晚期肺癌患者血清EGFR基因突變狀態(tài)及臨床特征*

向 玉， 劉玉林， 呂姣姣， 胡 容， 趙琪林**, 吳曉偉

(1.遂寧市中心醫(yī)院 檢驗科, 四川 遂寧 629000； 2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 呼吸科， 陜西 西安 710061)

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因是晚期非小細胞肺癌患者較為常見的易突變基因，治療EGFR基因突變型肺癌患者的一線藥物為EGFR酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)[1-3]。統(tǒng)計結(jié)果顯示，我國僅有少部分肺癌患者在選擇治療方式之前進行EGFR基因突變檢測，而導(dǎo)致這種情況的主要原因之一即腫瘤組織的獲取十分困難。因此，在不需要患者腫瘤組織的前提下，即可對EGFR基因的突變狀態(tài)進行檢測，能夠有效提高我國肺癌患者EGFR基因狀態(tài)檢測率，有助于治療方案的制定。研究證實，肺癌患者外周血中腫瘤DNA水平高于健康人群，對血清與腫瘤組織樣本中EGFR水平進行比較發(fā)現(xiàn)二者一致性高達60%～95%[4-6]。直接測序作為檢測基因突變狀態(tài)的“金標(biāo)準(zhǔn)”具有準(zhǔn)確性高、特異性強的優(yōu)點，近年來二代測序法逐漸應(yīng)用于腫瘤易感性以及個性化用藥中。為此，本研究以110例非小細胞肺癌患者為研究對象，采用二代測序測定非小細胞肺癌患者血清EGFR基因突變分布情況，并進一步分析EGFR基因突變狀態(tài)與患者臨床特征及EGFR-TKIs治療效果的相關(guān)性，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料及分組

選取2016年12月～2017年6月收治的110例非小細胞肺癌患者為研究對象，根據(jù)二代測序結(jié)果，將其分為EGFR突變型患者(EGFR突變組，n=37)和EGFR野生型患者(EGFR野生組，n=73)。

1.1.1入組標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)細胞學(xué)或病理組織學(xué)確認(rèn)的晚期非小細胞肺癌，年齡20～65歲，性別不限，身體一般狀況評分(ECOG )為0～3分，存在至少有1處可測量病灶，入組前未接受過任何藥物治療及放療，臨床資料完整者。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn) 合并主要器官疾病患者，血、尿、大便3大常規(guī)檢查異常者，存在肝腎功能、心功能嚴(yán)重障礙者，合并其他惡性腫瘤患者，臨床資料不全者。

1.2 研究方法

1.2.1樣本搜集與DNA提取 全部受試者均于治療前取5 mL外周靜脈血，將所取血樣在室溫狀態(tài)下靜置2 h，隨后置入低溫高速離心機中以3 000 r/min離心10 min，取上層血漿置2 mL凍存試管保存于-80 ℃冰箱中待測。血漿內(nèi)DNA提取采用血液試劑盒(DNeasy，德國Qiagen公司)說明書中要求進行，采用超微量分光光度計(NanoDrop2000， ThermoFisher公司)進行濃度及純度的檢測， DNA樣品OD260/OD280值為1.8～2.0。

1.2.2二代測序法測定EGFR基因突變EGFR基因序列參照GenBank公開發(fā)表的編號為AY588246的序列，引物設(shè)計應(yīng)用ABI Prism TM Primer Express軟件，引物序列見表1，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法分別對EGFR基因第18、19、20、21外顯子進行擴增。將PCR擴增產(chǎn)物進行純化后，采用ABI Ion ProtonTM二代測序儀進行雙向測序，應(yīng)用Chromas軟件對測序結(jié)果進行分析。對于發(fā)生突變或缺失的樣本，均采用反向引物進行反向測序以驗證。

表1 引物序列Tab.1 List of primer sequences

1.2.3觀察指標(biāo) (1)采用二代測序技術(shù)分析晚期非小細胞肺癌患者EGFR基因突變分布情況；(2)記錄并比較兩組受試者性別、年齡、癌癥類型、TNM分期以及吸煙史等臨床特征；(3)采用多元Logistic回歸分析非小細胞肺癌患者血清EGFR基因突變狀態(tài)與其臨床病理特征之間的相關(guān)性；(4)評價兩組受試者治療效果；(5)比較兩組受試者中位無疾病進展生存期(progression free survival，PFS)，PFS的計算方式為患者從開始接受治療直至疾病進展或尚未進展的最后一次隨訪時間，本研究以2017年12月31日為隨訪截止時間；(6)采用電化學(xué)發(fā)光法應(yīng)用全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(Cobas e601，羅氏公司)檢測兩組受試者癌胚抗原(CA125)、鱗狀上皮細胞癌抗原(SCC-Ag)、糖類抗原(CA19-9)及細胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)等血清腫瘤標(biāo)志物表達水平。

1.2.4療效評判標(biāo)準(zhǔn) 完全緩解：全部靶病灶均消失且無新病灶出現(xiàn)，腫瘤標(biāo)志物達到正常水平并持續(xù)4周以上；部分緩解：全部靶病灶最大徑之和降低不低于30%并為持續(xù)4周以上；疾病穩(wěn)定：全部靶病灶最大徑之和增加低于20%或降低不足30%；疾病進展：出現(xiàn)新病灶或原有全部靶病灶最大徑之和增加超過20%?？傆行?(完全緩解+部分緩解)/患者總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變

37例EGFR基因突變患者中共檢測出19del、L858R、L861Q、S768I及G719X 5種突變，其中19del、L858R兩種突變例數(shù)和所占比例較高，分別為17(45.95%)、16(43.24%)，L861Q、S768I、G719X這3種突變例數(shù)和所占比例分別為2(5.41%)、1(2.70%)和1(2.70%)。

2.2 一般資料和臨床特征

EGFR突變組中，女性患者所占比例明顯高于男性，腺癌患者所占比例明顯高于非腺癌患者，TNM分期為Ⅲb期患者所占比例明顯低于IV期患者，且有吸煙史患者所占比例較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；EGFR突變組與EGFR野生組患者在性別、癌癥類型、TNM分期及吸煙史比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 EGFR基因突變狀態(tài)與臨床病理特征的相關(guān)性

多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，EGFR基因突變狀態(tài)與非小細胞肺癌患者在癌癥類型、性別、TNM分期、吸煙史顯著相關(guān)(P<0.05)，與年齡無顯著相關(guān)性，見表3。

2.4 療效評價

治療后，EGFR突變組患者臨床有效率明顯高于EGFR野生組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.873，P<0.05)，見表4。

2.5 PFS

隨訪結(jié)果顯示，EGFR突變組PFS為(9.75±1.64)月，EGFR野生組患者PFS為(5.51±0.40)月，EGFR突變組PFS明顯高于EGFR野生組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 兩組非小細胞肺癌患者一般資料及臨床特征比較(n，%)Tab.2 Patient information, EGFR mutation status and clinical features

表3 EGFR基因突變狀態(tài)與臨床病理特征的多元Logistic分析Tab.3 Multivariate logistic analysis of EGFR gene mutation status and clinicopathological features

表4 兩組非小細胞肺癌患者臨床療效比較(n，%)Tab.4 The correlation between therapeutic effects and EGFR mutation status

2.6 血清腫瘤標(biāo)志物

EGFR突變組受試者CEA表達水平明顯高于EGFR野生組，CA125、CY21-1及SCC-Ag明顯低于EGFR野生組，兩組間血清腫瘤標(biāo)志物表達水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 兩組非小細胞肺癌患者血清腫瘤標(biāo)志物表達水平比較Tab.5 The correlation between Serum tumor markers and EGFR mutation status

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，在我國乃至全球，肺癌的發(fā)病率以及致死率均高居惡性腫瘤之首，肺癌患者中約有85%為非小細胞肺癌，該疾病嚴(yán)重威脅到人們的身體健康甚至生命[7]。以EGFR-TKIs為代表的靶向藥物對于存在EGFR基因突變的非小細胞肺癌患者具有顯著的治療效果，而EGFR基因野生型患者將無法從EGFR-TKIs藥物治療中獲益[8-9]。故而，為提高治療效果，臨床上對非小細胞肺癌患者采取治療措施之前，應(yīng)該明確其EGFR基因突變狀態(tài)[10]。EGFR基因突變檢測的首選材料為患者的腫瘤組織，然而由于晚期非小細胞肺癌患者的腫瘤組織標(biāo)本主要是支氣管鏡活檢或肺穿刺的小標(biāo)本，標(biāo)本量無法滿足基因檢測的需要，此外，腫瘤異質(zhì)性可能會降低活檢腫瘤小標(biāo)本在反映腫瘤整體的基因突變的準(zhǔn)確性。近年來，研究人員提出可將血液樣本作為基因檢測的生物材料，大量研究證實，非小細胞肺癌患者外周血與組織樣本中EGFR突變檢測結(jié)果具有較高的一致性，提示采用二代測序法對非小細胞肺癌患者血清中EGFR基因突變狀態(tài)進行檢測具有較高的可行性[11-13]。

本研究采用二代測序技術(shù)對110例晚期非小細胞肺癌患者血清EGFR基因突變狀態(tài)進行了檢測，發(fā)現(xiàn)其中EGFR基因突變患者約占33.64%(37例)，與同類型研究結(jié)論相一致[14-15]；在EGFR基因突變患者中，共發(fā)現(xiàn)5處突變位點，其中19del、L858R兩種突變所占比例較高分別為45.95%、43.24%，L861Q突變比例為5.41%，S768I與G719X兩種突變所占比例較低，均僅為2.70%、2.70%。臨床特征方面研究返現(xiàn)，EGFR基因發(fā)生突變患者中，女性所占比例高于男性，腺癌高于非腺癌、無吸煙史者高于有吸煙史者，TNM分期為Ⅲb期者低于IV期者，進一步通過多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，EGFR基因突變狀態(tài)與非小細胞肺癌患者癌癥類型、性別、TNM分期、吸煙史顯著相關(guān)(P<0.05)，大量研究指出，EGFR基因是非小細胞肺癌患者的第一代驅(qū)動基因，在亞裔、女性、腺癌以及不吸煙患者中突變發(fā)生率較高[16-17]，這一結(jié)論與本研究結(jié)果相一致。

國外研究團隊指出，對于EGFR基因突變型的晚期非小細胞肺癌患者，采用EGFR-TKIs藥物進行一線治療的臨床有效率和疾病控制率分別為40%和70%，且患者平均PFS超過9個月；另有研究證實，相較于常規(guī)化療方案，血清EGFR基因存在突變的非小細胞肺癌患者采用吉非替尼治療后的臨床效果以及無進展生存期均明顯優(yōu)于接受標(biāo)準(zhǔn)化療方案更優(yōu)；研究人員通過對比分析晚期肺癌患者組織及血漿中游離DNA發(fā)現(xiàn)，二者在靶向藥物臨床治療效果的預(yù)測方面具有高度一致性[18-20]。本文研究發(fā)現(xiàn)，EGFR突變組患者臨床有效率以及PFS均明顯高于EGFR野生組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與上述同類型研究結(jié)論一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變患者與EGFR基因野生型患者間血清腫瘤標(biāo)志物表達水平具有顯著差異(P<0.05)，其機理有待進一步分析。值得注意的是，二代測序法檢測血清中EGFR基因突變狀態(tài)并非適用于全部肺癌患者，這是由于血液腫瘤DNA的水平會受到腫瘤分期的影響，Ⅲ期及Ⅳ期患者血EGFR檢出率較高，而對于I、II期患者檢測靈敏度較低，這也是本研究選擇晚期非小細胞肺癌患者為研究對象的主要原因。

綜上所述，EGFR突變狀態(tài)與非小細胞肺癌患者性別、癌癥類型、腫瘤分期以及吸煙史等臨床特征以及臨床效果、腫瘤標(biāo)志物表達水平密切相關(guān)，二代測序法作為EGFR基因突變狀態(tài)的重要檢測方式，在對患者的臨床治療方面具有重要指導(dǎo)意義。