臨床分離金黃色葡萄球菌ST22克隆毒力及耐藥基因分析

詹鈾超 陳凱銳 江雁瓊 張艷玲 劉正祥 袁文常，

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院檢驗科（廣州510700）；2廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院檢驗科（廣州510000）；3新疆軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科（烏魯木齊830000）

金黃色葡萄球菌（簡稱金葡萄）是引起人類感染的一種重要病原體，可引起人類皮膚和軟組織感染、肺炎、菌血癥和心內(nèi)膜炎等各種疾病。金葡菌通常被分為耐甲氧西林金葡菌（methicillin-resistantS.aureus，MRSA）和甲氧西林敏感金葡菌（methicillin-susceptibleS.aureus，MSSA），MRSA 攜帶一葡萄球菌盒式染色體（staphylococcal cassette chromosomemec，SCCmec），其耐藥基因mecA可編碼PBP2a蛋白，對甲氧西林等β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力低，介導(dǎo)MRSA的耐藥性［1］。相對于MRSA而言，MSSA約占我國金葡菌感染的40%左右，通常認(rèn)為MSSA為散在偶發(fā)株，不存在優(yōu)勢克隆，具有更高的遺傳多樣性，攜帶有更多的毒力因子。但是最近的研究顯示，在我國MSSA也存在主要的流行克隆，主要有 ST121，ST398，ST5，ST7以及ST188［2］。ST22克隆是流行于歐洲的主要MRSA克隆，可以在人類、寵物（狗和貓）和醫(yī)院環(huán)境中定植傳播［3］。目前，ST22在歐洲、大洋洲及部分亞洲國家和地區(qū)廣泛流行。但是ST22克隆在中國廣泛流行未見報道，本課題通過檢測pvl等18種毒力基因、erm耐藥基因和耐藥譜分析對從烏魯木齊地區(qū)分離的105株ST22克隆進(jìn)行了研究。不僅從一定程度上揭示了烏魯木齊地區(qū)ST22克隆的分子流行特征，而且可以為我國其他地區(qū)金葡菌感染和流行的檢測提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源2011年6月至2016年6月期間分離于新疆軍區(qū)總醫(yī)院，經(jīng)MLST分型鑒定的104株ST22型以及1株分離自病房空氣的ST22菌株。社區(qū)獲得性金葡菌（Community-acquiredS.aureus，CASA）判斷標(biāo)準(zhǔn)參照參考文獻(xiàn)［4］。在醫(yī)院內(nèi)感染的為醫(yī)院獲得性金葡菌（Hospital-associatedS.aureus，HA-SA）。

1.1.2 儀器與試劑Bio-Rad PCR儀，Bio-Rad凝膠成像儀，生物梅里埃VITEK?2 Compact全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)及配套藥敏卡片；Tryptone Soya Broth（TSB）（CM0129B）培養(yǎng)基購自 OXOID公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒（NEP021-2）購自北京鼎國生物技術(shù)公司，溶葡萄球菌素（9011-93-2）及溶菌酶（12650-88-3）購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 MRSA鑒定PCR方法檢測mecA與femB基因，反應(yīng)體系為50 μL體系，反應(yīng)程序設(shè)定為94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸60 s，進(jìn)行30次循環(huán)，最后72℃延伸2 min，反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)以310 bp（mecA）、651 bp（femB）處出現(xiàn)條帶為陽性。若femB基因為陽性，mecA基因為陰性則判斷為MSSA菌株；若mecA與femB基因皆為陽性，則為MRSA菌株［1］。

1.2.2 spa分型設(shè)計引物spaF：5′-AGACGATCCTTCGGTGAGC-3′，spaR：5′-CAGCAGTAGTGCCGTTTG-3′，PCR擴(kuò)增金葡菌spa基因的X區(qū)域［5］。PCR產(chǎn)物送北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司測序，序列提交spa基因分型數(shù)據(jù)庫（http：//www.ridom.de/spaserver）進(jìn)行比對，根據(jù)重復(fù)序列的排列方式確定spa型別。

1.2.3 MRSA菌株的SCCmec分型應(yīng)用5對特異性引物，對每株MRSA菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，依據(jù)電泳圖，對菌株進(jìn)行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型的SCCmec分型［6］。

1.2.4 耐藥基因及毒力基因檢測通過PCR方法，用特異性引物擴(kuò)增pvl等18種毒力基因以及紅霉素、克林霉素耐藥基因ermA、ermB、ermC，產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證［7-9］。

1.2.5 藥敏試驗藥敏試驗使用VITEK?2 Compact藥敏分析系統(tǒng)及配套藥敏卡片GP67進(jìn)行測定，抗菌藥物敏感性判斷根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）2016版執(zhí)行，以耐藥（R）、敏感（S）表示［10］。

2 結(jié)果

2.1 MRSA鑒定在104株ST22克隆臨床分離株中，6株細(xì)菌mecA基因陽性，定義為MRSA菌，占5.8%；MSSA菌98株，占94.2%。其中76株細(xì)菌為CA-SA，28株為HA-SA。CA-SA ST22主要引起皮膚軟組織感染（65.4%，68/104）和呼吸道感染（5.8%，6/104）；HA-SA ST22主要引起術(shù)后傷口感染（13.5%，14/104）和呼吸道感染（8.7%，9/104）。見圖1。

圖1 CA-SA及HA-SA ST22來源分布Fig.1 Distribution of the CA-and HA-SA of ST22 in different clinical specimens

2.2 分子分型經(jīng)SCCmec分型及spa分型，6株MRSA菌株均為SCCmec IV型，t309型（圖2）。98株MSSA菌可分為12種spa型，其中86株為t309型，占87.8%（86/98），t790型2株，t12442、t12481、t13828、t15234、t1977、t284、t5335、t625、t8221，t8934型各1株。另外，從病房空氣中分離的1株MSSA-ST22為t309型。

圖2 ST22-MRSA SCCmec分子分型凝膠電泳結(jié)果Fig.2 The SCCmec typing of ST22-MRSA

2.3 毒力基因檢測結(jié)果顯示104株ST22細(xì)菌中檢測到至少4種以上毒力基因，97.1%的菌株攜帶有5種以上毒力基因，73.1%的菌株攜帶有6種以上毒力基因，未檢測到see及etb基因（圖3）。sem，sen的攜帶率為100%，其次為seo（98.1%）、seg（97.1%）、pvl（79.8%）、sei（77.9%），其他毒力基因的攜帶率均低于20.0%（圖2B）。75%（78/104）的菌株攜帶有seiseg-sem-sen-seo五種腸毒素基因。對比76株CAST22與28株HA-ST22的毒力因子攜帶情況，CAST22與HA-ST22之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

圖3 104株ST22中18種毒力基因檢測Fig.3 Detection of 18 virulence genes of 104 strains of ST22

表1 金葡菌毒力基因攜帶率Tab.1 The virulence genes of S.aureus %

2.4 藥敏實驗分析及耐藥基因檢測ST22克隆對抗生素的藥敏試驗結(jié)果見表2。6株MRSA對苯唑西林、青霉素耐藥，5株對紅霉素耐藥，僅有1株細(xì)菌對克林霉素耐藥，1株對四環(huán)素耐藥，對其余被檢抗生素均敏感。MSSA菌株對青霉素耐藥，53.1%（52/98）的菌株對紅霉素耐藥，克林霉素耐藥率為7.1%（7/98），檢測到1株細(xì)菌對利福平耐藥?？諝庵蟹蛛x的ST22菌株僅對青霉素耐藥。

耐藥基因檢測結(jié)果顯示，在所有菌株中未檢測到ermA、ermB基因，僅在6株細(xì)菌中檢測到ermC基因，均對紅霉素耐藥，其中1株對克林霉素耐藥。

表2 金葡菌臨床分離株抗生素藥敏實驗結(jié)果Tab.2 Antimicrobial susceptibility profiles of S.aureus isolates

2.5 MRSA特征分析6株ST22-MRSA均為SCC-mecIV-t309克隆，其中4株為CA-MRSA，2株為HAMRSA，6株細(xì)菌均攜帶有sen、sei、seg、seo、sem基因。MRSA對抗生素的耐藥性不太一致，5株對紅霉素耐藥，2株對克林霉素耐藥，1株對利福平耐藥，只在1株細(xì)菌中檢測到ermC基因。

表3 ST22-MRSA臨床及分子特征Tab.3 Clinical and molecular features of ST22-MRSA

3 討論

金葡菌因其具有較強(qiáng)的外界環(huán)境適應(yīng)能力和定植能力，在全球范圍內(nèi)迅速傳播，已成為醫(yī)院和社區(qū)感染的重要病原菌。在我國，金葡菌是引起臨床感染的首要革蘭氏陽性致病菌，但是在不同地區(qū)金葡菌的主要流行克隆存在較大差異。

ST22克隆在歐洲被命名為EMRSA-15，1993年首次在英國報道，隨后廣泛的在歐洲的醫(yī)院內(nèi)部、醫(yī)院之間以及不同國家快速傳播，是引起歐洲醫(yī)院感染的主要MRSA菌［3］。最近的研究顯示ST22-MRSA-SCCmecIV型克隆已經(jīng)在新加坡、巴勒斯坦、印度尼西亞、印度和新加坡等亞洲國家和地區(qū)廣泛流行，并且有取代ST239-MRSA-SCCmecIII克隆的趨勢，但是在我國還很少有ST22-MRSA的報道［11-13］。LI等［14］對2011年分離自我國華山醫(yī)院的608株金葡菌的分析研究首次報道了2株ST22-MSSA克隆，其中1株為pvl陽性菌株。YANG等［2］對2013年分離自重慶的124株MSSA克隆研究發(fā)現(xiàn)，ST22克隆是主要流行的MSSA菌，優(yōu)勢spa型別為t11413，71.4%的菌株攜帶有pvl基因。WANG等［15］研究發(fā)現(xiàn)，ST22-t309是引起北京地區(qū)兒童感染的主要克隆，且ST22克隆已經(jīng)出現(xiàn)取代ST59克隆的趨勢。JIANG等［16］對55例社區(qū)獲得性皮膚軟組織感染的金葡菌研究發(fā)現(xiàn)，有2株為ST22-t309克隆，均為pvl陽性菌株。本研究發(fā)現(xiàn)ST22是引起烏魯木齊地區(qū)金葡菌感染的主要流行克隆，同時鑒定出6株ST22-MRSA-SCCmecIV-t309，與廣泛流行于歐洲及亞洲部分地區(qū)的ST22-MRSA（EMRSA-15）部分型別相一致。98株MSSA菌中，主要spa型別為t309型，另外還檢測到t790等11種spa型別，體現(xiàn)出遺傳的多樣性。廣泛流行于烏魯木齊地區(qū)ST22克隆與中東地區(qū)以及歐洲地區(qū)的廣泛流行ST22克隆是否具有相關(guān)性，需要進(jìn)一步通過全基因組測序等方法進(jìn)一步研究確認(rèn)。

本研究中ST22-MRSA及ST22-MSSA，對大部分抗生素保持較高的敏感性，ST22-MRSA菌主要對紅霉素耐藥（83.3%），與流行于歐洲的EMRSA-15相似。ST22-MSSA主要對青霉素和紅霉素耐藥，對紅霉素等耐藥率達(dá)到53.1%。以往的研究顯示金葡菌對紅霉素或者克林霉素的耐藥與細(xì)菌是否攜帶有erm基因無相關(guān)性。由于erm基因存在于質(zhì)粒上，容易丟失，所以部分菌株對紅霉素耐藥，但是檢測不到erm基因；同時有些菌株攜帶有erm基因，但是由于啟動子突變，菌株表現(xiàn)出對紅霉素敏感［7］。研究顯示MSSA菌株主要攜帶有ermC基因，但是本研究中僅在1株MRSA菌，5株MSSA菌中檢測到了ermC基因，未檢測到ermA及ermB基因，與53.1%的MSSA菌以及83.3%的MRSA菌對紅霉素耐藥表型不一致，其具體耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

金葡菌具有較強(qiáng)的致病性，和其攜帶有眾多的毒力因子有關(guān)。PVL與由金葡菌引起的皮膚和軟組織感染密切相關(guān)，MRSA和MSSA均有可能攜帶該蛋白，特別是社區(qū)獲得性金葡菌經(jīng)常攜帶有該蛋白［17］。本研究中，79.8%的ST22克隆攜帶有pvl基因，78.8%的菌株分離子皮膚軟組織感染，進(jìn)一步證實PVL蛋白與皮膚和軟組織感染密切相關(guān)。葡萄球菌腸毒素和食物中毒密切相關(guān)，是金葡菌的超抗原，能夠引起宿主細(xì)胞凋亡。本研究中ST22克隆sem、sen的攜帶率為100%，seo、seg及sei基因攜帶率也較高（均＞75%），其他腸毒素基因攜帶率較低。腸毒素SEA、SEB、SEC、SED和SEE屬于經(jīng)典腸毒素；SEG、SEH、SEI、SEM、SEN和SEO等屬于非經(jīng)典腸毒素［9］；seg、sei、sem、sen及seo這五種腸毒素基因?qū)儆趀gc腸毒素基因簇，位于基因組島SaPI3上，相比于經(jīng)典腸毒素，這5種腸毒素與血清的中和能力顯著降低，提示ST22-t309具有較強(qiáng)的致病性，有利于其傳播和流行。

綜上所述，本研究在一定程度上揭示了廣泛流行于烏魯木齊地區(qū)的ST22克隆的分子特征及耐藥情況，ST22克隆對抗生素較敏感，但是ST22-MRSA菌已出現(xiàn)。ST22克隆pvl基因陽性率較高，且攜帶有較多的毒力基因，具有高致病性。對ST22克隆如何在烏魯木齊地區(qū)廣泛傳播，需要結(jié)合全基因組測序等技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步研究，以防控其傳播與流行。