他汀類藥物聯(lián)合抗結(jié)核病藥導(dǎo)致大鼠肝損傷

喻明麗，劉夢(mèng)醒，羅 季，陳 潔，彭江麗

(昆明市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，昆明 650041)

云南省屬于結(jié)核病高發(fā)地區(qū)之一。昆明市第三人民醫(yī)院是以傳染病治療為特色的綜合性醫(yī)院。在臨床實(shí)際工作中，結(jié)核病合并高脂血癥患者采用抗結(jié)核病藥聯(lián)合他汀類藥物降血脂治療較常見，該類聯(lián)合用藥在治療過程中常常會(huì)出現(xiàn)不同程度的藥物性肝損傷(drug-induced liver injury,DILI)。此類問題越來越受到臨床醫(yī)師的關(guān)注，并已成為影響臨床療效的主要原因之一。本研究通過復(fù)制阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀分別與抗結(jié)核病藥聯(lián)用致大鼠肝損傷模型，檢測(cè)大鼠肝功能生化指標(biāo)并進(jìn)行電鏡觀察，以探討不同他汀類藥物分別聯(lián)合抗結(jié)核病藥致大鼠肝損傷的特點(diǎn)，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡Sprague Dawley(SD)大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(滇)K2015-0002。飼養(yǎng)條件：室溫23～25 ℃，濕度30%～70%，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 儀器和試藥 AU5400全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司)；JEM1011透射電子顯微鏡(日本微電子Microjenics株式會(huì)社)。辛伐他汀片(批號(hào)130922，美國默沙東醫(yī)藥公司)；洛伐他汀片(批號(hào)131011，山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)；阿托伐他汀鈣片(批號(hào)130820，輝瑞制藥有限公司)；異煙肼片(批號(hào) 130108，西南藥業(yè)股份有限公司)；利福平膠囊(批號(hào)130823，云南昊邦制藥有限公司)；吡嗪酰胺片(批號(hào)131003，成都錦華藥業(yè)有限公司)。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 80只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：空白對(duì)照組、阿托伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥(異煙肼+利福平+吡嗪酰胺，下同)組、辛伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組、洛伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組，每組20只，雌雄各半。

2.2 動(dòng)物模型制備

2.2.1 給藥劑量換算 按成人體質(zhì)量70 kg進(jìn)行人-鼠間給藥劑量換算[1]，大鼠每日用量(mg/kg)=成人每日用量(mg/kg)×6.25(換算系數(shù))。從灌胃開始，每周測(cè)定一次大鼠體質(zhì)量，并以此作為給藥劑量換算的依據(jù)，按藥物配制表(見表1)配制藥物水性混懸液進(jìn)行灌胃。

2.2.2 動(dòng)物給藥 空白對(duì)照組灌胃生理鹽水2 ml/100 g體重；其他組先灌胃抗結(jié)核病藥， 4 h后再灌胃他汀類藥物，每天灌胃1次，灌胃容量2 ml/100 g體重。

表 1 藥物配制劑量換算表Table 1 Dosage conversion table of the drug preparation

2.3 肝功能生化指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)大鼠于給藥第10天(d 10)、d 35、d 55分別處死6只、6只和8只，雌雄各半。處死前抽取靜脈血5 ml，用全自動(dòng)生化分析儀立即檢測(cè)總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)、間接膽紅素(IBil)、堿性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平。根據(jù)2015版中華醫(yī)學(xué)會(huì)《藥物性肝損傷診治指南》[2]判斷是否存在DILI及DILI類型。各用藥組的肝功能生化指標(biāo)與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表示存在DILI。用R值判定肝損傷類型。R=(ALT實(shí)測(cè)值/ALT正常值上限)/(ALP實(shí)測(cè)值/ALP正常值上限)。R≥5為肝細(xì)胞損傷型，R≤2為膽汁淤積型，2

2.4 電鏡觀察 處死大鼠，于每只大鼠相同部位取肝臟組織并制作電鏡切片，電子顯微鏡下觀察肝細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的損傷情況。

3 結(jié) 果

3.1 肝功能生化指標(biāo) 給藥d 10、d 35、d 55，與空白對(duì)照組比較，各聯(lián)合給藥組TBil、DBil和IBil顯著升高(P<0.01)。給藥d 10、d 35、d 55，阿托伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組、辛伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組與空白對(duì)照組比較,AST顯著升高(P<0.01)。給藥d 35，阿托伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組、辛伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組與空白對(duì)照組比較,ALT顯著升高(P<0.01)。給藥d 55，阿托伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組與空白對(duì)照組比較，ALT顯著升高(P<0.01)。給藥d 35、d 55，阿托伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組、辛伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組分別與空白對(duì)照組比較，ALP顯著升高(P<0.01)。d 35、d 55辛伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組、洛伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組分別與阿托伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組比較，ALP顯著升高(P<0.01)，具體見表2。

3.2 肝損傷類型 3組他汀類藥物+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組分別在給藥d 10、d 35、d 55R值<2，提示3組均主要以膽汁淤積型肝損傷為主。

3.3 大鼠肝臟電鏡觀察結(jié)果 空白對(duì)照組：電鏡顯示線粒體數(shù)量多，呈圓形或橢圓形，形態(tài)正常；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少，未見大量增生；細(xì)胞核大而圓，核仁清晰，其他無異常(見圖1的A、B、C)。阿托伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組：給藥d 10肝細(xì)胞輕度水腫，部分肝細(xì)胞脂變，血竇瘀血；d 35肝細(xì)胞脂變，血竇擴(kuò)張瘀血；d 55肝細(xì)胞明顯變性、血竇擴(kuò)張明顯，局部肝組織提示肝纖維化(見圖1的D、E、F)。辛伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組給藥d 10肝細(xì)胞明顯脂變，膠原纖維增生;給藥d 35、d 55肝細(xì)胞漿有明顯空泡樣改變，出現(xiàn)膽汁淤積，并隨用藥時(shí)間延長(zhǎng)淤積更嚴(yán)重(見圖1的G、H、I)。洛伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組給藥d 10血竇明顯擴(kuò)張，瘀血，細(xì)胞固縮，變性壞死;d 35有脂滴，細(xì)胞輕度水腫;d 55線粒體固縮，細(xì)胞水腫，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生(見圖1的J、K、L)。

組別動(dòng)物數(shù)(n)總膽紅素(cB/μmol·L-1)直接膽紅素(cB/μmol·L-1)間接膽紅素(cB/μmol·L-1)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(zB/U·L-1)谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(zB/U·L-1)堿性磷酸酶(zB/U·L-1)空白對(duì)照組 d 1067.78±0.382.70±0.105.08±0.38143.33± 4.08 33.83±3.31182.00±8.88 d 3568.06±0.382.82±0.125.24±0.46173.67±39.9844.17±2.32200.00±1.79 d 5588.13±0.582.89±0.195.31±0.56181.01± 7.9856.00±2.73208.86±5.47洛伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組 d 10610.67±0.59??3.62±0.18??7.05±0.44??160.83±30.1936.17±5.42194.83±27.84 d 35610.99±0.77??3.70±0.35??7.29±0.42??196.00±19.4173.25±15.95221.50±25.96△△ d 55810.89±0.73??3.67±0.32??7.22±0.60??199.99±28.2576.95±16.64233.47±27.35△△辛伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組 d 10610.23±0.37??3.51±0.16??6.73±0.32??179.83±11.64??40.00±2.52212.17±18.09 d 35610.06±0.42??3.43±0.28??6.64±0.50??231.83±19.11??68.5±5.44??254.00±18.65??△△ d 55810.16±0.50??3.51±0.40??6.65±0.49??227.88±15.96??63.33±6.78267.45±18.63??△△阿托伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組 d 10610.25±0.34??3.39±0.24??6.86±0.48??208.00±42.21??39.83±12.50205.17±72.37 d 35610.38±0.40??3.38±0.28??7.00±0.50??213.00±24.03??78.50±15.71??377.83±78.66?? d 55810.19±0.63??3.40±0.36??6.80±0.52??208.96±22.69??80.59±18.57??391.97±83.49??

**P<0.01，與同時(shí)間空白對(duì)照組比較;△△P<0.01，與同時(shí)間阿托伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組比較

圖 1 大鼠肝細(xì)胞病理變化的電鏡照片F(xiàn)igure 1 Electron micrograph of pathological changes in rat liver cellsA、B、C：空白對(duì)照組用藥d 10、d 35、d 55取材；D、E、F：阿托伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組用藥d 10、d 35、d 55取材；G、H、I:辛伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組用藥d 10、d 35、d 55取材；J、K、L:洛伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組用藥d 10、d 35、d 55取材

4 討 論

DILI的發(fā)生通常與藥物本身的化學(xué)性質(zhì)、劑量、療程、藥物相互作用以及藥物的代謝密切相關(guān),同時(shí)也與患者肝臟對(duì)藥物的耐受性、適應(yīng)性及敏感性息息相關(guān)[2]。DILI的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，往往是多種機(jī)制并存、先后作用或共同作用的結(jié)果。他汀類藥物致DILI的機(jī)制目前仍不明確。張守堂等[3]的研究表明，他汀類藥物自身或其代謝產(chǎn)物主要通過影響肝細(xì)胞分泌膽汁，使有些藥物與膽小管轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合后導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積。

本研究中生化指標(biāo)結(jié)果顯示，大鼠的肝損傷主要表現(xiàn)為膽汁淤積型，且隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)有加重趨勢(shì)，提示臨床應(yīng)及時(shí)和定期監(jiān)測(cè)患者肝功能，一旦出現(xiàn)DILI應(yīng)給予促膽汁排泄類保肝藥，必要時(shí)給予暫時(shí)停藥處理。本課題組前期研究均顯示[4-6]，他汀類藥物與抗結(jié)核病藥聯(lián)用后，肝細(xì)胞表面和周圍都存在著大量膽汁淤積，這也間接驗(yàn)證了這種損傷機(jī)制的存在。本研究結(jié)果還顯示，聯(lián)合用藥后大鼠肝細(xì)胞線粒體均出現(xiàn)不同程度水腫、崩解和壞死等病變。由于線粒體是真核細(xì)胞能量供應(yīng)和新陳代謝的主要場(chǎng)所，其損傷必定會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞能量耗竭，引起細(xì)胞凋亡和壞死[7]。由于抗結(jié)核病藥物也主要經(jīng)過肝臟代謝，當(dāng)他汀類聯(lián)用抗結(jié)核病藥時(shí)，其中利福平為肝藥酶CYP3A4強(qiáng)效誘導(dǎo)劑，其不僅能加強(qiáng)異煙肼和吡嗪酰胺本身及代謝產(chǎn)物的肝毒性，而且還能誘導(dǎo)主要經(jīng)肝藥酶CYP3A4代謝的他汀類藥物代謝產(chǎn)物增加，進(jìn)而加重肝損傷。

本研究結(jié)果表明，用藥d 35、d 55，聯(lián)合用藥組均發(fā)生不同程度的肝損傷，其中以阿托伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組的肝損傷較重。針對(duì)結(jié)核病合并高脂血癥患者，提示臨床選藥時(shí)應(yīng)盡量避免阿托伐他汀聯(lián)用抗結(jié)核病藥治療。有研究發(fā)現(xiàn)[8]，他汀類藥物在抑制羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的同時(shí)，使線粒體甲羥戊酸鹽代謝途徑中多種中間產(chǎn)物受抑制，導(dǎo)致細(xì)胞能量耗竭，進(jìn)而死亡。而且在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀的鄰位和對(duì)位羥基化代謝產(chǎn)物對(duì)HMG-CoA還原酶的抑制作用與原藥相當(dāng)[9]，而辛伐他汀和洛伐他汀的代謝產(chǎn)物均不抑制HMG-CoA還原酶。因此，阿托伐他汀對(duì)HMG-CoA還原酶抑制劑作用為雙重抑制，而辛伐他汀和洛伐他汀為單一抑制，這也可能是阿托伐他汀+聯(lián)合抗結(jié)核病藥組較辛伐他汀、洛伐他汀聯(lián)合用藥組肝損傷嚴(yán)重的原因之一。

總之，DILI的機(jī)制復(fù)雜，還有待逐步深入研究。本課題組僅從生化指標(biāo)和電鏡觀察的角度研究了DILI的可能機(jī)制，不能完全深入和明確地解釋肝損傷的機(jī)制，還需要進(jìn)一步地從藥物基因組學(xué)等多角度、多細(xì)節(jié)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究。