斯伯特酒花對葡萄酒抗氧化活性的影響

康 玨，段麗麗*，戢得蓉，唐菊蓮，楊曉儀

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院 組織人事處，四川 成都 610100；2.四川旅游學(xué)院 食品學(xué)院，四川 成都 610100）

啤酒花（Humulus lupulusL.）學(xué)名蛇麻，又稱香蛇麻、蛇麻草、忽布，是蕁麻目大麻科草屬多年生草本植物，簡稱酒花[1-2]。酒花是啤酒釀造過程中必不可少的原料，不僅能賦予啤酒獨(dú)特的風(fēng)味，還具有防腐抑菌功能，被譽(yù)為“啤酒的靈魂”，同時(shí)具有抗腫瘤、降血糖、健胃、消食、利尿等功效[3-4]，其主要化學(xué)成分為樹脂類、揮發(fā)油、多酚類、黃酮類等[5]，并且其中同綠茶和葡萄多酚一樣具有前途功能性成分的多酚物質(zhì)含量占啤酒花總質(zhì)量的4%～14%[6-8]，如異戊烯基查爾酮，具有廣譜抗菌、抗氧化等作用[9]。近年來，啤酒花抗氧化性的研究越來越多，在一些抗癌機(jī)理研究中啤酒花展現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化活性，也有報(bào)道顯示，酒花中的多酚能消除羥基自由基、超氧陰離子等，且清除能力強(qiáng)于Trolox。另外其化學(xué)組成中的含硫化合物和酚酸也有助于提高酒花的天然抗氧化能力。

隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人們對飲食健康的重視，保健類飲品越來越成為消費(fèi)者的首選。因葡萄酒中含有大量的酚類物質(zhì)，故適量飲用能預(yù)防脈粥樣硬化、心腦血管等疾病的發(fā)生并起到保健的作用[10-12]。葡萄酒長期以來都是用添加SO2來延長保質(zhì)期，但過量的SO2不僅影響葡萄酒的品質(zhì)，而且會對人體健康造成危害，特別是對含有SO2的葡萄酒過敏的群體，如哮喘病患者[13]。有研究顯示，規(guī)定添加量條件下，SO2并不能在紅葡萄酒中表現(xiàn)出較好的抗氧化性，因此，尋找一種能替代或是能較少添加SO2的抗氧化物質(zhì)極為重要。目前，國內(nèi)外對葡萄酒中的新型抗氧化劑研究甚多，但是將酒花的抗氧化活性在葡萄酒中的應(yīng)用未見報(bào)道。

由于斯伯特酒花在眾多酒花種類中的抗氧化性最高，抗氧化活性范圍為70%～80%[14]，因此，本實(shí)驗(yàn)將其應(yīng)用于葡萄酒中，研究斯伯特酒花添加量對葡萄酒抗氧化活性和葡萄酒品質(zhì)的影響，篩選出最佳的酒花添加量，為提升葡萄酒的品質(zhì)和衍生酒花資源的生產(chǎn)鏈提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄：成都金滿堂農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；斯伯特酒花：河南省帕洛丁貿(mào)易有限公司；果膠酶（50 000 U/g）：寧夏和氏壁生物技術(shù)有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司。

檸檬酸、磷酸氫二鈉、無水乙醇、無水碳酸鈉、干沒食子酸、甲醇、過硫酸鉀（均為分析純）：成都潤澤本土化工有限公司；2,2-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽[2,2'-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate），ABTS）]：上海安耐吉化學(xué)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH）：日本TCL公司；水溶性維生素E（Trolox）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司第一分公司；福林肖卡試劑：廈門海標(biāo)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-BlueStarA紫外-可見分光光度計(jì)：北京萊博泰科儀器有限公司；DK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；ScoutSE電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；101-0型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酒花浸出物的制備

取200mL蒸餾水加熱至100℃且保持2 min，加入0.20 g斯伯特酒花，熬制4 min，待其冷卻后過濾，濾液備用。

1.3.2 酒花葡萄酒釀造工藝及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

選取成熟度高、無霉?fàn)€變質(zhì)及無病蟲害的新鮮葡萄，清水沖洗、去皮以及取出葡萄籽，除梗，將其破碎。根據(jù)果漿的質(zhì)量添加果膠酶，50℃條件下水浴酶解2 h。將酒花浸出物按不同比例加入，使其浸漬并參與之后的葡萄酒發(fā)酵過程。過濾澄清，添加糖調(diào)整酒樣總糖度至22°Bx。接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的酵母，在20～25℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)葡萄酒酒體表面無明顯氣泡產(chǎn)生，酵母生長量、殘?zhí)呛颗c酒精度等趨于穩(wěn)定說明主發(fā)酵結(jié)束。主發(fā)酵結(jié)束后，將葡萄酒靜置澄清、過濾，移入新的發(fā)酵容器于5℃進(jìn)行低溫陳釀，陳釀結(jié)束后移入容器貯存。

1.3.3 酒花添加量的優(yōu)化

因考慮不同酒花浸出物添加量對葡萄酒抗氧化活性的影響，在進(jìn)行葡萄酒釀造時(shí)，設(shè)置四個(gè)酒花添加量比例（酒花浸出物∶葡萄酒）為1∶10、1∶8、1∶6、1∶4，分別編號為處理1、處理2、處理3、處理4。以未添加酒花浸出物的酒樣為空白對照CK，發(fā)酵結(jié)束后，在自然氧化期間第0、30、60、90、120、150天時(shí)取樣，檢測總酚含量、褐變程度及抗氧化活性及感官指標(biāo)，通過分析優(yōu)化出酒花浸出物的最佳添加量。

1.3.4 總酚含量測定

采用福林-酚（Folin-Ciocalteu）法[15]。取1mL被稀釋10倍后的葡萄酒酒樣置于100 mL容量瓶中，依次加入5.0 mL福林肖卡試劑和15mL20%碳酸鈉溶液，用去離子水定容至100mL，將混合液在室溫避光條件下反應(yīng)2h后于波長760nm處測定吸光度值。再代入回歸方程計(jì)算總酚含量，結(jié)果用沒食子酸等價(jià)表示，單位為mg/L沒食子酸。

1.3.5 褐變程度測定

褐變程度測定采用吸光值法[16]。采用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH=3.2）調(diào)零，使用紫外-可見分光光度計(jì)分別檢測各酒樣在波長520nm、420nm處的吸光度值。以A520nm值代表酒樣氧化后的紅色色調(diào)，A420nm值代表褐變程度。

1.3.6 ABTS自由基清除能力[17-18]

于波長734 nm處測定酒樣的吸光度值，以Trolox建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程后計(jì)算ABTS自由基清除能力，結(jié)果以Trolox當(dāng)量抗氧化能力（Trolox equilent antioxidant capacity，TEAC）值表示，單位為μmol/L。

1.3.7 DPPH自由基清除能力[19]

取0.1mL稀釋后的酒樣加入3.9mLDPPH甲醇溶液中，避光反應(yīng)20 min，同時(shí)以無水乙醇為空白，于波長517 nm處測定吸光度值，結(jié)果以Trolox當(dāng)量抗氧化能力（TEAC）值表示，單位為μmol/L。

1.3.8 感官評價(jià)

請10名對葡萄酒具有鑒賞能力的消費(fèi)者，參照《“亞洲葡萄酒質(zhì)量大賽（靜止葡萄酒）”品嘗記錄表》及葡萄酒品嘗相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[20-21]，對斯伯特酒花葡萄酒的香氣、口感、外觀以及整體進(jìn)行評分和描述性分析。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010處理并用SPSS21.0對總酚含量和抗氧化活性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚含量變化

按照沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.000 9x-0.058 6計(jì)算各酒樣總酚含量，結(jié)果見圖1。由圖1可知，各酒樣總酚含量在150 d后都有所下降，從自然氧化第0天的296.22～312.88 mg/L下降至第150天的259.91～277.14 mg/L，處理4的酒樣變化最小，僅為22.39 mg/L。加入了斯伯特酒花的樣品在試驗(yàn)階段，總酚含量均高于空白對照，處理4的總酚含量分別是空白對照、1∶10、1∶8、1∶6葡萄酒的1.07、1.05、1.04和1.02倍，且長時(shí)間儲存后變化最小，進(jìn)一步說明斯伯特酒花的加入能延緩葡萄酒總酚含量的降低。

圖1 酒樣總酚含量的變化Fig.1 Changes of total phenol content in wine samples

2.2 褐變程度變化

總酚類物質(zhì)中的花色苷決定著葡萄酒顏色和色度，不同儲存時(shí)間的酒樣在波長420 nm和520 nm處的吸光度值見圖2。

圖2 酒樣紅色色調(diào)及褐變程度隨時(shí)間的變化Fig.2 Changes of wine red and browning degree with time

由圖2a可知，各酒樣紅色色調(diào)（A520nm）整體呈現(xiàn)出下降趨勢，其原因在于游離花色苷向聚合花色苷的轉(zhuǎn)變加上在緩慢的自然氧化過程中沒有大量醌類物質(zhì)生成。葡萄酒褐變的原理多認(rèn)為是酒中的酚類物質(zhì)被氧氣成醌和H2O2，再進(jìn)行縮聚反應(yīng)生成褐色素。在試驗(yàn)過程中，氧氣的進(jìn)入使得葡萄酒氧化；由圖2b可知，酒樣的褐變（A420nm）趨勢為先下降后增加最后又降低，加入斯伯特酒花的酒樣整體褐變程度均小于空白對照組，斯伯特酒花的存在使得酒樣中還原性酚類物質(zhì)增加，使醌和其他聚合物又被還原為酚從而減緩了酒樣的氧化褐變，通過比較不同處理酒樣的褐變程度，效果最好的為處理4。

2.3 ABTS自由基清除能力變化

ABTS自由基清除能力實(shí)驗(yàn)是測定化合物抗氧化能力的重要方法[22]，ABTS原溶液與過硫酸鉀在室溫黑暗環(huán)境中反應(yīng)12～16 h產(chǎn)生ABTS+自由基，供氫抗氧化劑的存在會使ABTS自由基減少[23]。

酒樣ABTS自由基清除能力的變化結(jié)果見圖3。由圖3可知，在試驗(yàn)中，各酒樣的ABTS自由基清除能力隨著儲存時(shí)間推移而降低，說明氧化褐變的葡萄酒抗氧化活性呈下降趨勢，TEAC值由第0天的1 662.3～1 771.4 μmol/L下降至第150天的987.1～1 036.2 μmol/L，變化量從大到小的順序?yàn)镃K＞處理1＞處理2＞處理3＞處理4。由此可見，加入了斯伯特酒花浸出物酒樣的ABTS自由基清除能力較空白組更好，自由基的產(chǎn)生與清除的平衡受制于抗氧化物質(zhì)[24]，故斯伯特酒花浸出物的加入可能增加了葡萄酒中的抗氧化物質(zhì)從而提高其自由基清除能力，增強(qiáng)酒樣的抗氧化活性。

圖3 酒樣ABTS自由基清除能力的變化Fig.3 Changes of ABTS free radical scavenging ability of wine samples

2.4 DPPH自由基清除能力變化

酒樣DPPH自由基清除能力的變化見圖4。由圖4可知，隨著儲存時(shí)間的延長，各酒樣清除DPPH自由基的能力先上升后下降，而在試驗(yàn)整個(gè)階段整體上呈下降趨勢，表明氧化褐變的葡萄酒的抗氧化活性總體是呈下降趨勢的，出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因有可能是葡萄酒中的抗氧化物質(zhì)含量的降低以及氧氣的影響。在試驗(yàn)中，各酒樣都呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制DPPH自由基的能力，與空白組相比，加入了斯伯特酒花浸出物的葡萄酒在整個(gè)檢測階段呈現(xiàn)出更好的抑制DPPH自由基的能力。根據(jù)本試驗(yàn)的結(jié)果，認(rèn)為斯伯特酒花浸出物能提高葡萄酒抑制DPPH自由基的能力，其原因可能在于斯伯特酒花豐富的酚類物質(zhì)與葡萄酒相融合，提高了抗氧化能力，具有較好效果的是處理4的斯伯特酒花葡萄酒。

圖4 酒樣DPPH自由基清除能力的變化Fig.4 Changes of DPPH free radical scavenging ability of wine samples

2.5 總酚含量與抗氧化活性指標(biāo)相關(guān)性分析

為了避免偶然因素對葡萄酒抗氧化活性造成的影響，采用ABTS法和DPPH法兩種方法對斯伯特酒花葡萄酒的抗氧化活性進(jìn)行測定。通過軟件SPSS21.0對不同酒樣的總酚含量與抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表1。

表1 不同酒樣總酚與抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between total phenols and antioxidant activity in different wine samples

由表1可知，總酚含量與抗氧化活性指標(biāo)均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），總酚含量與ABTS自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)為0.880～0.924，總酚含量與DPPH自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)為0.862～0.918（P＜0.05），說明酒花葡萄酒的總酚含量是自由基清除能力變化的主要影響因素，與CK對比，添加了斯伯特酒花的酒樣（處理組1～4）的總酚與抗氧化活性的相關(guān)性均高于CK，而在一般情況下，相關(guān)性增強(qiáng)，其酚類化合物對抗氧化能力亦隨之提高[25]，故在葡萄酒釀造過程加入斯伯特酒花能夠增強(qiáng)酒樣的抗氧化活性，可能是因?yàn)榫苹ㄖ懈吆康姆宇愇镔|(zhì)在發(fā)酵過程能夠增加酒樣的總酚含量，效果最好的為處理4。

2.6 感官評價(jià)

經(jīng)過150 d的自然氧化后，各酒樣的感官品質(zhì)評價(jià)結(jié)果見表2。由表2可知，經(jīng)過150 d的自然氧化后，各酒樣的品質(zhì)整體偏低。以葡萄酒的感官評分作為評價(jià)指標(biāo)，隨著斯伯特酒花浸出物添加量的增加，酒樣口感受到影響，感官質(zhì)量有所提高，斯伯特酒花獨(dú)特的香味融入到葡萄酒中，使得葡萄酒呈現(xiàn)出獨(dú)特的酒花香味。斯伯特酒花中大量的抗氧化物質(zhì)讓葡萄酒的氧化延緩，故加入了斯伯特酒花浸出物的酒樣整體得分高于空白對照組，且斯伯特酒花浸出物添加越多，感官提高效果越佳，最優(yōu)的為處理組4。

表2 酒樣的感官品質(zhì)Table 2 Sensory quality of wine samples

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過酒花浸出物的不同添加量對葡萄酒自然氧化階段葡萄酒各項(xiàng)指標(biāo)影響的研究，探索葡萄酒中最佳的酒花添加量，為酒花在葡萄酒的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。研究結(jié)果表明：

（1）在自然氧化150 d后，酒花添加量最多（酒花浸出物∶葡萄酒=1∶4）的葡萄酒總酚含量平均達(dá)到304.20 mg/L沒食子酸，分別是空白對照、酒花浸出物∶葡萄酒1∶10、1∶8、1∶6酒樣的1.07、1.05、1.04和1.02倍，說明酒花浸出物添加比例為1∶4的酒樣總酚含量最高，且長時(shí)間儲存后其總酚含量降低程度亦最小，進(jìn)一步體現(xiàn)了斯伯特酒花的加入能延緩總酚含量的降低。

（2）在試驗(yàn)期間，酒樣紅色色調(diào)呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，酒樣的褐變程度為先下降后增加最后又降低，從整體上看，加入斯伯特酒花的酒樣整體褐變程度均小于空白對照組。

（3）各酒樣的ABTS自由基清除能力和抑制DPPH自由基能力均隨著時(shí)間推移而降低，加入斯伯特酒花浸出物的酒樣自由基清除能力較空白組更好，且酒花添加比例為1∶4的酒樣抗氧能力提高效果最佳。

（4）酒樣總酚含量與抗氧化活性指標(biāo)均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），總酚含量與ABTS自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)為0.880～0.924，與DPPH自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)為0.862～0.918（P＜0.05），說明酒花葡萄酒的總酚含量是自由基清除能力變化的主要影響成分，且處理組1～4的相關(guān)性均高于CK，進(jìn)而說明酒花的添加能增強(qiáng)葡萄酒的抗氧化活性。

（5）感官評價(jià)表明，經(jīng)過150 d的自然氧化后，各酒樣的品質(zhì)整體偏低，斯伯特酒花浸出物添加量的增加對各酒樣感官評分有促進(jìn)作用，酒花浸出物與酒添加量比例為1∶4時(shí)感官評分最高，為75分，未添加酒花的葡萄酒最低。故斯伯特酒花浸出物添加越多，感官提高效果越佳。