好的發(fā)酵特性、維持腸道菌群平衡、改善腸道蠕動(dòng)及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的功能[4-7]。本研究以西藏開菲爾粒為原料，篩選出一株馬乳酒樣乳桿菌XL10，對(duì)其進(jìn)行生長(zhǎng)特性和生物學(xué)特性研究，監(jiān)測(cè)對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，為開菲爾粒菌相的闡明提供理論依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

西藏開菲爾粒：市售；細(xì)菌基因組提取試劑盒、康為土壤DNA 提取試劑盒：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他所有試劑均為分析純。Balb/c 雄性小鼠，體重（33±3.1）g，購自長(zhǎng)春軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中心。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR 儀（5333 型）：德國(guó) Eppendorf 公司；PCR 儀（S1000d）、熒光定量?jī)x（CFX96 TouchO）：美國(guó)BIORAD 公司；水平電泳槽（DL-31DN）：北京東林昌盛生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)儀（Multiskan GO）：美國(guó)Thermo公司；流式細(xì)胞儀（BD Accuri C6）：美國(guó) BD 公司；倒置熒光顯微鏡（Nikon Ti）：日本 Nikon。

1.3 培養(yǎng)基

乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（mann rogosa and sharpe broth，MRS）：牛肉膏 10.0 g，酵母膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，無水乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳 0.05 g，檸檬酸銨 2.0 g，吐溫 80 1.0 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL，1 mol/L NaOH 或者1 mol/L HCl 調(diào)節(jié) pH 值至 6.2～6.4，115 ℃滅菌 15 min。固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉。

尿素鎂磷酸鹽（phosphate-urea-magnesium，PUM）緩沖液 （pH 7.1）：稱取 22.2 g K2HPO4·3H2O，7.26 g KH2PO4，1.8 g 尿素，0.2 g MgSO4·7H2O，蒸餾水定容至1 000 mL。121 ℃滅菌 20 min，4 ℃保存。

磷酸緩沖鹽（phosphate buffer saline，PBS）緩沖液（pH 7.4）：稱取 8 g NaCl，0.2 g KCl，3.63 g Na2HPO4·12H2O，0.24 g KH2PO4，溶于 900 mL 蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至7.4，加水定容至1 L。121 ℃滅菌20 min，4 ℃保存。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株活化和分離

取少量開菲爾粒，放入無菌研缽中加入1.5 mL 滅菌生理鹽水中充分研磨，吸取勻漿1 mL 注入9 mL 滅菌生理鹽水中，10 倍度稀釋，分別涂布MRS 平板，在30 ℃厭氧條件下恒溫培養(yǎng)24 h～72 h，用無菌槍頭分別挑取外形顏色不同的單菌落逐一在單個(gè)MRS 平板上劃線純化，挑取單一菌落接種于MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，進(jìn)行革蘭氏染色后顯微鏡觀察和接觸酶試驗(yàn)，菌株均保藏在MRS 液體培養(yǎng)基中，添加終濃度為25%的甘油為保護(hù)劑，-80 ℃凍存。

2.2 菌株培養(yǎng)

馬乳酒樣乳桿菌（Lb.kefiranofaciens XL10）充分活化，按4%接種量，接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃厭氧培養(yǎng)。

2.3 分離菌株16s rDNA鑒定

設(shè)計(jì)引物27F：GAGTTTGATCCTGGCTCAG 和1492R：TACCGCGGCTGCTGGCAC，以試劑盒提取的細(xì)菌全基因組為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析并進(jìn)行序列測(cè)定，NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列相似性比對(duì)，并將所得序列結(jié)果上傳至NCBI Genbank 數(shù)據(jù)庫中得到唯一的序列編號(hào)。

2.4 XL10生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將分離所得到的菌株接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行30 ℃厭氧培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間測(cè)定一次在600 nm波長(zhǎng)處吸光度值，以此數(shù)據(jù)繪制出該菌株的MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃厭氧培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線。

2.5 細(xì)胞表面疏水性測(cè)定

細(xì)胞疏水性試驗(yàn)依據(jù)Rosenberg 等[8]方法進(jìn)行。將在MRS 中培養(yǎng)18 h 的菌體細(xì)胞（待測(cè)菌株：XL10；對(duì)照菌株：ZW3 和 CGMCC1.2161），1 000 g 離心 5 min，去上清，用PUM 緩沖液清洗兩次菌體，用PUM 緩沖溶液重懸菌體細(xì)胞，至三者起始濃度一致（2×108CFU/mL），測(cè)定此時(shí)OD600值即為Abs 前。3 mL 的重懸液與1 mL 的二甲苯在漩渦振蕩器上充分混勻，在30 ℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，然后再次短暫漩渦振蕩，30 ℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，進(jìn)行不同相的分離。吸取水相，在600 nm 處測(cè)定吸光度值，即為Abs 后。

細(xì)胞表面疏水性/%=（G1-G2）/G1×100

式中：G1為 Abs 前；G2為 Abs 后。

2.6 細(xì)胞凝聚性測(cè)定

收集MRS 中培養(yǎng)18 h 的新鮮菌體細(xì)胞（待測(cè)菌株：XL10；對(duì)照菌株：ZW3 和 CGMCC1.2161），移去發(fā)酵上清液待用。用PBS 緩沖液清洗兩遍菌體，用PBS重懸菌體使三者起始濃度一致（2×108CFU/mL），測(cè)定OD600值，即為Abs 前。然后，將上述菌液在1 000 g 的條件下離心5 min，去上清，菌體沉淀用等體積相應(yīng)的發(fā)酵上清重懸，混勻后，在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置2 h。以培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，測(cè)定上層液在600 nm 處的吸光度值，即為Abs 后。

細(xì)胞凝聚性/%=（G1-G2）/G1×100

式中：G1為 Abs 前；G2為 Abs 后。

2.7 小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)

為了研究XL10 對(duì)于小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，選用SPF 級(jí)12 周齡的成年Balb/c 小鼠作為研究對(duì)象，所有小鼠均身體健康，正常攝食，皮毛光滑，適應(yīng)4周后，將Balb/c 小鼠連續(xù)灌胃0.4 mL XL10 菌懸液（108CFU/mL）14 d，并且在第0天、第7天、第14天和第21天采用腹部按摩法收集小鼠0.5 g～0.8 g 糞便，進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)的分析。

2.8 馬乳酒樣乳桿菌XL10對(duì)于小鼠腸道菌群的影響

選擇皮毛光澤、行為正常、食欲良好、糞便成型度明顯改善的實(shí)驗(yàn)小鼠，利用基因組提取試劑盒分別提取各時(shí)間點(diǎn)樣品基因組DNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組條帶較亮并無拖尾現(xiàn)象的DNA 樣品交由蘇州金唯智生物科技有限公司，進(jìn)行宏基因組16s 測(cè)序。

3 結(jié)果與討論

3.1 菌株的分離、純化與鑒定

3.1.1 菌株的分離與純化

經(jīng)2.1 方法分離純化，初步篩選選到12 株菌株，通過觀察菌落形態(tài)、革蘭氏染色顯微鏡個(gè)體形態(tài)（圖略）以及接觸酶試驗(yàn)，結(jié)果如表1和圖1所示。

表1 菌株的分離情況Table 1 Isolation of strains

根據(jù)馬乳酒樣乳桿菌的個(gè)體形態(tài)及菌落形態(tài)特征，挑選出一株疑似馬乳酒樣乳桿菌菌株，進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)，定名為XL10。

圖1 XL10的顯微鏡照片及在MRS平板上菌落形態(tài)Fig.1 The microscope pictures of XL10（A）and the colony morphology on MRS plate（B）

3.1.2 菌株的鑒定

通過對(duì)初篩的菌株進(jìn)一步復(fù)篩，得到XL10 菌株菌落形態(tài)如圖1A 所示，菌落較小，圓形，微突起，顏色白色，半透明，表面濕潤(rùn)光滑。菌體個(gè)體形態(tài)如圖1B所示，菌體特征為長(zhǎng)桿狀，菌體相互纏繞成菌團(tuán)，也有單個(gè)分散排列，菌體大小一般為 0.5 μm×10 μm，不產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶陰性、不運(yùn)動(dòng)的桿菌。從掃描電鏡結(jié)果（見圖2A）可以看出XL10 菌株表面分泌了多糖，用箭頭標(biāo)出。

圖2 馬乳酒樣乳桿菌XL10掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy of Lactobacillus kefiranofaciens XL10.（A）and（B）at 5000×

XL10 菌株16srDNA 進(jìn)行測(cè)序，核苷酸序列為1 449 bp，NCBI 中（GenBank 的檢索號(hào)為 KM086721.1）Blast 分析結(jié)果顯示：菌株XL10 同源性最高的是Lactobacillus kefiranofaciens JCM6985（GenBank accession number：LC071845.1），同源性為 100%。Goodfellow 和O′Donnell[9]認(rèn)為 DNA 的 G+C mol%差異≤10%～12%及16S rRNA 的序列同源性≥95 %的種可歸為一個(gè)屬，并且 Embley 和 Stackebrangdt 認(rèn)為當(dāng) 16S rRNA 的序列同源性≥97%時(shí)可以認(rèn)為是一個(gè)種。由此可以推斷：菌株XL10，與Lactobacillus kefiranofaciens JCM6985屬于同一個(gè)種。因此，菌株XL10 鑒定為馬乳酒樣乳桿菌。

3.2 XL10的特性研究

3.2.1 XL10 的生長(zhǎng)特性

為了研究XL10 生長(zhǎng)特性，按照方法2.4 進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，測(cè)定了在120 h 內(nèi)XL10 的生長(zhǎng)情況，以O(shè)D600值為指標(biāo)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 馬乳酒樣乳桿菌XL10生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve for Lactobacillus kefiranofaciens XL10

由圖3可以得知，XL10 在厭氧條件下，30 ℃培養(yǎng)72 h 時(shí)生長(zhǎng)最為良好。在0～24 h 內(nèi)OD600值增長(zhǎng)緩慢，處于延滯期；24 h～72 h 內(nèi)OD600值增長(zhǎng)速度增快，菌體生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期；在72 h 之后，OD600值增長(zhǎng)緩慢，曲線也趨于平緩，說明此時(shí)菌體繁殖幾乎停滯，達(dá)到了平穩(wěn)期。

3.2.2 菌株表面疏水性和自凝集性試驗(yàn)結(jié)果

菌株表面疏水性和自凝集性試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 菌株表面疏水性和自凝集性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Cell surface hydrophobicity and aggregation of strains

如表2所示，相比另一株馬乳酒樣乳桿菌ZW3 和保加利亞乳桿菌CGMCC1.2161，XL10 表現(xiàn)出了更好的細(xì)胞表面疏水性（79.9%）和自凝集能力（27.8%），說明其可能具有較好的粘附性。而研究表明表面疏水性和自凝集性與菌株是否能成功留存在腸道中具有相關(guān)性[10]。

3.3 XL10對(duì)于小鼠腸道菌群的影響

3.3.1 灌胃后腸道中菌群門水平的結(jié)構(gòu)變化

小鼠腸道中菌群門水平的結(jié)構(gòu)變化如圖4所示。

圖4 小鼠腸道中菌群門水平的結(jié)構(gòu)變化Fig.4 Structural changes in the bacterial phyla of mice

圖4A顯示樣本中細(xì)菌界常見的6個(gè)菌門豐度分布，其中豐度最高的是擬桿菌門（Bacteroidetes），占53 %，其次為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、Candidate_division_TM7 各占 41%、1.59%、1.32%、1.3%，其他菌門總體豐度在1%以下。

圖4B所示，樣本中細(xì)菌門水平上豐度前20個(gè)的分布情況，4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的腸道菌群結(jié)構(gòu)都有明顯的差異，其中擬桿菌門與厚壁菌門為主要的優(yōu)勢(shì)菌群，在連續(xù)灌胃第7天時(shí)厚壁菌門/擬桿菌的比例明顯增多，第14天、第21天與第0天相比，厚壁菌門/擬桿菌的比例也偏高。有些研究表明厚壁菌門/擬桿菌的比例與肥胖有關(guān)[11-12]，在肥胖人群腸道中厚壁菌門/擬桿菌的比例明顯比正常體重人群偏高。但也有些研究顯示并沒有發(fā)現(xiàn)相同的關(guān)聯(lián)性[13]。本實(shí)驗(yàn)中所用小鼠也未出現(xiàn)體重增加現(xiàn)象。其中隨著灌胃時(shí)間的延長(zhǎng)，放線菌門豐度明顯增多，由第0天的0.97%到第21天達(dá)到3.29%。

3.3.2 灌胃后腸道中菌群科水平的結(jié)構(gòu)變化

為了確定小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，比較了不同時(shí)間段中優(yōu)勢(shì)菌科的相對(duì)豐度，如圖5所示。

圖5 所占比例最多的前20個(gè)菌科Fig.5 The top 20 bacterial family with the largest proportion

如圖5所示，S24-7、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）是主要的優(yōu)勢(shì)菌群，其中瘤胃菌科及毛螺菌科是腸道中最為豐富的兩類厚壁菌科，可以分解宿主本身不能消化的纖維素和半纖維素，為短鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)化提供底物[14]。毛螺菌科中的很多菌可以產(chǎn)生有益腸道的丁酸，瘤胃菌科的一些菌可以降低克羅恩氏病的發(fā)生。在灌胃7 d 時(shí)兩者所占的比例明顯增多，但在14 d 時(shí)都有明顯降低，而氣球菌科（Aerococcaceae）明顯增多。據(jù)研究表明，理研氏菌（Rikenellaceae）在腸道中的數(shù)量增多往往是由于肥胖及腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展[15-16]，與生物鐘紊亂也有關(guān)聯(lián)[12]。與0 d 相比，實(shí)驗(yàn)中7 d 和21 d 時(shí)小鼠糞便中的理研氏菌有所降低，降低了罹患腸道炎癥的風(fēng)險(xiǎn)。雙歧桿菌科被認(rèn)為是具有益生功能的一類菌[17]，在0 d 時(shí)小鼠腸道中并沒有檢出，但灌胃時(shí)間增加，其豐度開始增加，在14 d 達(dá)到相對(duì)豐度最高（0.59%）。

3.3.3 灌胃后腸道中菌群屬水平的結(jié)構(gòu)變化

為了確定小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，我們比較了不同時(shí)間段中菌屬的種類變化，如圖6所示。

由圖6顯示，4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的樣本共同所具有的菌屬共有105類，主要集中為擬桿菌門（16類）、厚壁菌門（51類）和變形菌門（17類）等小鼠腸道中的核心菌群，其中在第0天腸道中獨(dú)有的菌屬最為豐富，主要集中為放線菌門（13類）和變形菌門（42類），而變形菌門通常被認(rèn)為包括多種病原菌，如大腸桿菌，沙門氏菌，弧菌等。在0 d 腸道中發(fā)現(xiàn)含有變形菌門中的巴斯德科（Pasteurella），其包括多種病原菌，例如鼠疫桿菌，可寄生于脊椎動(dòng)物，引發(fā)體內(nèi)出血[18]。在第7天的糞便樣品中發(fā)現(xiàn)了丁酸弧菌屬，它可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，抑制腸炎發(fā)生，屬于腸道有益菌[19-20]。在14 d 也發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生丁酸鹽的假丁酸弧菌屬（Pseudobutyrivibrio）。在停止灌胃7 d 后腸道中特有的菌屬主要集中在變形菌門，約占總數(shù)的37%。由此可以看出，經(jīng)過連續(xù)灌胃14 d 后，小鼠腸道中的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，主要體現(xiàn)為變形菌門的種類下降，代謝產(chǎn)生丁酸鹽的菌屬出現(xiàn)，在停止灌胃后，變形菌門的種類又有增多。

圖6 灌胃XL10后小鼠腸道菌群在屬水平上變化的維恩圖Fig.6 Venn diagram showing the shift in the structural modulation of the gut microbiota at the genus level after XL10 oral intubation

4 結(jié)論

本文從開菲爾粒中分離得到一株乳酸菌，經(jīng)過生理生化和16srDNA 鑒定該菌株為馬乳酒樣乳桿菌，命名為XL10；小鼠灌胃XL10 后菌群結(jié)構(gòu)變化結(jié)果顯示：變形菌門的種類下降，代謝產(chǎn)生丁酸鹽的菌屬（丁酸弧菌屬和假丁酸弧菌屬）出現(xiàn)，隨著灌胃時(shí)間的延長(zhǎng)雙歧桿菌增多，在14 d 達(dá)到相對(duì)豐度最高（0.59%），而致病性理研菌科有所降低，說明馬乳酒樣乳桿菌XL10 菌株可以一定程度上促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng)，抑制有害菌繁殖，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的潛力，本研究結(jié)果為今后馬乳酒樣乳桿菌XL10 的進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)理和功能奠定了基礎(chǔ)。