Box-Behnken試驗設計優(yōu)化內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮多糖工藝

汪建紅

（1.內(nèi)江師范學院化學化工學院，四川 內(nèi)江 641110；2.四川省高等學校果類廢棄物資源化重點實驗室，四川 內(nèi)江 641110）

荸薺是一種較為常見的香甜可口、美味多汁、營養(yǎng)豐富的水果，我國的種植面積達到5 萬hm2以上，年產(chǎn)鮮果百萬t 以上，按照總荸薺質量的26%計算荸薺果皮質量，每年可產(chǎn)生26 萬t 以上的荸薺皮[1-7]。這些荸薺皮往往得不到充分利用，造成巨大的浪費。荸薺皮營養(yǎng)豐富，富含多種功能成分，比如多糖、黃酮等[8-9]。多糖具有消炎、抗腫瘤等多種生物活性，提取荸薺皮中的多糖可使資源得到更充分的利用，實現(xiàn)經(jīng)濟價值最大化，也符合綠色環(huán)保的時代觀念[10]。

提取多糖的常見方法有熱水浸提法、超聲波法、微波法、酶法等。熱水浸提法[11]的提取效率較低，且提取物雜質含量較多。超聲波法[12-15]和微波法[16-17]效率高，時間短，但都會對人體帶來負面影響，危害人體健康。酶法[18-19]提取效率較高，但操作步驟多，還需要后處理，且酶易失活，部分酶還會導致多糖分解。內(nèi)部沸騰法[20-21]是一種較新的提取方法，利用在細胞組織內(nèi)部的沸騰使多糖更容易解吸進入溶液中，可快速高效的提取多糖，并且提取時間較短。因此本文采用內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮中多糖，并利用Box-Behnken 試驗設計模型優(yōu)化提取工藝條件，以獲得較為準確的結果，為荸薺皮多糖的開發(fā)利用提供基本參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 試劑

荸薺：四川內(nèi)江東興區(qū)農(nóng)貿(mào)市場；葡萄糖、乙酸鈉、乙酸、無水乙醇（分析純）：成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

T-6 型紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DF-101S 型恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州英峪予華儀器有限公司；TDL-5-A 型低速大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；FA2204A 型電子天平：上海精天電子儀器有限公司；SHA-B 恒溫水浴振蕩器：金壇市漢康電子有限公司；DFT-100 型手提式萬能高速粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；SHB-B95 型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；CS101-2AB 型電熱鼓風干燥箱：重慶試驗設備廠。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

將荸薺取皮后洗凈，在鼓風干燥箱中低溫烘干后，粉碎備用。

2.2 標準曲線的繪制

按照文獻方法[18-19，22]，以烘干至恒重的葡萄糖為原料設計方案繪制標準曲線，并得出在0.008 mg/mL～0.048 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)的線性回歸方程為A =33.4C-0.070 4，R2=0.999 4。

2.3 荸薺皮多糖的提取和測定

在圓底燒瓶中加入1.00 g 荸薺皮粉和5 mL80%的乙醇溶液，常溫下浸泡 30 min，然后按照 20∶1（mL/g）的液料比加入一定pH 值和溫度的水作溶劑，并保持在此溫度下水浴回流一定時間，冷卻，離心獲取上層清液，將該清液轉移到50 mL 容量瓶中，用水定容。

從此容量瓶中準確移取1.00 mL 提取液，稀釋250倍，再準確移取1.00 mL 稀釋液，利用6%的苯酚溶液和濃硫酸顯色，顯色后在490 nm 波長處測定其吸光度，并利用標準曲線計算得到的稀釋液中多糖濃度，按照式（1）計算多糖得率。

2.4 單因素試驗

在荸薺皮粉質量為1.00 g，乙醇濃度80%，乙醇體積 5 mL，液料比 20∶1（mL/g）的條件下，考查 pH 值（3、4、5、6、7）、提取溫度（75、80、85、90、95 ℃）和提取時間（10、20、30、40、50 min）等單因素對多糖得率的影響。

2.5 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗的結果，以pH 值A、提取溫度B和提取時間C 為自變量，以多糖得率R 為響應值，采用Box-Behnken 設計法設計響應面模型，其中5個中心點試驗，12個試因試驗，并按照模型安排響應面試驗，優(yōu)化試驗條件。

3 結果與討論

3.1 單因素試驗

3.1.1 pH 值對荸薺皮多糖得率的影響

pH 值對荸薺皮多糖得率的影響如圖1所示。

圖1 pH值的影響Fig.1 Influence of pH

從圖1可看到，在3～7 范圍內(nèi)，隨著pH 值的增大，多糖得率先增加后下降，在pH=5 時出現(xiàn)拐點。這是因為一定pH 值時，荸薺皮組織會變得較為脆弱，內(nèi)部沸騰對荸薺皮的作用效果更好，有利于多糖解吸進入溶液中[23-24]。因此選擇最佳pH 值為5。

3.1.2 提取溫度對荸薺皮多糖得率的影響

提取溫度對荸薺皮多糖得率的影響如圖2所示。

圖2 溫度的影響Fig.2 Influecne of temperature

從圖2可看到，隨溫度的增加，多糖得率先逐漸增加，然后逐漸降低，當溫度為80 ℃時，得率達到峰值。這是因為，溫度越高，分子運動越活躍，內(nèi)部沸騰越劇烈，越有利于多糖解吸后擴散到溶液中；但溫度過高時，對流擴散維持時間會縮短，由于多糖分子較大，擴散遷移較慢，會導致大量多糖在擴散出之前就已經(jīng)造成了溶出通道的堵塞[23-24]。因此，選擇最佳提取溫度為80 ℃。

3.1.3 提取時間對荸薺皮多糖得率的影響

提取時間對荸薺皮多糖提取效果的影響如圖3所示。

圖3 時間的影響Fig.3 Influence of time

從圖3可知，隨時間的延長，多糖得率呈先逐漸增大后逐漸降低的趨勢，且拐點出現(xiàn)在30 min 時。這是由于時間越長，就會有越多的多糖在內(nèi)部沸騰作用下擴散到提取溶液中；但時間過長時，內(nèi)部沸騰已接近于停止，擴散通道已近乎于堵塞，導致更多的多糖難以浸出，已經(jīng)浸出的多糖也可能部分分解變質[23-24]。因此選擇最佳提取時間為30 min。

3.2 響應面試驗設計、分析及結果

3.2.1 響應面試驗設計

根據(jù)單因素試驗的結果，以pH 值A、提取溫度B和提取時間C 為自變量，以多糖得率R 為響應值，采用Box-Behnken 設計法設計的響應面模型因素水平編碼如表1所示，試驗方案及結果如表2所示。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

表2 關于多糖得率的響應面試驗方案及其結果Table 2 Response surface design arrangement on yield of polysaccharide and the results

3.2.2 方差分析

利用Design Expert 8.05b 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得出荸薺皮多糖得率對pH 值、提取溫度和提取時間的二次多項回歸方程為：

R=19.3-0.017A+0.42B-0.81C-0.065AB+0.57AC+1.04BC-1.88A2-0.76B2-0.56C2

方差分析見表3，可信度分析見表4。

從表3可看到該模型的P＜0.001，極顯著，失擬項P＞0.05，不顯著，說明該模型的方差均由隨機誤差引起。從表4可知該模型的R2=0.991 1，R2Adj=0.979 6，說明該模型擬合情況良好，回歸效果也較好，可以解釋99.11%響應值變化，未控制因素對試驗結果影響較小（0.89 %）；且 CV=1.15 %，信噪比為 24.914，說明試驗誤差小，說明用此模型對多糖得率進行預測是可行的。

從表3還可看到一次項中B（溫度）、C（時間）對多糖得率的影響極顯著（P＜0.001），A（pH 值）的影響不顯著；二次項中 AC、BC、A2、B2和 C2的影響極顯著，AB的影響不顯著。根據(jù)表中F 值的大小可知各因素影響先后次序為：C＞B＞A。

3.2.3 響應面圖和等高線分析

各因素間交互作用的響應面圖和等高線如圖4～圖6所示。

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the fitted quadratic polynomial model

表4 回歸方程可信度分析Table 4 Creditability analysis of regression equations

圖4 溫度、pH 值對多糖得率的影響Fig.4 Influence of temperature and pH on yield of polysaccharide

圖5 時間、溫度對多糖得率的影響Fig.5 Influence of time and temperature on yield of polysaccharide

從圖4～圖6還可看到pH 值、溫度和時間之間存在交互效應，對多糖得率影響不是簡單線性關系，從曲線上表現(xiàn)出來：時間影響使曲線更陡峭，溫度次之，pH 值最平緩，該結論與方差分析表中的結果一致。

3.2.4 最佳試驗條件的獲得和驗證試驗

通過Design Expert 8.05b 軟件對響應面結果的優(yōu)化分析，得出荸薺皮多糖提取的提取工藝優(yōu)化條件為：pH4.85，溫度 78 ℃，時間 20 min，在該條件下多糖得率理論上可達19.72%，但考慮到操作的方便，將最佳工藝條件修正為pH 5，溫度80 ℃，時間20 min，此時理論預測值為19.55%。在此條件下作5 次平行試驗，得到荸薺皮多糖的平均得率為20.07%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為 3.45 %，與理論預測值的相對誤差為2.66%。此結果與預測值接近，說明了此模型的可靠性。

圖6 pH值、時間對多糖得率的影響Fig.6 Influence of pH and time on yield of polysaccharide

4 結論

將常作為垃圾被拋棄的荸薺皮作為提取多糖的原料，既提高了荸薺的利用價值，還可減少荸薺皮對環(huán)境的污染。本試驗建立了利用內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮中多糖的工藝方法，并利用響應面模型對內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮多糖的工藝條件進行優(yōu)化，得出其最佳條件為：pH 4.85，溫度 78 ℃，時間 20 min，考慮到操作方便性，將條件修正為：pH 5，溫度 80 ℃，時間 20 min，此條件下驗證試驗的平均得率為20.07%（RSD=3.45%），與該條件下理論預測值19.55%的相對誤差為2.66%。該方法獲得的多糖得率比相同條件下熱水浸提法時的多糖得率17.57%高14.23%，說明了內(nèi)部沸騰法的優(yōu)點，是一種值得研究的方法。該結論為荸薺皮多糖的開發(fā)利用提供了一定的參考依據(jù)。