山西老陳醋高產(chǎn)糖化酶霉菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

王佳麗，朗繁繁，陳旭峰，王如福，許 女*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801；2.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，山西 太原 030400；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實驗教學(xué)中心，山西 晉中 030801）

山西老陳醋素有“天下第一醋”的盛譽[1]，以其“酸醇厚、味清香、回味綿、質(zhì)濃稠、色紫檀和久貯不變質(zhì)”的特色深受廣大消費者喜愛[2]。大曲中因含蛋白酶、糖化酶、纖維素酶等幾十種酶類與霉菌、酵母菌等微生物而素有“曲是醋中骨”之稱，其在山西老陳醋的釀造中起到重要的作用。大曲中的霉菌在生長代謝過程中會產(chǎn)生豐富的酶系，尤其是糖化酶，是食醋釀造過程中的重要糖化劑。除了糖化酶，霉菌也會產(chǎn)生一定的蛋白酶，分解原料中的蛋白質(zhì)生成各種氨基酸和多肽，此類物質(zhì)的含量是成品食醋質(zhì)量優(yōu)劣的一個標(biāo)準[3]。纖維素酶則可使食醋釀造原料中的纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性的糖，從而增加了原料中可利用的碳源，還可以破壞原料中的細胞壁結(jié)構(gòu)促進淀粉的溶出，這有利于糖化酶更好地進行糖化[4]。

近年來，一些學(xué)者對大曲及釀造中的優(yōu)良霉菌進行了一些篩選、鑒定、產(chǎn)酶條件優(yōu)化及糖化酶基因等研究工作。張琳等[5]用Martin培養(yǎng)基對大曲中的霉菌進行分離，分別以透明圈和酶活大小進行初篩和復(fù)篩獲得高產(chǎn)糖化酶菌株，其中菌株M6糖化酶活力最高，酶活可達3912.08 U/mL。劉茗銘等[6]從曲中篩選高產(chǎn)糖化酶菌株，通過單因素試驗和正交試驗，確定固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶最佳條件為：糠殼添加量4%、接種量1.25%、初始pH值為5.5、料水比5∶3（g∶mL），在30℃條件下培養(yǎng)72 h，其糖化酶活性高達1 791.3 U/g。唐國敏等[7]報道，經(jīng)多次誘變獲得的黑曲霉T21，其糖化酶基因編碼區(qū)序列與BOEL E等[8]報道的黑曲霉糖化酶基因編碼區(qū)序列一致，黑曲霉突變菌株T21中穩(wěn)定態(tài)糖化酶信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）含量非常高，這可能是菌株T21糖化酶高產(chǎn)的重要原因之一。

本研究主要從山西老陳醋大曲中分離篩選高產(chǎn)糖化酶的菌株，對其產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶的能力進行分析，并對其糖化酶基因進行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增、序列比對和氨基酸序列預(yù)測，初步探討菌株高產(chǎn)酶活的基因機制，為其進一步基因工程育種研究奠定基礎(chǔ)；在此基礎(chǔ)上還對產(chǎn)酶搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，為山西老陳醋釀造專用酶制劑的開發(fā)進行研究基礎(chǔ)積累。高產(chǎn)糖化酶霉菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化為定向選育、定向調(diào)控提供理論依據(jù)，對山西老陳醋釀造專用酶制劑的開發(fā)及山西老陳醋的提質(zhì)增效具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 霉菌菌株

75株霉菌：分離自山西老陳醋大曲，保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程實驗室。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖、蛋白胨、瓊脂（均為生化試劑）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；Maker D、mix：上海生工生物工程股份有限公司；PCR引物：北京六合華大基因科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[6]、產(chǎn)糖化酶篩選培養(yǎng)基[5]、麩皮培養(yǎng)基[9]。

液體發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基：麩皮3%，（NH4）2SO40.4%，KH2PO40.2%，MgSO4 0.03%，CaCl20.03%，pH 5.5。1×105Pa滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-9100紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；Eppendorf離心機：艾本德（中國）有限公司；T100 PCR儀、Universial HoodⅡ型凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一儀器廠；ZQPL-200立式全溫振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；DHP-500電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京市光明醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)糖化酶霉菌的篩選

將75株霉菌菌株分別接種到產(chǎn)糖化酶篩選培養(yǎng)基上，于30℃靜置培養(yǎng)48 h，向產(chǎn)糖化酶篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中加入4 mL盧戈氏碘液進行染色，分別測量透明圈的大??；用生理鹽水沖洗PDA培養(yǎng)基上的霉菌孢子，制備孢子濃度為106個/mL的孢子懸液，將各霉菌孢子懸液均按2%（V/V）接種量接種于麩皮培養(yǎng)基中，30℃發(fā)酵3 d，取樣，采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[10]測定糖化酶的活力。糖化酶酶活定義：1 g酶粉于40℃、pH 4.6條件下，每小時水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位（U/g）。

1.3.2 高產(chǎn)糖化酶霉菌的篩選

將篩選出的產(chǎn)糖化酶較高的霉菌菌株按照1.3.1方法制備樣品，分別采用福林比色法[10]、DNS比色法[11]測定蛋白酶、纖維素酶的活力。

蛋白酶的酶活定義：1 g固體酶粉在40℃（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、堿性pH=10.5）條件下，每分鐘水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位（U/g）。

纖維素酶的酶活定義：1g固體酶粉在40℃和pH值4.2條件下，每分鐘水解纖維素生成1μg的量為一個酶活單位（U/g）。

1.3.3 高產(chǎn)糖化酶霉菌的鑒定

對篩選出的高產(chǎn)糖化酶霉菌菌株進行觀察并記錄菌落的顏色及形態(tài)[12]，以及在顯微鏡下觀察菌絲體特征及孢子形態(tài)，對菌株進行菌種的初步鑒定[13]。

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法[14]提取基因組。并以此為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系和條件見參考文獻[15]，PCR反應(yīng)以ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）為ITS基因序列的上下游引物，用以對ITS序列進行擴增鑒定菌株。擴增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）數(shù)據(jù)庫中序列進行比對。

1.3.4 高產(chǎn)糖化酶霉菌的糖化酶基因擴增

以1.3.3中所提基因組為模板，按上述方法進行PCR擴增及比對，以P3（5'-CAATGTCGTTCCGAT-3'）和P4（5'-GTCCAGAAGGACTGC-3'）為糖化酶基因序列的上下游引物，用以對糖化酶基因進行擴增。采用NCBI、DNAstar等數(shù)據(jù)庫和軟件，分析糖化酶基因的同源性，推導(dǎo)蛋白的氨基酸序列，并對編碼蛋白的分子質(zhì)量、等電點等性質(zhì)進行預(yù)測。

1.3.5 高產(chǎn)糖化酶霉菌的搖瓶培養(yǎng)

按1.3.1方法將調(diào)整好孢子懸液濃度的霉菌分別按6%接種量接種于裝液量為100 mL/250 mL液體發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min發(fā)酵6 d。將產(chǎn)酶發(fā)酵液于4℃、4000r/min的條件下離心20min，取上清液，測定糖化酶活力。

1.3.6 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化

（1）產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

在液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別改變其中的碳氮源濃度及起始pH值，考查碳源添加量（麩皮1%、2%、3%、4%、5%）、氮源添加量（硫酸銨0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）和起始pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）對發(fā)酵液中的糖化酶活力的影響。通過單因素試驗，選取每個因素中最優(yōu)的3個水平，采用L9（33）正交試驗設(shè)計研究碳源濃度、氮源濃度、起始pH值3個因素對菌株產(chǎn)酶的影響。

（2）產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，分別改變其中的裝液量、接種量及轉(zhuǎn)速，考查裝液量（50 mL/250 mL、75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL）、接種量（4%、6%、8%、10%）和轉(zhuǎn)速（125 r/min、145 r/min、165 r/min、185 r/min）對發(fā)酵液中的糖化酶活力影響。通過單因素試驗，選取每個因素中最優(yōu)的3個水平，采用L9（33）正交試驗設(shè)計研究裝液量、接種量及轉(zhuǎn)速3個因素對菌株產(chǎn)酶的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)糖化酶霉菌的篩選及鑒定

糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶，是一種可將淀粉、糊精、糖原水解為葡萄糖，且有助于酵母分解葡萄糖生成乙醇的酶制劑。在大曲研究中，由于關(guān)系到淀粉的利用，糖化酶活是關(guān)注大曲質(zhì)量的一項重要指標(biāo)[16]。

將分離出的75株霉菌分別接種到產(chǎn)糖化酶篩選培養(yǎng)基上，觀察其透明圈的大小。同時將各霉菌制成孢子懸液，分別接種于麩皮培養(yǎng)基中，經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)后，菌株的糖化酶活力如表1所示。由表1可知，所測霉菌的酶活力差別較大，糖化酶活力最高的霉菌為菌株186，酶活可達4279.11U/g，其次菌株183-2、624-3、2230、896-2、93為糖化酶活力較高的菌株，糖化酶分別為3 963.79 U/g、3 555.73 U/g、3 277.50 U/g、3 027.10 U/g、2 275.89 U/g。

表1 霉菌菌株糖化酶活力測定結(jié)果Table 1 Determination results of saccharifying enzyme activity of mold strains

大曲中除了糖化酶，其中的蛋白酶和纖維素酶對于食醋釀造也起到重要的作用，酸性蛋白酶可溶解發(fā)酵原料顆粒，促進糖化發(fā)酵，降解底物可提供微生物增殖所需的營養(yǎng)小肽、氨基酸等，降解的氨基酸可促進氨基酸的代謝，改善風(fēng)味成分，提高乙醇濃度[17]；纖維素酶可降解原料中的纖維素，促進淀粉和蛋白的降解，提高發(fā)酵率[18]。因此，在篩選高產(chǎn)糖化酶菌株的同時考慮蛋白酶和纖維素酶顯得尤為重要。

將上述篩選的產(chǎn)糖化酶最高的6株霉菌進行蛋白酶和纖維素酶活力的測定，酶活力測定結(jié)果如表2所示。由表2可知，菌株186的三種酶活均較高，其蛋白酶和纖維素酶活力分別可達到368.80 U/g和4 476.60 U/g，除了菌株896-2的蛋白酶活力（377.09 U/g）略高于菌株186，其余菌株的蛋白酶活力顯著低于菌株186（P＜0.05），而菌株896-2的纖維素酶（2 806.34 U/g）卻顯著低于菌株186（P＜0.05），因此，菌株186不僅高產(chǎn)糖化酶，且高產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶，是高產(chǎn)3種酶的優(yōu)良菌株。

表2 霉菌菌株糖化酶、蛋白酶及纖維素酶酶活力測定結(jié)果Table 2 Determination results of saccharifying enzyme,protease and cellulase activity of mold strains

經(jīng)篩選后得到高產(chǎn)酶的菌株186，對其進行形態(tài)觀察，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株186在PDA培養(yǎng)基上生長的相對較快，但生長蔓延較為局限。生長初期菌絲為白色，后逐漸變?yōu)轷r黃色直至變?yōu)楹窠q狀的駝色，較干燥，菌落外有同心的白色圓圈，菌落背面為淡黃褐色。在PDA液態(tài)培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)時，培養(yǎng)1 d后形成白色菌絲體小球，于顯微鏡下觀察菌絲體，可觀察到菌絲分枝繁茂且具有橫隔，菌絲無色透明。顯微鏡下觀察孢子，可觀察到分生孢子梗無色，頂部形成球形的孢子囊，孢子囊上對生小梗，上長有的分生孢子呈球形、褐色輪廓。

圖1 菌株186的菌落形態(tài)、菌絲體形態(tài)、孢子囊及孢子梗形態(tài)Fig.1 Colonial morphology,mycelial morphology,sporangia and sporophore morphology of strain 186

提取菌株186基因組并對ITS序列進行PCR擴增，測序序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列進行比對，下載相近菌株的基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，其ITS序列系統(tǒng)進化樹見圖2。由圖2可知，菌株186在系統(tǒng)進化樹上與黑曲霉（Aspergillus niger）同屬于一個分支，與黑曲霉Aspergillus nigerstrain B4/1/VF（登錄號KX901281.1）等的相似度極高，可達100%，結(jié)合形態(tài)觀察，由此推斷，菌186屬于黑曲霉（Aspergillus niger）。

圖2 菌株186 ITS序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain 186 based on ITS sequences

本試驗篩選出的黑曲霉186糖化酶活力顯著高于王旭亮等[19]從不同大曲中分離的黑曲霉在大麥豌豆純種曲培養(yǎng)基中于25℃條件下培養(yǎng)7d的糖化酶活力（495.10～708.5U/g）（P＜0.05）；蛋白酶活則與黃永光[20]從白酒釀造過程中分離的黑曲霉lsq21菌株在麩曲培養(yǎng)基中的蛋白酶活力（373.49 U/g）相近；黑曲霉186纖維素酶活力明顯高于李蘭曉[21]研究的黑曲霉的纖維素酶活力（759.9±51.7）U/g。綜合分析，黑曲霉186在產(chǎn)酶方面表現(xiàn)優(yōu)良。

2.2 高產(chǎn)糖化酶霉菌的糖化酶基因序列分析

將黑曲霉186的糖化酶基因進行PCR擴增，其糖化酶基因PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果如圖3所示，其擴增條帶單一，亮度較高。將產(chǎn)物測序所得序列申請登錄號，為MK641588，該基因的DNA序列開放閱讀框長度為1449bp，該基因鳥嘌吟（Guanine）+胞嘧啶（Cytosime）含量為57.76%，NCBI搜索比對后發(fā)現(xiàn)，該基因與黑曲霉TCCC41661糖化酶基因（登錄號：KM488271.1）序列同源性達到100%。用DNAstar軟件推導(dǎo)氨基酸序列，詳細序列見圖4。由圖4可知，該基因編碼的酶蛋白由482個氨基酸組成。軟件預(yù)測出該酶的分子質(zhì)量約為51.75 kDa，等電點為3.99。

圖3 黑曲霉186糖化酶基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification product of saccharifying enzyme gene ofAspergillus niger186

圖4 黑曲霉186糖化酶基因推導(dǎo)出的氨基酸序列Fig.4 Amino acids sequences derived from saccharifying enzyme gene ofAspergillus niger186

2.3 高產(chǎn)糖化酶霉菌的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1 產(chǎn)糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

碳源、氮源添加量及起始pH值對糖化酶活力的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著碳源中麩皮含量、氮源中硫酸銨含量以及初始pH值的增加，發(fā)酵液中糖化酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在碳源中麩皮含量為4%、氮源中硫酸銨含量為1.0%和起始pH值為7.0時，菌株186的糖化酶活力最高。

圖5 培養(yǎng)基及發(fā)酵條件對黑曲霉186糖化酶活力的影響Fig.5 Effect of medium and fermentation conditions on the saccharifying enzyme activity ofAspergillus niger186

通過單因素試驗，選取每個因素中最優(yōu)的3個水平，即碳源濃度（麩皮含量分別為3%、4%、5%）、氮源濃度（硫酸銨含量分別為0.5%、1.0%、1.5%）和起始pH值（6.0、7.0、8.0），采用L9（33）正交試驗研究碳源濃度、氮源濃度、起始pH值3個因素對菌株產(chǎn)酶的影響，正交試驗結(jié)果見表3。由表3可知，產(chǎn)糖化酶的最優(yōu)培養(yǎng)基條件組合為A2B1C2，即麩皮4%，硫酸銨0.5%，初始pH值為7.0。在此優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，糖化酶活力為898.45 U/mL。

表3 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for medium optimization

續(xù)表

2.3.2 產(chǎn)糖化酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

裝液量、接種量及轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液中的糖化酶活力影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著裝液量、接種量及轉(zhuǎn)速的增加，發(fā)酵液中糖化酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在裝液量為100 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速為145 r/min、接種量為6%的條件下，菌株186的糖化酶活力最高。

通過單因素試驗，選取每個因素中最優(yōu)的3個水平，即裝液量（75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL）、轉(zhuǎn)速（125 r/min、145 r/min、165 r/min）和接種量（4%、6%、8%），采用L9（33）正交試驗研究裝液量、接種量及轉(zhuǎn)速3個因素對菌株產(chǎn)酶的影響，正交試驗結(jié)果見表4。由表4可知，最佳發(fā)酵條件組合為A2B2C3，即裝液量100 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速145 r/min，接種量8%。在此最佳發(fā)酵條件下，糖化酶活力為890.56 U/mL。

表4 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

采用上述優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝，于30℃搖床培養(yǎng)7 d后黑曲霉186的糖化酶活力可達892.98 U/mL，是優(yōu)化前的1.77倍。

3 結(jié)論

本研究以分離自山西老陳醋大曲中的霉菌為研究對象，篩選出1株高產(chǎn)糖化酶的菌株，并且測定結(jié)果顯示，其產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶的能力也較強，為一株集多種酶活于一身的高產(chǎn)優(yōu)良菌株，對其糖化酶基因進行PCR擴增、序列比對，該糖化酶基因組DNA序列編碼區(qū)長1 449 bp，與黑曲霉TCCC41661糖化酶基因（登錄號：KM488271.1）編碼區(qū)序列一致，共編碼482個氨基酸，預(yù)測出該酶的分子質(zhì)量約為51.75 kDa，等電點為3.99。通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化液態(tài)培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，得出最優(yōu)的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件為：麩皮4%，硫酸銨0.5%，初始pH值為7.0，接種量8%，裝液量100 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速145 r/min，在此優(yōu)化條件下培養(yǎng)7 d后，黑曲霉186糖化酶活力可達892.98 U/mL，是優(yōu)化前的1.77倍。