納米銀對(duì)銅綠假單胞菌及希瓦氏菌的抗性實(shí)驗(yàn)

劉奇杰

摘 要：目的：研究納米銀和對(duì)特定菌種的抗菌性能，闡述了納米銀和納米纖維抗菌作用效果。方法：（1）微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，采用瓊脂培養(yǎng)基，在生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18-24h，然后在顯微鏡下觀察微生物的菌落形貌及特點(diǎn);（2）抗菌實(shí)驗(yàn)，主要采用納米銀對(duì)銅綠假單胞菌和希瓦氏菌分別作用，研究納米銀存在的情況下，瓊脂培養(yǎng)基上銅綠假單胞菌的生長情況，同時(shí)通過顯微鏡觀察細(xì)菌的破損情況。結(jié)果：濃度越高的納米銀溶液所得抑菌環(huán)直徑越大，與納米纖維相比抑菌效果更好。結(jié)論：納米銀對(duì)于銅綠假單胞菌和希瓦氏菌都具有較強(qiáng)的抑制作用。

關(guān)鍵詞：納米銀;細(xì)菌培養(yǎng);抗菌實(shí)驗(yàn)

中圖分類號(hào)：Q2-33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2019）06-0246-02

0 引言

近年來，由細(xì)菌和病毒感染引起的發(fā)病率和死亡率普遍增加，患者只能采取強(qiáng)化治療，包括使用廣譜抗生素或藥物。尋找新型抗菌物成為新時(shí)代的新問題。銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的常見病原體，屬于革蘭氏陰性非發(fā)酵桿菌。在球桿或線的形狀中沒有固定的形狀，并且有時(shí)它成對(duì)或短鏈排列。在細(xì)胞的一端存在單個(gè)鞭毛，并且在暗視野顯微鏡或相差顯微鏡下觀察細(xì)菌的移動(dòng)。生長溫度范圍25-42℃，最適生長溫度為25-30℃。[1]由于銅綠假單胞菌屬于傷口部位常見感染細(xì)菌，廣泛存在于環(huán)境以及正常人的呼吸道等處，該菌株具有多種天然和獲得性多藥耐藥機(jī)制。[2]希瓦氏菌（Shewanella）是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，兼性厭氧，具單一極生鞭毛，DNA的G+C含量為43～55mol%， Baumann等人于1972年將其歸至交替單胞菌屬（Al- teromonas）。希瓦氏菌是人和水產(chǎn)動(dòng)物的潛在病原，主要是腐敗功能，給人類健康和水產(chǎn)養(yǎng)殖造成威脅。因此研究如何殺滅這兩種細(xì)菌，具有重要意義。

銀離子的殺菌作用自古以來就是眾所周知的。而銀離子的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，影響其在抗菌中的應(yīng)用。有效的抗菌性能導(dǎo)致所用銀量的顯著減少，這保證了納米銀作為抗菌劑的成本和安全性。[3]試用納米銀作為假單胞菌和希瓦氏菌的抗菌物，為納米銀可促進(jìn)人類健康生活提供依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

瓊脂粉：SIGMA;濾紙：HEPA。

1.2 設(shè)備

生化培養(yǎng)箱;生物安全柜：BIOBASE BSC-1500IIA2-X;顯微鏡：MOTIC DMBA210;掃描電子顯微鏡：TESCAN;電子秤：METTLLER TOLEDO AB104-N;高壓滅菌鍋：BOXUN。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基的制備

配置培養(yǎng)基供細(xì)菌生存，十組培養(yǎng)基大約所需1000毫升的水和28克的瓊脂粉。使用電子秤稱量28g瓊脂粉，用量筒量取1000ml水，將二者在錐形瓶中混合并用電磁攪拌機(jī)攪拌均勻。將制好的溶液放入高壓滅菌鍋滅菌，等其達(dá)到121度時(shí)關(guān)閉蒸汽閥，等待溫度下降后，取出溶液。將溶液倒入備好的培養(yǎng)皿中（該過程在生物安全柜中進(jìn)行），待瓊脂冷卻凝固。

2.2 微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

采用瓊脂培養(yǎng)基，在生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18-24h后在培養(yǎng)基表面蘸取一些菌群浸入溶液中，將希瓦氏菌和銅綠假單胞菌的溶液稀釋，分別用滴管取一滴置于已備好的載玻片上，蓋上蓋玻片，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察微生物的菌落形貌及特點(diǎn)。

2.3 納米銀對(duì)希瓦氏菌的抗性研究

取5μl（10000 CUF/ml）已稀釋的希瓦氏菌液均勻涂抹到備好的瓊脂培養(yǎng)基上。將接種好的培養(yǎng)基至于生物安全柜中保存。再在接種好的培養(yǎng)皿上放置剪好的濾紙圓片（10-20mm），取三種不同濃度0.5*107particles/ml、1.5* 107particles/ml、2.0*107particles/ml的納米銀溶液各2μl分別滴到三個(gè)濾紙圓片上，這三組與未滴加納米銀的對(duì)照組一同放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，控制溫度在33度左右大約24h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.4 納米銀對(duì)銅綠假單胞菌的抗性研究

取5μl（10000 CUF/ml）已稀釋的銅綠假單胞菌接種在瓊脂培養(yǎng)基上至于生物安全柜中保存。再接種好的培養(yǎng)皿上放置剪好的濾紙圓片（直徑10-20mm），取三種不同濃度0.5*107particles/ml、1.5*107particles/ml、2.0*107particles/ml的納米銀溶液各3μl分別滴加在三個(gè)濾紙圓片上，這三組與未滴加納米銀的對(duì)照組一同放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，控制溫度在33度左右大約24h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.5 比較納米銀與納米纖維對(duì)希瓦氏菌的抗菌效果

取同等大小的納米纖維與納米銀置于同一已接種好希瓦氏菌的培養(yǎng)基上，將該培養(yǎng)皿至于生化培養(yǎng)箱內(nèi)控制一定溫度，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。24小時(shí)后取出觀察希瓦氏菌在培養(yǎng)皿上兩種抑菌環(huán)的大小。

3 結(jié)果與討論

3.1 納米銀對(duì)于對(duì)希瓦氏菌的抗性研究結(jié)果

如圖1和表1所示，濃度分別為0、0.5*107、1.5*107、2.0* 107particles/ml的納米銀溶液培養(yǎng)的錫瓦氏菌的培養(yǎng)基上出現(xiàn)的抑菌環(huán)從無到有，并且直徑隨濃度增大而增大。說明納米銀其濃度越高對(duì)希瓦氏菌的抗性越強(qiáng)。

3.2 納米銀對(duì)于假單胞菌的抗性研究結(jié)果

如圖2和表2所示，濃度分別為0、0.5*107、1.5*107、2.0* 107particles/ml 的納米銀溶液培養(yǎng)的假單胞菌的培養(yǎng)基上出現(xiàn)的抑菌環(huán)從無到有，并且直徑隨濃度增大而增大。說明納米銀其濃度越高對(duì)假單胞菌的抗性越強(qiáng)。

3.3 比較納米銀與納米纖維對(duì)希瓦氏菌的抗菌效果結(jié)果

如表3實(shí)驗(yàn)可觀察到納米銀產(chǎn)生抑菌環(huán)（直徑為2.6cm）比納米纖維產(chǎn)生抑菌環(huán)（直徑為1.7cm）大，由此可見納米銀比納米纖維的抗菌效果更明顯，那是什么導(dǎo)致納米纖維具有納米銀同樣的抗菌性但卻沒有同樣的抗菌效果呢？

Ag具有基本抗菌作用，通過圖3TiO2/Ag納米纖維的EDX可分析出Ag元素在納米纖維內(nèi)占比不高，所以其抗菌效果不如純納米銀材料的抗菌效果。

通過圖4透射電鏡圖可觀察到Ag在纖維上的分布在纖維中部較稀疏在纖維邊緣有小的集中因其元素濃度較低導(dǎo)致抗菌效果不如納米銀抗菌效果明顯。

即Ag元素的濃度越高對(duì)菌種的抗性越強(qiáng)，對(duì)于Ag元素分布不均的納米纖維來說應(yīng)從局部的效果考慮。

3.4 抗菌機(jī)理分析

納米級(jí)二氧化鈦具有抗菌、自潔凈功能，同時(shí)納米銀帶正電荷，與帶有負(fù)電荷的菌體蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生靜電吸引，從而吸附在菌體細(xì)胞膜上。納米銀與細(xì)胞壁之間發(fā)生化學(xué)作用并破壞細(xì)胞壁的完整性，在細(xì)胞壁富集電子部位表現(xiàn)更為明顯，導(dǎo)致細(xì)胞壁正常功能喪失，如營養(yǎng)滲透等。以大腸桿菌為對(duì)象，研究納米銀的抗菌作用，用電子顯微鏡觀察看到，納米銀作用后的大腸桿菌有明顯細(xì)胞壁破裂現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來。納米銀顆粒能夠累積在細(xì)胞膜上，攻擊細(xì)胞膜磷脂雙分子層，破壞菌體細(xì)胞膜的性質(zhì)，使膜的通透性發(fā)生改變，大量還原糖和蛋白質(zhì)從菌體內(nèi)泄漏到胞外。將大腸桿菌短期暴露在納米銀中，納米銀會(huì)導(dǎo)致包膜蛋白前體的積累，使菌體中五種包膜蛋白表達(dá)異常。大腸桿菌細(xì)胞膜被破壞，降低其膜電位，細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低，大量新陳代謝所必需的物質(zhì)泄漏，導(dǎo)致了細(xì)菌的死亡。[4]

4 結(jié)論

納米銀的抗菌作用較強(qiáng)，濃度越高其抗菌效果越強(qiáng)。與納米纖維抗菌性對(duì)比其具有較強(qiáng)的抗菌效果，是很好的抗菌材料。納米銀作為一種新型的抗菌和殺菌材料，在普遍的抗藥菌及耐藥菌的抑制方面，具有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1] 蘇甜甜.銅綠假單胞菌鞭毛及生物膜調(diào)控蛋白FleQ和糖苷水解酶Ps1G的結(jié)構(gòu)與功能研究[D].2015.

[2] 何炳洪，譚妙娟，勞小斌.204株銅綠假單胞菌耐藥性分析[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2012，40（4）：397-399.

[3] 曹雪玲，陸書來，張東杰，等.納米銀作為抗菌劑的抗菌性能研究[J].吉林化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2017， 34（11）：30-34.

[4] 王燕，秦社宣，邵永珍，et al.納米銀體外對(duì)三種微生物的抑制作用及機(jī)制[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2018.