沙棘熊果酸對(duì)H22荷瘤小鼠抑瘤活性及其機(jī)制的探討

張男男，侯瑞麗，李可欣，張文龍，高龍，苗曉涵，戈娜，*

（1.包頭醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品健康研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨外科，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）又名酸醋柳、黑刺、酸刺、其察日嘎納（蒙名）、達(dá)普（藏名）、吉汗（維吾爾名）等[1]，是胡頹子科沙棘屬的一種野生漿果植物，多為橘黃色或橘紅色。有“天然維生素寶庫(kù)”、“營(yíng)養(yǎng)保健來(lái)源”、“神果奇樹(shù)”等美稱。是我國(guó)西部地區(qū)最具代表性的一種經(jīng)濟(jì)植物。沙棘含有的化合物種類多達(dá)百種以上，這些物質(zhì)包含了人體必需氨基酸、維生素、微量元素、生育酚、類胡蘿卜素、多酚、黃酮及其他一些對(duì)身體有益的脂肪酸等活性物質(zhì)[2]，具有降脂、抗氧化、抗炎癥等作用，是珍貴的藥食同源植物資源。內(nèi)蒙古自治區(qū)是沙棘的主要種植區(qū)，既往對(duì)沙棘的開(kāi)發(fā)利用多關(guān)注提取物黃酮類、多糖類等的功效研究，而對(duì)沙棘中熊果酸生物學(xué)作用罕有研究。

熊果酸（ursolic acid，UA）又名烏蘇酸，是一種弱酸性五環(huán)三萜類化合物，在自然界分布廣范，多以游離或與糖結(jié)合成甙的形式存在于沙棘、女貞子、山楂、蔓越莓、枇杷葉等植物中，是多種植物的主要功能成分[3]，具有保肝、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種活性。早在1990年就被日本列為最有希望的抗癌預(yù)防藥物之一[4]。

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居所有惡性腫瘤的第5位，死亡率位居第3位[5]，我國(guó)是世界上肝癌發(fā)病率最高的國(guó)家之一，每年死于肝癌的患者約占世界肝癌死亡人數(shù)的45%[6]。雖然，目前臨床上治療肝癌的方法眾多，如氟尿嘧啶和喃氟啶是肝癌臨床常用藥物，肝移植是治療肝癌最有效的方法。然而，由于肝癌起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已進(jìn)入中晚期，愈后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，以及現(xiàn)存的治療方法副作用大且易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象等，使得肝癌難以實(shí)現(xiàn)根治。因此尋找一種高效、低毒、療效穩(wěn)定的天然抗肝癌藥物成為研究的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)建立H22荷瘤小鼠模型，觀察沙棘熊果酸對(duì)腫瘤的抑制作用，并通過(guò)檢測(cè)白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以及 Ras 蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步探討沙棘熊果酸抑制腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制，為今后內(nèi)蒙古地區(qū)沙棘的深度開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也有望填補(bǔ)蒙藥沙棘在高效、低毒天然藥用植物研發(fā)領(lǐng)域的研究空白。

1 材料與方法

1.1 材料

沙棘果：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)于呼和浩特市和林縣境內(nèi)野生沙棘林采集、提供并鑒定，后經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)分離純化，并應(yīng)用紅外光譜（infra-red spectrum，IR）、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、核磁共振（1H-nuclear magnetic resonance，1HNMR 和13C-nuclear magnetic resonance，13C-NMR）鑒定為五環(huán)三萜類化合物——熊果酸（ursolic acid，UA），分子式為C30H48O3，分子量為456.68，純度93.8%。

1.2 主要試劑和儀器

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）：江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司；鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體：美國(guó)Santa Cruz 公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、RIPA 裂解液、PMSF 蛋白酶抑制劑、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液：江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；羊抗兔Ras 和VEGF 多克隆抗體：美國(guó)Abcam 公司；二抗（辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG）：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ELISA 檢測(cè)試劑盒（TNF-α 和 IL-12）：依科賽生物科技有限公司。

CX41 照相顯微鏡：日本Olympus 公司；550 型酶標(biāo)儀、UVP-GDS-8000 凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad 公司；BAYGENE 電泳儀：北京百晶生物技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物和瘤株

SPF級(jí)雄性KM種小鼠50只，體重（20±2）g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK 軍2012-0004。瘤源為腹水型H22肝癌種鼠：中國(guó)科學(xué)院。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 H22荷瘤小鼠模型的建立及分組

分別于50 只雄性KM 種小鼠左前肢腋窩皮下接種濃度為2.8×107個(gè)/mL H22細(xì)胞懸液0.2 mL，整個(gè)操作30 min 內(nèi)完成。接種24 h 后，根據(jù)體重隨機(jī)分成5組，每組10 只。模型組給予0.2 mL/（kg·d）瓜子色拉油灌胃，UA 低、中、高劑量組小鼠分別給予 UA100、150、300 mg/（kg·d），采用瓜子色拉油為溶劑；CP 組予以CP 25 mg/（kg·d）。連續(xù)給藥2 周。末次給藥12 h 后，記錄體重并斷頭取血，分離血漿；剝離腫瘤組織、肝、腎、脾，稱重。瘤組織除用于病理檢測(cè)外，剩余標(biāo)本均凍存在-80 ℃冰箱中備用。

1.4.2 沙棘熊果酸對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及對(duì)肝、腎、脾的影響

抑瘤率/%=（模型組平均瘤質(zhì)量-熊果酸組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）

1.4.3 蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）觀察瘤組織的病理形態(tài)學(xué)變化

將0.9 cm×0.9 cm×0.5 cm 新鮮腫瘤組織固定于4%多聚甲醛緩沖液中過(guò)夜，常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟，HE 染色，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察瘤組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)瘤組織基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表達(dá)

取新鮮腫瘤組織做石蠟切片，按照免疫組化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，測(cè)定光密度值（A）及平均灰度值，陽(yáng)性信號(hào)以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為判定標(biāo)準(zhǔn)，A 值越大/平均灰度值越低，表明MMP-2 陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。

1.4.5 沙棘熊果酸對(duì)H22荷瘤小鼠血漿中TNF-α 和IL-12 的影響

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)各組血清中 TNF-α 和 IL-12 水平的影響，測(cè)定過(guò)程嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm 處OD 值，按照各自標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 TNF-α 和 IL-12 濃度。

1.4.6 蛋白免疫印跡法檢測(cè)瘤組織Ras、VEGF 等的表達(dá)

裂解瘤組織提取總蛋白，12 000 g×20 min 離心，收集上清液用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定蛋白濃度，按5 份樣品體積與1 份加樣緩沖液混勻，100 ℃孵育 3 min，上樣體積為 10 μL～20 μL 混合液，經(jīng)5%～12%SDS-PAGE 分離樣品后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉封閉2 h，按操作加入相應(yīng)的一抗（GAPDH 抗體體積比為1∶800、Ras 抗體體積比為1∶1000、VEGF 抗體體積比為1∶1000）及適當(dāng)稀釋倍數(shù)的二抗。凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。以GAPDH 為內(nèi)參，以靶蛋白積分光密度（IOD）值與GAPDH（IOD）值的比值顯示靶蛋白相對(duì)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0 軟件整理和分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料多組間比較，采取單因素方差分析，以±s 表示，不同組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠一般狀況的比較

接種前，各組小鼠左前腋下預(yù)注射部位未觸及包塊，各組小鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，動(dòng)作自如，皮毛順滑，有光澤，呈乳白色，體重明顯增加，進(jìn)食飲水正常；接種H22細(xì)胞第7天，各實(shí)驗(yàn)組小鼠左前腋部皮下出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的類圓形結(jié)節(jié)，質(zhì)地堅(jiān)硬，高出皮膚表面，不可活動(dòng)，呈現(xiàn)反應(yīng)呆滯，少動(dòng)，皮毛無(wú)光，體重降低，少食的現(xiàn)象；接種后第14天，模型組小鼠，精神萎靡，毛色晦暗，枯黃，懶怠少動(dòng)，體型消瘦，且左前肢活動(dòng)受限，并存在個(gè)別荷瘤小鼠左前肢皮下腫瘤潰破，爬行緩慢。相較于模型組，CP 組小鼠瘤體增長(zhǎng)緩慢，但體重急劇下降，耳朵蒼白無(wú)血色，精神、食量差，少動(dòng)。而UA 各劑量組與模型組比較，瘤體增長(zhǎng)慢，精神、活動(dòng)及飲食情況均有所緩解。

2.2 各組小鼠體重及臟器指數(shù)的變化

各組小鼠給藥前后體重變化及對(duì)臟器指數(shù)影響見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠給藥前后體重變化及對(duì)臟器指數(shù)影響（±s，n=10）Table 1 The weight change and the influence on organ index before and after administration of each group（±s，n=10）

表1 各組小鼠給藥前后體重變化及對(duì)臟器指數(shù)影響（±s，n=10）Table 1 The weight change and the influence on organ index before and after administration of each group（±s，n=10）

注：與模型組相比，*P＜0.05；與環(huán)磷酰胺對(duì)照組相比，#P＜0.05。

分組0 d 體重/g7 d 體重/g14 d 體重/g肝臟指數(shù)/（mg/g）腎臟指數(shù)/（mg/g）脾臟指數(shù)/（mg/g）環(huán)磷酰胺組 18.10±1.46 26.41±1.86* 26.24±3.57* 55.94±9.51 13.50±1.37 10.21±0.93*模型組 18.33±1.27 28.59±2.74 29.33±1.15 61.22±4.89 13.81±0.86 11.94±1.02 UA 高劑量組 18.96±3.24 28.78±1.78# 32.15±2.29*# 55.17±7.05 13.07±0.86 13.47±1.34*#UA 中劑量組 18.29±1.36 29.00±2.08# 32.12±2.02*# 57.21±9.65 12.75±1.49 12.83±1.12*#UA 低劑量組 18.07±1.08 28.73±2.38# 32.10±2.89*# 57.87±5.69 12.72±1.09 11.76±1.51#

由表1可知，接種前各組小鼠體重均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)前 7 d，相比模型組，CP 組荷瘤小鼠體重明顯下降（P＜0.05），但低、中、高 UA 組荷瘤小鼠體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)后 7 d，低、中、高 UA組荷瘤鼠體重顯著高于模型組（P＜0.05）。相比模型組，低、中、高UA 組肝、腎臟器指數(shù)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；脾臟指數(shù)明顯升高（P＜0.05）；CP 組脾臟指數(shù)明顯降低（P＜0.05）。

2.3 沙棘熊果酸對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用

各組H22肝癌小鼠移植瘤見(jiàn)圖1，沙棘熊果酸對(duì)小鼠腫瘤的影響見(jiàn)表2。

由表2可知，與模型組相比，沙棘熊果酸各劑量組腫瘤抑制率分別達(dá)到17.46%、35.11%、55.22%，其以UA 中、高劑量組小鼠腫瘤的平均質(zhì)量下降最為顯著（P＜0.05）。沙棘熊果酸高劑量組與低劑量組相比，腫瘤的平均質(zhì)量均降低明顯（P＜0.05），與 CP 組比較，無(wú)顯著性差異（P＜0.05）。（見(jiàn)圖1）

圖1 各組H22肝癌小鼠移植瘤Fig.1 Transplantation tumor of H22 liver cancer mice in each dose group

表2 沙棘熊果酸對(duì)小鼠腫瘤的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of seabuckthorn ursolic acid on tumor in mice（±s，n=10）

表2 沙棘熊果酸對(duì)小鼠腫瘤的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of seabuckthorn ursolic acid on tumor in mice（±s，n=10）

注：與模型組相比，*P＜0.05；與環(huán)磷酰胺組相比，#P＜0.05；與高劑量組相比，▲P＜0.05。

分組劑量/（mg/kg）瘤質(zhì)量/g抑瘤率/%環(huán)磷酰胺組 25 1.18±0.46* 55.59模型組 2.65±1.11 UA 高劑量組 300 1.19±0.81* 55.22 UA 中劑量組 150 1.72±1.01* 35.11 UA 低劑量組 100 2.18±1.23#▲ 17.46

2.4 HE染色法觀察瘤組織的病理形態(tài)學(xué)變化

HE 染色觀察各組腫瘤組織病理學(xué)變化見(jiàn)圖2。

HE 染色病理觀察結(jié)果顯示，模型組腫瘤細(xì)胞核體積相對(duì)較大，異型性明顯且染色較深，胞質(zhì)較多，間質(zhì)較少，而沙棘熊果酸低、中、高劑量組及CP 組腫瘤細(xì)胞核相對(duì)較小，或破裂或固縮而深染，且相比模型組細(xì)胞間質(zhì)明顯增多。

圖2 HE染色觀察各組腫瘤組織病理學(xué)變化（×400）Fig.2 Histopathological structure of tumor tissues at high magnification（×400）

2.5 沙棘熊果酸對(duì)小鼠瘤組織MMP-2的表達(dá)的影響

光鏡觀察結(jié)果顯示MMP-2 在腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)，在胞漿中呈黃色到棕黃色顆粒著色。大都分布彌漫，定位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)細(xì)胞膜有陽(yáng)性表達(dá)。（見(jiàn)圖3）

由表3可知，與模型組相比，沙棘熊果酸低、中、高劑量組移植瘤組織中MMP-2 蛋白表達(dá)顯著降低，故其平均灰度值顯著偏高；且通過(guò)平均光密度值測(cè)定可知，UA 各劑量組MMP-2 平均光密度值較模型組顯著降低（P＜0.05）。

MMP-2 在各組瘤組織中的表達(dá)情況見(jiàn)圖3，MMP-2 在各組瘤組織中的表達(dá)情況見(jiàn)表3。

圖3 MMP-2在各組瘤組織中的表達(dá)情況（SABC，×400）Fig.3 MMP-2 positive expression in tumor tissue（SABC×400）

表3 沙棘熊果酸對(duì)瘤組織MMP-2表達(dá)的影響（±s，n=10）Table 3 Effect of seabuckthorn ursolic acid on MMP-2 expression in tumor tissues（±s，n=10）

表3 沙棘熊果酸對(duì)瘤組織MMP-2表達(dá)的影響（±s，n=10）Table 3 Effect of seabuckthorn ursolic acid on MMP-2 expression in tumor tissues（±s，n=10）

注：與模型組相比，*P＜0.05。

分組 光密度值（A）平均灰度值環(huán)磷酰胺組 0.18±0.03* 161.67±15.82*模型組 0.32±0.06 117.79±16.51 UA 高劑量組 0.21±0.03* 157.99±10.72*UA 中劑量組 0.24±0.07 148.81±18.51*UA 低劑量組 0.25±0.028 146.59±9.71*

2.6 沙棘熊果酸對(duì)小鼠血漿中TNF-α和IL-12的影響

沙棘熊果酸對(duì)小鼠血漿中TNF-α 和IL-12 的影響見(jiàn)表4。

表4 沙棘熊果酸對(duì)小鼠血漿中TNF-α和IL-12的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of seabuckthorn ursolic acid on TNF-α and IL-12 in mice plasma（±s，n=10）

表4 沙棘熊果酸對(duì)小鼠血漿中TNF-α和IL-12的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of seabuckthorn ursolic acid on TNF-α and IL-12 in mice plasma（±s，n=10）

分組TNF-α 濃度/（pg/mL）IL-12 濃度/（pg/mL）環(huán)磷酰胺組 109.23±18.61* 265.64±87.93*模型組 72.82±33.74 177.00±60.26 UA 高劑量組 119.72±20.82* 309.70±91.94*

續(xù)表4 沙棘熊果酸對(duì)小鼠血漿中TNF-α和IL-12的影響（±s，n=10）Continue table 4 Effect of seabuckthorn ursolic acid on TNF-α and IL-12 in mice plasma（±s，n=10）

續(xù)表4 沙棘熊果酸對(duì)小鼠血漿中TNF-α和IL-12的影響（±s，n=10）Continue table 4 Effect of seabuckthorn ursolic acid on TNF-α and IL-12 in mice plasma（±s，n=10）

注：與模型組相比，*P＜0.05；與高劑量組相比，#P＜0.05。

分組TNF-α 濃度/（pg/mL）IL-12 濃度/（pg/mL）UA 中劑量組 100.00±31.64 261.90±108.53*UA 低劑量組 90.00±5.84# 216.72±72.70#

由表4可知，與模型組相比，沙棘熊果酸高劑量組和CP 組小鼠血漿中細(xì)胞因子TNF-α、IL-12 的濃度明顯升高（P＜0.05），且沙棘熊果酸高劑量組 TNF-α、IL-12 的濃度高于CP 組。

2.7 沙棘熊果酸對(duì)小鼠腫瘤組織VEGF與Ras蛋白表達(dá)的影響

沙棘熊果酸對(duì)VEGF、RAS 蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖4。

與模型組比較，沙棘熊果酸高、中劑量組腫瘤組織中VEGF、RAS 的蛋白表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05；而沙棘熊果酸高劑量組VEGF、RAS 的表達(dá)水平顯著低于中、低劑量組（P＜0.05），但與 CP 組比較，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 沙棘熊果酸對(duì)VEGF、Ras蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of ursolic acid extracted fromhippophae rhamnoides L on expression level of VEGF and RAS

3 討論

既往的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫功能失調(diào)密切相關(guān)[7]。大量的臨床和試驗(yàn)研究表明，大多數(shù)癌癥患者免疫功能的抑制與癌細(xì)胞的增殖相一致，而目前用于治療肝癌的化療藥物主要集中在攻擊和殺死快速增殖的肝癌細(xì)胞，忽略了對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答的影響[8]，如臨床常用治療惡性腫瘤的廣譜抗腫瘤藥物——環(huán)磷酰胺，它對(duì)多種腫瘤都具有抑制作用，且效果顯著，但有嚴(yán)重的免疫抑制作用，對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)造成危害[9]。本研究選擇CP（25 mg/kg）為陽(yáng)性對(duì)照組，印證了既往的研究，環(huán)磷酰胺具有良好的抑瘤效果，但在延長(zhǎng)帶瘤生存時(shí)間上不具優(yōu)勢(shì)，在CP 治療過(guò)程中，小鼠的攝食量明顯減少，與模型組相比，體重下降嚴(yán)重。相反，在3 種劑量的沙棘熊果酸給藥沒(méi)有改變小鼠的體重，并且它們顯示正常的活動(dòng)，能顯著減輕荷瘤小鼠惡病質(zhì)，恢復(fù)正常活動(dòng)。脾臟作為機(jī)體重要的免疫器官，脾臟指數(shù)可反映機(jī)體免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)以及脾臟的發(fā)育情況[10]。當(dāng)惡性腫瘤發(fā)生時(shí)，脾臟內(nèi)的T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞分裂增殖釋放細(xì)胞因子。細(xì)胞因子在機(jī)體內(nèi)起到相互促進(jìn)或相互抑制的作用，調(diào)節(jié)全身系統(tǒng)免疫，可作為判斷機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)[11]。IL-12 為細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能刺激T 細(xì)胞及NK 細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ 等細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)，使機(jī)體有效的識(shí)別并清除腫瘤細(xì)胞[12]。而TNF-α 是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管形成血栓而發(fā)生出血壞死、增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫功能等作用[13]。本次研究發(fā)現(xiàn)，與CP 對(duì)照組相比，沙棘熊果酸各干預(yù)組脾臟指數(shù)、荷瘤鼠血漿IL-12、TNF-α 水平顯著升高。并且，沙棘熊果酸在較好的抑制肝移植瘤的生長(zhǎng)、縮小腫瘤細(xì)胞核體積、增加細(xì)胞間質(zhì)的同時(shí)對(duì)肝、腎功能無(wú)毒副作用。綜合各項(xiàng)指標(biāo)提示沙棘熊果酸是一種安全、低毒的天然抗腫瘤活性物質(zhì)，在改善荷瘤小鼠的一般狀況的同時(shí)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是其預(yù)后較差的首要表現(xiàn)形式之一，也是致使其低生存率的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌對(duì)周圍基質(zhì)的降解是腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移的先決條件，其中MMP-2 發(fā)揮主要作用。MMP-2 是基質(zhì)金屬蛋白酶的一個(gè)亞型，可降解具有屏障作用的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）以及Ⅳ型膠原，形成局部溶解構(gòu)成腫瘤細(xì)胞移動(dòng)的通道，在多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵作用[14]。通過(guò)檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞癌模型腫瘤組織及瘤旁組織MMP-2 發(fā)現(xiàn)此兩部分均有表達(dá)，瘤組織的表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于瘤旁組織，且有轉(zhuǎn)移者的腫瘤組織陽(yáng)性表達(dá)顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移者[15]。此外，另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)VEGF 與MMP-2 在腫瘤病灶表達(dá)具有一致性[16]。VEGF 是最重要的腫瘤血管生成刺激因子，能誘導(dǎo)瘤旁正常血管形成新的毛細(xì)血管，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤間質(zhì)形成[17]。肝癌細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞通過(guò)旁分泌和自分泌產(chǎn)生大量VEGF，高釋放的VEGF 為肝癌的快速增殖和轉(zhuǎn)移提供條件。提示下調(diào)MMP-2、VEGF 在肝癌中的表達(dá)可能是治療肝癌的潛在靶點(diǎn)。同時(shí)，Rak等[18]指出Ras 癌基因可以間接地推進(jìn)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤增殖。Ras 是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類原癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物為 ras 蛋白（P21ras 蛋白/小 G 蛋白），有兩種存在形式，即 Ras-GTP（活化狀態(tài)）、Ras-GDP（非活化狀態(tài)），可視作分子開(kāi)關(guān)參與細(xì)胞外增殖及生長(zhǎng)、分化等相關(guān)信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)過(guò)程[19]。當(dāng)ras 基因被激活后，Ras 與GTP 持續(xù)性的結(jié)合，開(kāi)關(guān)打開(kāi)，活化的Ras 激活其下游效應(yīng)蛋白，促使正常肝細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，促進(jìn)原發(fā)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展。研究結(jié)果顯示，沙棘熊果酸可劑量依賴性的抑制MMP-2、VEGF、RAS 的表達(dá)，提示沙棘熊果酸可能通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞外基質(zhì)降解、新生血管形成及腫瘤細(xì)胞的增殖等過(guò)程，從而抑制肝癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，沙棘熊果酸能夠明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，其抑制瘤機(jī)制可能與其提高機(jī)體免疫力，下調(diào)MMP-2、VEGF、RAS 的過(guò)表達(dá)有關(guān)。此外，與環(huán)磷酰胺相比，沙棘UA 無(wú)肝腎毒性及免疫抑制作用，其高效低毒的特性使其有望成為安全有效的新型抗癌藥物。