免疫球蛋白G4相關(guān)硬化性膽管炎中黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞的免疫生物學(xué)特性

免疫球蛋白G4相關(guān)硬化性膽管炎(IgG4-SC)是一種發(fā)病機(jī)制不明、由異常免疫介導(dǎo)的慢性纖維化自身免疫性疾病，其特征包括：以輔助性T細(xì)胞2(Th2)免疫主導(dǎo)，持續(xù)活化的成熟B淋巴細(xì)胞以及分泌高水平的血清免疫球蛋白G4(IgG4)[1]。IgG4-SC好發(fā)于60歲以上老年男性，目前其診斷尚無金標(biāo)準(zhǔn)，需結(jié)合臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)及病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行確診[2]。黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞(MAIT)是一類固有免疫T細(xì)胞[3]。近年來的研究結(jié)果顯示，MAIT細(xì)胞在自身免疫性疾病及非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中均起到了重要作用[4-6]。目前MAIT細(xì)胞在IgG4-SC中的作用尚不明確，本研究旨在揭示IgG4-SC患者的MAIT細(xì)胞表型變化及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，并探討MAIT細(xì)胞在IgG4-SC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-pague)購自美國GE Healthcare公司，二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，CD3、CD4、CD8、CD161、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、顆粒酶B(GrB)和白細(xì)胞介素-17(IL-17)等流式抗體購自美國BD Biosciences公司，CD8、Vα7.2和CXCR6等流式抗體購自美國BioLegend公司，細(xì)胞固定破膜劑購自美國BD Biosciences公司。

1.2 研究對(duì)象

收集自2016年3月至2018年5月在仁濟(jì)醫(yī)院消化科就診的18例IgG4-SC患者的外周血標(biāo)本。采用2011年日本學(xué)者通過研討會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：(1)影像學(xué)等檢查顯示單個(gè)或多個(gè)器官局灶性或彌漫性腫大或包塊表現(xiàn)；(2)血清學(xué)檢查顯示IgG4水平高于正常值上限(≥135 mg/dL)；(3)肝臟活組織病理檢查顯示大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)伴顯著纖維化，IgG4陽性漿細(xì)胞浸潤(rùn)(判斷標(biāo)準(zhǔn)為IgG4陽性細(xì)胞占IgG陽性細(xì)胞比例>40%或每個(gè)高倍鏡視野下>10個(gè)IgG4陽性漿細(xì)胞)。根據(jù)上述3項(xiàng)檢查結(jié)果，符合(1)+(2)+(3)要求的為確診，符合(1)+(3)要求的為擬診，符合(1)+(2)要求的為疑診。本研究納入的患者均為確診的IgG4-SC患者，且排除其他急、慢性肝病史。18名健康對(duì)照者(HC)的外周血標(biāo)本于2017年1月至2018年1月采集于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院體檢中心檢驗(yàn)科，所有入選標(biāo)本均保證血常規(guī)、血液生物化學(xué)、輸血全套以及甲狀腺功能檢測(cè)結(jié)果無明顯異常，且排除其他急、慢性肝病史。本研究所有入選者均知情同意，本研究方案獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批。

1.3 收集資料

收集IgG4-SC組和HC組的一般資料和實(shí)驗(yàn)室檢查資料。一般資料包括年齡、性別等。實(shí)驗(yàn)室檢查包括：(1)血常規(guī)指標(biāo) 包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血紅蛋白(Hb)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)等；(2)生物化學(xué)指標(biāo) 包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)等；(3)免疫學(xué)指標(biāo) 包括IgG4、IgG等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0及GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)分析，相關(guān)性采用Spearman′s rank correlation分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組的一般情況及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

本研究最終納入18例IgG4-SC患者和18名健康對(duì)照者。兩組中男性均為12例，女性均為6例。IgG4-SC組年齡為30～78歲，HC組年齡為36～67歲。兩組在性別和年齡方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，與HC組相比較，IgG4-SC組的肝損傷較明顯，IgG4-SC組的ALT和AST高于HC組。此外，IgG4-SC組的膽汁淤積也更明顯。詳見表1。

表1 兩組的一般情況及臨床資料比較

注：—為數(shù)據(jù)缺失；與HC組對(duì)比，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.000 1

2.2 兩組的外周血MAIT細(xì)胞頻率比較

在本研究中，外周血MAIT細(xì)胞被定義為CD3+Vα7.2+CD161high淋巴細(xì)胞[8]。通過流式細(xì)胞術(shù)比較IgG4-SC組與HC組外周血中的MAIT細(xì)胞頻率，發(fā)現(xiàn)前者較后者顯著下降[(1.03±0.17)%比(3.72±0.68)%，P<0.001，圖1A]。進(jìn)一步分析IgG4-SC組與HC組外周血中MAIT細(xì)胞亞群的頻率變化，發(fā)現(xiàn)兩組外周血CD4+MAIT占總T細(xì)胞的比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.10±0.02)%比(0.11±0.01)%，P=0.605 4，圖1B]，而前者的CD8+MAIT和CD4-CD8-MAIT(DN MAIT)占總T細(xì)胞的比例均較后者降低[(2.37±0.43%)比(11.62±2.70)%，P<0.01；(2.98±0.91)%比(8.80±1.88)%，P<0.01，圖1C～1D]。進(jìn)一步分析IgG4-SC組與HC組外周血中3種MAIT細(xì)胞占總MAIT的比例，發(fā)現(xiàn)前者的CD4+MAIT占MAIT細(xì)胞的比例較后者升高[(8.65±2.83)%比(2.67±0.96)%，P=0.049 6，圖1E]，而兩組的CD8+MAIT和DN MAIT占MAIT細(xì)胞的比例差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(81.89±3.08)%比(84.58±1.97)%，P=0.451 5；(11.25±2.34)%比(10.74±1.16)%，P=0.842 2，圖1F～1G]。

注：兩組相比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖1兩組的外周血中MAIT細(xì)胞及各亞組MAIT細(xì)胞頻率比較AT細(xì)胞中MAIT細(xì)胞頻率BCD4+MAIT細(xì)胞在T細(xì)胞中的占比CCD8+MAIT細(xì)胞在T細(xì)胞中的占比DDN MAIT細(xì)胞在T細(xì)胞中的占比ECD4+MAIT細(xì)胞在MAIT細(xì)胞中的占比FCD8+MAIT細(xì)胞在MAIT細(xì)胞中的占比GDN MAIT細(xì)胞在MAIT細(xì)胞中的占比

2.3 外周血MAIT細(xì)胞頻率與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系

為進(jìn)一步了解IgG4-SC患者外周血中MAIT細(xì)胞頻率的臨床意義，本研究將外周血中MAIT細(xì)胞的比例與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。在血常規(guī)指標(biāo)方面，IgG4-SC患者較高的MAIT細(xì)胞頻率與較多的PLT數(shù)量有關(guān)(r=0.58，P<0.05，圖2A)。在免疫學(xué)指標(biāo)方面，MAIT細(xì)胞頻率與IgG4、IgG均無相關(guān)性(r=-0.06，P=0.802 1；r=-0.29，P=0.275 6；圖2B、2C)。在肝功能指標(biāo)方面，IgG4-SC患者的MAIT細(xì)胞頻率與TBil、DBil均無相關(guān)性(r=-0.42，P=0.135 2；r=-0.131 4，P=0.202 8；圖2D、2E)。雖然IgG4-SC患者的MAIT細(xì)胞頻率與ALP無相關(guān)性(r=-0.45，P=0.110 4，圖2F)，但其與GGT呈負(fù)相關(guān)(r=-0.81，P<0.001，圖2G)。IgG4-SC患者的MAIT細(xì)胞頻率與反映肝損傷的ALT、AST呈負(fù)相關(guān)(r=-0.60，P<0.05；r=-0.58，P<0.05；圖2H、2I)，提示外周血MAIT細(xì)胞頻率在一定程度上可反映IgG4-SC患者的疾病嚴(yán)重程度。

圖2IgG4-SC患者外周血中MAIT細(xì)胞頻率與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析AMAIT細(xì)胞頻率與PLTBMAIT細(xì)胞頻率與IgG4CMAIT細(xì)胞頻率與IgGDMAIT細(xì)胞頻率與TBilEMAIT細(xì)胞頻率與DBilFMAIT細(xì)胞頻率與ALPGMAIT細(xì)胞頻率與GGTHMAIT細(xì)胞頻率與ALTIMAIT細(xì)胞頻率與AST

2.4 外周血MAIT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子變化

本研究對(duì)比分析了兩組外周血中MAIT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的功能，發(fā)現(xiàn)相較于HC組，IgG4-SC組分泌GrB、IFN-γ和TNF-α的MAIT細(xì)胞比例均升高[(13.78±5.09)%比(1.82±0.66)%，P<0.05；(21.03±2.97)%比(11.72±1.93)%，P<0.05；(18.07±3.19)%比(4.98±1.20)%，P<0.001；圖3A～3C]，而兩組分泌IL-17的MAIT細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.07±0.23)%比(1.10±0.38)%，P=0.962，圖3D]。

注：兩組相比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖3兩組外周血中分泌各種細(xì)胞因子的MAIT細(xì)胞比例的比較A分泌GrB的MAIT細(xì)胞比例B分泌IFN-γ的MAIT細(xì)胞比例C分泌TNF-α的MAIT細(xì)胞比例D分泌IL-17的MAIT細(xì)胞比例

2.5 外周血中MAIT細(xì)胞向肝臟趨化能力變化

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MAIT細(xì)胞CXCR6的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與HC組相比，IgG4-SC組外周血中CXCR6陽性的MAIT細(xì)胞比例顯著升高[(36.25±6.54)%比(13.53±1.36)%，P<0.001，圖4]。IgG4-SC組MAIT細(xì)胞表達(dá)趨化因子受體CXCR6升高，提示IgG4-SC患者的MAIT細(xì)胞向肝臟趨化增多。

注：兩組相比較，**P<0.01

圖4兩組外周血中CXCR6陽性的MAIT細(xì)胞比例比較

3 討論

IgG4-SC是一種好發(fā)于60歲以上男性的慢性纖維性炎性疾病，其臨床表現(xiàn)多樣，確診需結(jié)合臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)和病理學(xué)等，以防誤診為惡性腫瘤和其他自身免疫性肝病[2,9]。IgG4-SC是近年被醫(yī)學(xué)界所認(rèn)識(shí)的新型疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。以往的研究顯示，適應(yīng)性免疫細(xì)胞和固有免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在IgG4-SC的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[10-13]。

MAIT作為一類免疫細(xì)胞，由于其既具有固有免疫細(xì)胞的特性，又具有獲得性免疫細(xì)胞的功能，故其在臨床和基礎(chǔ)研究中都受到了重視[14-16]。多篇文獻(xiàn)報(bào)道MAIT細(xì)胞在不同疾病患者的外周血中頻率降低，如自身免疫性肝病[4]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[17]、炎癥性腸病[8]和NAFLD[5]等。在這些研究中，外周血中MAIT細(xì)胞頻率降低均伴隨著炎性反應(yīng)部位(如發(fā)生炎性反應(yīng)的腸道黏膜或肝臟)MAIT細(xì)胞頻率升高。在本研究中，外周血中MAIT細(xì)胞被定義為CD3+Vα7.2+CD161high淋巴細(xì)胞。MAIT細(xì)胞主要包括CD8+MAIT、DN MAIT以及少量的CD4+MAIT[3]。通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)IgG4-SC組的外周血MAIT細(xì)胞頻率較HC組降低，同時(shí)MAIT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的功能亦發(fā)生改變，分泌GrB、IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子能力的增強(qiáng)，而兩組分泌細(xì)胞因子IL-17的能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MAIT細(xì)胞在不同疾病中呈現(xiàn)的功能與基礎(chǔ)狀態(tài)也有差異性。有研究報(bào)道MAIT細(xì)胞在疾病狀態(tài)中分泌的細(xì)胞因子由Th1型向Th17型轉(zhuǎn)變[6,18]；也有研究發(fā)現(xiàn)小鼠MAIT細(xì)胞在體外被激活后，可分泌INF-γ、IL-4、IL-5和IL-10[19]；這些不同疾病中MAIT細(xì)胞功能的差異提示，其在不同疾病中發(fā)揮的生物學(xué)功能可能不盡相同。由于缺乏IgG4-SC患者的肝臟標(biāo)本，故無法通過免疫熒光激光共聚焦技術(shù)或流式細(xì)胞術(shù)等方法確定IgG4-SC組肝臟中MAIT細(xì)胞頻率是否較HC組升高。此外，目前尚無理想的IgG4-SC動(dòng)物模型，故無法利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來判斷MAIT細(xì)胞是否在肝臟部位聚集。有研究顯示，趨化因子受體CXCR6在自身免疫性肝病患者的淋巴細(xì)胞遷移到肝臟中起著重要作用[20]。相較于HC組，IgG4-SC組MAIT細(xì)胞高表達(dá)CXCR6，提示IgG4-SC患者外周血中MAIT細(xì)胞極可能被募集到炎性反應(yīng)部位。此外，在本研究中IgG4-SC組外周血MAIT細(xì)胞頻率降低與ALT、AST和GGT等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)密切相關(guān)。

綜上所述，本研究探究了IgG4-SC患者外周血中MAIT細(xì)胞的表型和功能改變，以及MAIT細(xì)胞頻率與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性。本研究的局限性在于臨床樣本數(shù)量少以及缺乏肝臟標(biāo)本，本研究結(jié)果有待今后的多中心、大樣本研究來證實(shí)。MAIT細(xì)胞在IgG4-SC疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，有望在將來成為治療IgG4-SC的新的免疫細(xì)胞靶點(diǎn)。