不同濃度131I-ELP近距離放射治療兔VX2肝癌模型的實(shí)驗(yàn)研究

李 茜,劉欣培,王多偉,申一鳴,賈 強(qiáng),劉文天

李茜,劉文天,天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化科 天津市 300052

劉欣培,天津市第五中心醫(yī)院消化科 天津市 300450

王多偉,天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普外科 天津市 300052

申一鳴,賈強(qiáng),天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 天津市 300052

核心提要：類彈性蛋白多肽(elastin-like peptide,ELP)作為一種新型生物醫(yī)學(xué)材料,一直是近年來藥物載體、藥物控釋研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),本研究擬探討其作為放射性核素131I的載體近距離放射治療兔的VX2肝癌模型的有效性及不同放射性濃度131I-ELP療效的差異性.

0 引言

世界上每年約有75萬肝癌新發(fā)病例,其中一半發(fā)生在中國(guó).原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一,是社會(huì)和人民沉重的負(fù)擔(dān)[1].肝癌的治療方法主要有手術(shù)、放療、化療、局部射頻消融和肝移植等,但其復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差預(yù)示著現(xiàn)有治療方法的局限性[2].放射性粒子植入是肝癌局部治療的有效方法,其通過持續(xù)低劑量輻射,能最大程度殺傷腫瘤細(xì)胞[3].為使剩余正常肝組織能夠得到再生,放療野的設(shè)計(jì)便成為放射性粒子植入的關(guān)鍵,類彈性蛋白多肽(elastin-like peptide,ELP)因其可注射、可自組裝、可降解及良好的的生物相容性[4,5],有望成為新型核素載體.本實(shí)驗(yàn)擬探討ELP作為放射性核素131I的載體近距離放射治療兔VX2肝癌模型的有效性及不同放射性濃度治療效果的差異性.

1 材料和方法

1.1 材料 VX2荷瘤兔2只(南京市華兔生物有限公司);健康新西蘭大白兔18只,雌雄各半,平均體質(zhì)量3.5-4.5 kg,月齡3-4 mo(天津市奧臣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司);1%碘化鉀口服液(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院);Na -I131溶液(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院);ELP由美國(guó)Duke大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系設(shè)計(jì)合成,分子量為50 kDa,其含有120個(gè)五肽(VPGXG)重復(fù)序列,相變溫度為23.82 ℃,羧基端添加7個(gè)酪氨酸殘基以便于同位素的標(biāo)記[6];無菌實(shí)驗(yàn)臺(tái);兔解剖臺(tái);高壓滅菌器;動(dòng)物手術(shù)器械包;游標(biāo)卡尺;ALOKA Prosound超聲診斷儀;Discovery NM/CT 670單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描/計(jì)算機(jī)斷層掃描(single-photon emission computed tomography/computed tomography,SPECT/CT);無菌紗布;無菌洞巾;注射器;采血針等,以上儀器由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院提供.

1.2 方法

1.2.1 建立兔肝癌模型,檢測(cè)治療前的基線指標(biāo)：采用直視下腫瘤組織小塊包埋法建立兔VX2肝癌模型(圖1),應(yīng)用B超監(jiān)測(cè)肝臟腫瘤的生長(zhǎng)情況,將建模14 d經(jīng)B超檢查確認(rèn)有肝癌生長(zhǎng)的動(dòng)物隨機(jī)分為高放射濃度治療(H)組(n=5),低放射濃度治療(L)組(n=5)和空白對(duì)照(C)組(n=5),記錄建模14 d后瘤體最長(zhǎng)徑(a)和最短徑(b),按照體積計(jì)算公式(V=1/2×ab2)計(jì)算出腫瘤體積;經(jīng)耳緣靜脈采取兔外周靜脈血,使用血液分析儀檢測(cè)血常規(guī),使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)兔丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST);于治療前一周至治療結(jié)束在動(dòng)物飲用水中加入1%碘化鉀,以防其甲狀腺攝取放射性碘.

1.2.2 制備131I-ELP并檢測(cè)其穩(wěn)定性：依據(jù)造模后14 d B超量取的腫瘤體積,計(jì)算出所需131I-ELP的體積(40 μL/150 mm3)[6],計(jì)算公式為V藥=V瘤/150×40,H組所需Na-I131=V藥×100,L組所需Na-I131=V藥×50,具體注射體積見(表1),采用iodogen法對(duì)ELP進(jìn)行131I碘化標(biāo)記并配置成放射性濃度為50 mCi/mL及100 mCi/mL溶液,置于冰浴中備用;使用同位素紙層析法分別于配置后0 h,24 h,48 h,72 h和96 h測(cè)定131I-ELP的放射化學(xué)純度,以評(píng)估其體外穩(wěn)定性.

1.2.3 放射治療：實(shí)驗(yàn)兔麻醉(10%水合氯醛溶液,5 mL/kg腹腔注射),在B超引導(dǎo)下定位肝臟腫瘤,確定穿刺的部位、方向及深度,避開血管,分別將放射性濃度為50 mCi/mL、100 mCi/mL131I-ELP溶液及ELP溶液注入腫瘤內(nèi),停留60 s后拔針,使用紗布進(jìn)行加壓包扎,超聲圖像及治療過程見(圖2);H和L組動(dòng)物注入藥物后,利用SPECT/CT掃描觀察放射性藥物是否成功植入.

1.2.4 影像學(xué)監(jiān)測(cè)：三組在治療后7 d、14 d行B超檢查,量取腫瘤最長(zhǎng)徑和最短徑,得出腫瘤體積及腫瘤增長(zhǎng)率;分別于治療后7 d、14 d為H、L組行SPECT/CT檢查放射性131I的組織分布.

1.2.5 檢測(cè)肝功能及血常規(guī)數(shù)值：三組動(dòng)物均于治療后7 d和14 d在兔耳緣靜脈取血,采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT與AST水平,采用血液分析儀檢測(cè)兔血常規(guī).

圖1 直視下腫瘤組織小塊包埋法建立肝癌模型.

1.2.6 記錄動(dòng)物生存期：觀察自腫瘤植入日起三組動(dòng)物的自然生存時(shí)間.

1.2.7 病理組織學(xué)檢查：動(dòng)物自然死亡后進(jìn)行尸檢,離體觀察肝臟腫瘤及其周圍組織器官情況并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查,觀察是否出現(xiàn)腹腔內(nèi)出血及腹膜炎等并發(fā)癥.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以mean±SD表示,組間計(jì)量資料比較使用單因素方差分析;兩組間比較采用SNK(Student-Newman-Keuls)q檢驗(yàn);P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)記物體外穩(wěn)定性131I-ELP在冰浴條件中存放96 h,其放化純度仍能維持在97.3%.

2.2 治療前基線指標(biāo) H組、L組和C組治療前(VX2肝癌建模后第14天)的腫瘤體積、肝功能(ALT、AST)和血常規(guī)(Hb、RBC)等基線指標(biāo)無顯著差異(表2和3).

2.3131I在體內(nèi)的分布 治療后7 d、14 d的SPECT/CT結(jié)果示治療組的放射性持續(xù)位于腫瘤內(nèi)部,未見其它放射性攝取組織(圖3).

2.4 腫瘤生長(zhǎng)變化 隨著時(shí)間的推移,治療后三組腫瘤體積較治療前均出現(xiàn)進(jìn)行性增加(圖4A和B),H組腫瘤生長(zhǎng)率(tumor growth rate,TGR)最小,C組TGR最大,三組比較有顯著性差異(P＜0.05).

2.5 生化檢查 隨著時(shí)間的推移,治療后H和L組動(dòng)物的血清ALT、AST出現(xiàn)了先升高后降低的變化,C組ALT、AST數(shù)值則持續(xù)上升(圖5).治療后7 d L組動(dòng)物ALT數(shù)值最低,C組ALT數(shù)值最高,三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),C組AST數(shù)值顯著高于H和L組(P＜0.05),但H和L組的AST數(shù)值無顯著差異;治療后14 d C組ALT數(shù)值顯著高于H和L組(P＜0.05),而H組和L組的ALT水平無顯著差異,L組動(dòng)物AST數(shù)值最低,C組AST數(shù)值最高,三組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).三組動(dòng)物Hb、RBC計(jì)數(shù)無顯著差異(表4).

2.6 動(dòng)物自然生存期 分析自然生存時(shí)間(自腫瘤種植之日算起,圖6)發(fā)現(xiàn),H組為61.4 d±10.50 d,L組為52.6±8.85 d,C組為39.2 d±5.63 d,三組動(dòng)物的生存期相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05).

As the understanding of myocardial protection improved,the use of mildly hypertrophic left ventricles with short ischaemic times were also proposed with the caveat that there were no ECG changes[116].

2.7 尸體解剖 動(dòng)物死亡后尸檢發(fā)現(xiàn),H組動(dòng)物未見有腹膜炎和腹腔積液等并發(fā)癥,L組一只(20%)出現(xiàn)腹膜炎,C組一只(20%)出現(xiàn)腹腔積液、一只(20%)出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移.VX2肝癌與正常組織邊界清晰,瘤體呈圓形或橢圓形,質(zhì)硬,切面中心可見黃白色干酪樣壞死物(圖7).

2.8 病理組織學(xué)檢查 H組可見腫瘤周圍肝細(xì)胞變性壞死,匯管區(qū)小膽管擴(kuò)張,肝竇及匯管區(qū)可見膠原纖維沉積,肝內(nèi)出現(xiàn)條索狀纖維增生,腫瘤組織內(nèi)部見大片狀壞死(圖8A).L組僅有少量纖維增生,腫瘤組織內(nèi)部見大片狀壞死(圖8B).C組腫瘤組織被膜處可見明顯纖維組織增生,腫瘤組織內(nèi)可見小片狀壞死(圖8C).

3 討論

肝癌是世界上癌癥相關(guān)死亡的第二大原因,過去二十年來,與肝癌相關(guān)的年死亡率顯著增加,其中大多數(shù)來自亞太地區(qū)[7].因肝癌起病隱匿,早期癥狀不典型,有超過70%的肝癌患者發(fā)現(xiàn)即為中、晚期,失去了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)[2],這嚴(yán)重影響了肝癌患者的總體預(yù)后.因此,肝癌的非手術(shù)治療顯得尤為重要.近距離放射治療不受腫瘤位置和大小影響,適用于大多數(shù)的肝癌患者[8],其植入的放射性粒子能夠精準(zhǔn)、持續(xù)地發(fā)出射線,從而殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤的生長(zhǎng).131I因其可在短距離衰減并在目標(biāo)部位保持較高的累計(jì)計(jì)量,且能減少鄰近正常組織損害等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療[9].有研究發(fā)現(xiàn),與單獨(dú)應(yīng)用射頻消融術(shù)相比,聯(lián)合應(yīng)用放射性125I可顯著降低小肝癌的復(fù)發(fā)率并延長(zhǎng)其生存期[10].ELP是一種新型生物醫(yī)學(xué)材料,因其可逆溫敏相變性、良好的組織相容性、可降解性等優(yōu)點(diǎn),一直是近年來藥物載體、藥物控釋研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[11,12].我們的前期研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用ELP作為一種內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)的黏膜注射液,可持久地維持黏膜厚度并減少出血量,有利于黏膜的剝離和切除[13].凝膠狀的ELP在體內(nèi)可以存留7 d以上,131I的有效半衰期為3.5-5 d,一般4個(gè)半衰期后放射性殘留基本消失,根據(jù)SPECT/CT顯示,治療14 d后131I仍持續(xù)位于腫瘤內(nèi).ELP這一特性大大減少了放射性物質(zhì)的遷移,從而更精準(zhǔn)地殺傷腫瘤細(xì)胞.使用131I-ELP對(duì)人前列腺癌裸鼠移植癌進(jìn)行近距離放射治療,發(fā)現(xiàn)植入一周后131I-ELP的瘤內(nèi)保存率高達(dá)85%,131I-ELP能有效延緩腫瘤生長(zhǎng)及延長(zhǎng)裸鼠的生存時(shí)間[6].動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以ELP為載體攜帶131I對(duì)兔VX2肝癌進(jìn)行放射性治療可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)并改善肝功能[14].本次研究在B超引導(dǎo)下將放射性131I-ELP直接注入動(dòng)物的肝腫瘤內(nèi),不經(jīng)血液循環(huán)代謝,提高了131I在腫瘤局部的治療效果.分析實(shí)驗(yàn)中的TGR結(jié)果發(fā)現(xiàn),與C組相比,100 mCi/mL、50 mCi/mL兩種放射性濃度的131I-ELP均可抑制腫瘤生長(zhǎng),且放射性濃度較高的H組的腫瘤抑制效果更強(qiáng).分析治療前后血中AST、ALT水平的變化,發(fā)現(xiàn)在治療后7 d,H、L組的AST、ALT水平升高而后在治療后14 d下降,原因可能為131I的有效半衰期為3.5-5 d,放射性核素的第一個(gè)半衰期殺傷作用最強(qiáng),使癌旁正常肝細(xì)胞變性壞死,因此,ALT、AST出現(xiàn)短暫上升,隨著放射性核素的衰減,ALT、AST水平逐漸下降,因此,我們認(rèn)為131I-ELP可改善肝功能的惡化,其中放射性濃度為50 mCi/mL的L組的治療效果更佳,鏡下觀察病理組織切片發(fā)現(xiàn),H組的癌旁正常肝組織破壞較L組嚴(yán)重,分析原因可能為100 mCi/mL的H組對(duì)癌旁正常組織的損傷更大.分析治療前后血Hb、RBC含量發(fā)現(xiàn),131I-ELP無骨髓抑制等副作用.比較實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存期可見,131I-ELP放射性治療可延長(zhǎng)肝癌動(dòng)物的生存時(shí)間,且放射性濃度越高,生存期越長(zhǎng).

圖2 瘤內(nèi)注射131I-類彈性蛋白多肽的過程.A：B超顯示穿刺針已刺入腫瘤內(nèi)部;B：向瘤內(nèi)注射藥物的操作.

圖3 高放射性濃度治療組和低放射性濃度治療組治療后的SPECT/CT圖像.A：治療后7 d的SPECT/CT 圖像;B：治療14 d后的SPECT/CT圖像.H組：高放射性濃度治療組;L組：低放射性濃度治療組.

圖4 三組動(dòng)物治療后7 d(A)、14 d(B)的腫瘤增長(zhǎng)率.TGR：腫瘤增長(zhǎng)率;H組：高放射性濃度治療組;L組：低放射性濃度治療組;C組：對(duì)照組.aP＜0.05,與H組比較;cP＜0.05,與L組比較.

圖5 三組治療后7 d、14 d的ALT與AST水平.A：治療后7 d ALT水平;B：治療后14 d ALT水平;C：治療后7 d AST水平;D：治療后14 d AST水平.AST：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;H組：高放射性濃度治療組;L組：低放射性濃度治療組;C組：對(duì)照組.aP＜0.05,與H組比較;cP＜0.05,與L組比較.

圖6 三組動(dòng)物的自然生存時(shí)間.H組：高放射性濃度治療組;L組：低放射性濃度治療組;C組：對(duì)照組.aP＜0.05,與H組比較;cP＜0.05,與L組比較.

圖7 肝臟腫瘤大體標(biāo)本.

表1 藥物注射體積和131I的放射性活度

圖8 三組肝臟腫瘤HE染色結(jié)果.A：高放射性濃度治療組;B：低放射性濃度治療組;C：對(duì)照組.

總之,131I-ELP可抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、延緩肝功能的惡化、延長(zhǎng)動(dòng)物生存時(shí)間且無骨髓抑制等副作用,說明131I-ELP近距離放射療法對(duì)兔VX2肝癌具有肯定的療效;其中放射性濃度為100 mCi/mL的131I-ELP抑癌效果更強(qiáng),但也對(duì)癌旁正常肝組織造成了更大的傷害.因此,還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化放療藥物的濃度或增加治療頻率,使131I-ELP對(duì)肝癌的近距離放射療法的安全性和有效性達(dá)到平衡,令患者獲得最大的收益.

表2 治療前的腫瘤大小

表3 治療前基線肝功能、血常規(guī)數(shù)值

表4 治療后7 d、14 d Hb和RBC計(jì)數(shù)

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

近距離放射性治療是一種將放射性粒子植入腫瘤組織內(nèi)以精準(zhǔn)殺傷腫瘤細(xì)胞的治療手段,但植入與移除操作復(fù)雜、植入粒子易遷移等缺點(diǎn)限制了它的應(yīng)用,因此,迫切需要一種新的給藥系統(tǒng)以替代傳統(tǒng)的放射性治療方法.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本研究擬通過尋找一種植入和移除操作過程簡(jiǎn)便、安全性較高的物質(zhì)作為放射性核素的載體,以開發(fā)出傳統(tǒng)近距離放射治療的替代方案.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探索不同放射性濃度131I-類彈性蛋白多肽(elastin-like peptide,ELP)近距離放射治療對(duì)VX2肝癌的有效性及差異性,為肝癌的治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

實(shí)驗(yàn)方法

本研究采用Iodogen法用131I對(duì)ELP標(biāo)記,在B超引導(dǎo)下將不同濃度的131I-ELP注入到兔的肝腫瘤內(nèi)進(jìn)行近距離放射性治療,定期進(jìn)行影像學(xué)和生化監(jiān)測(cè)以評(píng)估不同濃度131I-ELP的治療效果.該方法操作簡(jiǎn)便、定位精準(zhǔn),安全可靠,有望成為近距離放射性治療的新方法.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

影像學(xué)和生化監(jiān)測(cè)結(jié)果表明,131I-ELP進(jìn)行近距離放射治療可顯著改善肝功能和抑制腫瘤生長(zhǎng),高放射濃度治療組抑制腫瘤的效果更強(qiáng),但其對(duì)癌旁正常組織的損傷也更大.該研究為ELP作為131I的載體近距離放射性治療肝癌的可行性和治療劑量提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

131I-ELP具有較高的標(biāo)記率和體外穩(wěn)定性,應(yīng)用131I-ELP進(jìn)行肝腫瘤的近距離放射治療是高效、安全的治療方法.100 mCi/mL的高放射濃度組抑制腫瘤的效果更佳,但放射性損傷更大.本研究為腫瘤的近距離放射治療提供了新思路,有潛在的應(yīng)用價(jià)值.

展望前景

本研究發(fā)現(xiàn)高放射濃度組抑制腫瘤的效果更佳,但放射性損傷更大,應(yīng)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步優(yōu)化放射性核素的劑量,同時(shí)在分子水平等更深層次上探討131I-ELP對(duì)腫瘤的影響.