細胞介導的藥物遞送系統(tǒng)研究進展

強 磊，李國瑞，宮春愛，臺宗光，高 申*

(1.海軍軍醫(yī)大學長海醫(yī)院藥學部，上海 200433；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科，上海 200011)

20世紀70年代人們開創(chuàng)性地將包裹β葡萄糖苷酶的紅細胞用于戈謝病(Gaucher’s disease)的治療[1]，這一研究開啟了細胞介導的藥物傳遞新途徑。不同的細胞具有不同的生理特征，如紅細胞具有長效循環(huán)的作用，免疫細胞具有對炎癥和腫瘤部位靶向富集的功能[2]，可以利用細胞的這些天然功能將其開發(fā)為藥物載體。以細胞為基礎的藥物載體與傳統(tǒng)的納米載藥系統(tǒng)相比，具有低免疫原性和毒副作用小的突出優(yōu)勢[3]，成為近年來的研究熱點。本文對紅細胞、免疫細胞、干細胞和腫瘤細胞作為藥物載體的研究進展及細胞的各種載藥方式做一綜述。

1 用作藥物傳遞系統(tǒng)的細胞類型

目前研究的細胞載體有紅細胞、免疫細胞、干細胞和腫瘤細胞(見表1)，現(xiàn)重點介紹各種細胞載藥系統(tǒng)的特點、攜載制劑及實際應用。

1.1 紅細胞 紅細胞是一種缺乏細胞器和細胞核的雙凹盤狀細胞，具有高度可變形性，可作為天然載體將氧氣和營養(yǎng)物質運輸?shù)饺韀4]。將紅細胞作為藥物載體具有以下優(yōu)勢：(1)紅細胞的壽命約為120 d，作為藥物儲庫可以延緩藥物釋放，延長藥物的半衰期。(2)紅細胞具有較好的生物相容性，在紅細胞的保護下，攜載的治療藥物不易被機體免疫系統(tǒng)吞噬和清除。(3)紅細胞可被機體完全降解，無毒性產(chǎn)物，免疫原性低。這些特征為紅細胞成為藥物載體提供了可能性[5]。因紅細胞的壽命較長，大量的研究試圖將藥物連接在紅細胞表面，或導入紅細胞來增加藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間。低滲溶脹法是將藥物導入紅細胞內(nèi)的一種常用方法。該方法先將紅細胞放置在低滲環(huán)境中，細胞膜上的孔隙因細胞膨脹被瞬時放大，從而允許藥物擴散至細胞中。載藥之后將紅細胞放入等滲介質中，空隙被重新密封。Ahn等[6]利用低滲溶脹法將金納米粒導入到紅細胞中，用于全身血液的動態(tài)X射線成像。但在加載藥物的過程中，細胞的結構和膜表面的化學成分會發(fā)生變化，導致細胞的正常功能受到影響。為解決這一問題，有研究報道將藥物與細胞穿透肽(cell penetrating peptides，CPPs)通過二硫鍵共價結合[7]，經(jīng)CPPs修飾的藥物進入紅細胞后，二硫鍵被細胞內(nèi)高表達的谷胱甘肽降解，藥物與CPPs發(fā)生解離，這種載藥過程不會對紅細胞的結構和功能產(chǎn)生影響。在該研究中，以左旋天冬酰胺酶(L-asparaginase,ASNase)為模型藥物，分別用低滲溶脹法和CPPs介導的包封法裝載ASNase。將兩種載藥紅細胞靜脈注射到小鼠體內(nèi)，觀察到低滲溶脹法處理的紅細胞其血漿半衰期為5.9 d，而CPPs介導的載藥紅細胞其血漿半衰期延長為9.2 d。

表1 細胞介導的藥物遞送系統(tǒng)Table 1 Cell-mediated drug delivery systems

用紅細胞制備的紅細胞膜最大限度地保留了膜中的蛋白質并復制了表面抗原多樣性，具有紅細胞的長效循環(huán)和免疫逃避能力。紅細胞膜上的CD47已被證明是一種“標記物”，它可以通過信號調(diào)節(jié)的相互作用抑制巨噬細胞的吞噬作用。Ren等[8]通過納米膜共擠壓的方法，將制備的紅細胞膜包被在納米載體的表面，形成仿生紅細胞載體。仿生紅細胞載體可以有效地減少巨噬細胞(RAW264.7)的攝取并顯著延長血液循環(huán)時間，實現(xiàn)腫瘤部位的高度富集。此外，靜脈注射后可有效抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長。

1.2 免疫細胞 與紅細胞相比，免疫細胞是一種更具潛力的藥物載體。免疫細胞不僅可以作為藥物儲庫延緩藥物的釋放，同時還具有主動靶向炎癥部位的功能。研究顯示，炎癥反應在腫瘤的各個階段都發(fā)揮著重要作用，包括腫瘤的起始、增殖、侵襲和轉移[9]。腫瘤內(nèi)部因結構致密、缺乏血管而形成的缺氧微環(huán)境是大多數(shù)實體瘤的標志性特征。在腫瘤的中心區(qū)域常觀察到因缺氧引起的壞死區(qū)域。因此伴有炎癥和壞死的腫瘤部位會分泌大量的趨化因子，招募體內(nèi)的免疫細胞向腫瘤部位聚集。目前，作為藥物載體研究最多的是單核/巨噬細胞、中性粒細胞和T細胞。

1.2.1 單核/巨噬細胞 單核/巨噬細胞起源于骨髓干細胞，先分化為單核細胞，通過血液循環(huán)進入各組織器官后，進一步分化為巨噬細胞。單核/巨噬細胞本身具有較強的吞噬能力，可以直接通過胞吞的方式攜載化學藥物和載藥納米粒。Fu等[10]通過簡單孵育的方法將多柔比星(DOX)加載到鼠源巨噬細胞RAW264.7中，體內(nèi)活體成像數(shù)據(jù)顯示，巨噬細胞的活力和對腫瘤細胞的靶向性并沒有因裝載藥物而發(fā)生明顯改變。在小鼠乳腺癌肺轉移模型中，裝載DOX的巨噬細胞顯示出明顯的抗癌功效，與生理鹽水處理組相比，載藥巨噬細胞處理組中小鼠的30 d存活率由25%提高至80%。He等[11]研究發(fā)現(xiàn)，單核細胞攜載天冬酰胺內(nèi)肽酶(legumain)敏感納米粒形成的仿生遞藥系統(tǒng)，可以主動靶向至體內(nèi)的肺轉移性4T1乳腺癌細胞。該系統(tǒng)中的單核細胞進入轉移病灶組織后分化為巨噬細胞，導致細胞內(nèi)天冬酰胺內(nèi)肽酶水平升高，天冬酰胺內(nèi)肽酶敏感的納米粒被破壞。攜載的化療藥物以游離藥物或含藥外泌體的形式被釋放后作用于癌細胞。在小鼠乳腺癌肺轉移模型中，載藥單核細胞處理組的平均肺轉移性結節(jié)數(shù)量為(17.4±6.9)個，僅為生理鹽水對照組的22.2%，結果表明該仿生遞藥系統(tǒng)能有效抑制轉移性乳腺癌的增殖、轉移和侵襲。

Cao等[12]從鼠源巨噬細胞系RAW264.7細胞分離細胞膜，并包裹在攜載曲妥珠單抗的脂質體表面，形成一種仿生巨噬細胞載體。巨噬細胞除了具有炎癥靶向和腫瘤靶向的特性外，還可以通過細胞膜表面的α4整合素和與乳腺癌細胞的血管黏附分子(VCAM-1)主動結合。利用這一特性，可以實現(xiàn)對乳腺癌的主動靶向富集。體外實驗顯示，仿生巨噬細胞載體可以增加4T1乳腺癌細胞攝取，并對細胞活力有抑制作用。在小鼠體內(nèi)，仿生巨噬細胞載體能夠靶向轉移至腫瘤病灶，并對乳腺癌肺轉移產(chǎn)生了顯著抑制作用。仿生巨噬細胞載體給藥組中肺轉移結節(jié)數(shù)為(3.8±2.6)個，是游離藥物組的17.6%，載藥脂質體組的24%。

1.2.2 中性粒細胞 中性粒細胞是血液中含量最豐富的免疫細胞，也是在炎癥趨化因子的作用下最早到達炎癥部位的免疫細胞。研究顯示，中性粒細胞可以透過血腦屏障(blood brain barrier，BBB)到達腦腫瘤部位。Xue等[13]研究發(fā)現(xiàn)，攜載含有紫杉醇(paclitaxel)脂質體的中性粒細胞可以有效抑制小鼠腦膠質瘤的術后復發(fā)。腦膠質瘤切除后釋放的大量炎癥因子會誘導中性粒細胞向大腦炎癥部位聚集，同時術后炎癥部位高濃度的炎癥信號會促使紫杉醇從中性粒細胞中釋放，進一步作用于術后殘留的腫瘤細胞。在手術治療的膠質瘤小鼠模型中，載藥中性粒細胞處理組術后4個月的存活率為25%，雖未能完全抑制腫瘤的再生，但可以有效緩解腫瘤的復發(fā)。

1.2.3 T淋巴細胞 T淋巴細胞來源于胸腺，是一種分型復雜的免疫細胞。T淋巴細胞在體內(nèi)會向次級淋巴器官和炎癥組織靶向聚集，已被廣泛研究用于癌癥治療的細胞療法。在早期的臨床試驗中，注入修飾的T細胞對癌癥和慢性炎癥的治療都有較好的效果。T細胞不僅可以直接靶向殺傷腫瘤細胞，同時還可以作為藥物載體，起到雙重抗腫瘤的效果。Stephan等[14]將攜載化療藥物的納米粒連接在T細胞表面，注入小鼠皮下移植瘤模型中。 給藥10 d后，相比于空白對照組，載藥T細胞處理組的腫瘤體積縮小為原來的19.23%(P<0.001)，而在未經(jīng)修飾的T細胞處理組中，腫瘤大小僅縮小為原來的83.33%，攜載的化療藥物明顯增強了T細胞的抗腫瘤效果。

1.3 干細胞 成體干細胞是組織特異性細胞，原則上它只能分化為一系列特定的組織細胞。與胚胎干細胞相比，成體干細胞移植后引起腫瘤的可能性較低，可用于組織再生治療，在臨床研究中引起了較大的關注。同時成體干細胞向炎癥部位和腫瘤組織靶向富集的特點，使其成為癌癥治療中理想的傳遞載體[15]。有研究顯示，成體干細胞可有效地將免疫調(diào)節(jié)劑、溶瘤病毒和包載化療藥物的納米粒運輸至腫瘤部位，明顯提高了這些治療制劑的靶向性。Ho等[16]將加載喜樹堿的納米液滴導入至脂肪來源的成體干細胞中，載藥后干細胞的存活率為(77±4)%，載藥納米液滴被干細胞運輸至腫瘤部位后，在超聲波刺激下釋放藥物并形成氣泡，以形成超聲造影成像。目前，作為傳遞載體研究最多的是來自骨髓的間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)，和來自大腦特定神經(jīng)區(qū)域的神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs)。與免疫細胞相似，MSCs的表面表達大量的黏附因子[17]，靜脈注射后可從血管滲出進入各組織。目前MSCs被用作多種腫瘤治療的傳遞載體，如神經(jīng)膠質瘤[18]。但有研究表明，MSCs的免疫抑制作用可能會促進原發(fā)性和轉移性腫瘤的生長[19]，從而限制了其在特定臨床環(huán)境中的應用。NSCs是一種非致瘤性和低免疫原性的成體干細胞，對多種類型的腫瘤都顯示出明顯的趨向作用。NSCs可作為基因載體，將治療基因通過病毒基因重組的方式轉導到NSCs中，用以治療癌癥相關性疾病。NSCs來源于大腦，需要通過侵入性手術的方法來獲取這些細胞，復雜的提取手段限制了細胞來源和臨床應用的可能性。但有報道顯示，自體神經(jīng)干細胞可以從骨髓中獲取，這為NSCs的臨床應用帶來了希望[20]。

1.4 腫瘤細胞 近年來有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞表面表達著大量的表面黏附因子(半乳糖凝集素3)，腫瘤細胞膜表面的癌胚抗原與同源腫瘤細胞間黏附因子的相互作用，會造成細胞間的黏附聚集?；谀[瘤細胞的這一特性，將腫瘤細胞膜包裹在含藥納米載體的表面，利用腫瘤細胞膜表面的黏附分子靶向識別同源癌細胞，可實現(xiàn)同源腫瘤的定向給藥[21]。Sun等[22]設計了一種以攜載DOX的金納米粒(AuNs)為內(nèi)核，4T1乳腺癌細胞膜為外殼的仿生納米遞藥系統(tǒng)。這種遞藥系統(tǒng)結合了腫瘤細胞的同源靶向性和金納米粒的光熱效應，靜脈注射入小鼠體內(nèi)后會在腫瘤部位靶向聚集，在外部近紅外光的照射下產(chǎn)生熱量，促使藥物在腫瘤部位有效釋放。這種光熱療法和化學療法的聯(lián)合應用可以有效地殺死腫瘤細胞，抑制腫瘤生長。也可以用腫瘤細胞膜包載一些功能性納米粒，將其運輸至腫瘤部位，實現(xiàn)對體內(nèi)腫瘤的診斷和檢測。Chen等[23]用腫瘤細胞膜包裹攜載吲哚菁綠(indocyanine green)的納米粒，通過熒光/光聲雙模態(tài)成像，可以對體內(nèi)腫瘤的動態(tài)分布進行實時監(jiān)測。監(jiān)測結果表明，包裹腫瘤細胞膜的納米?？梢杂行У叵蛲窗┘毎邢蚓奂?，同時能減少肝臟和腎臟的攝取，具有良好的免疫逃避能力。

2 細胞載藥方式

細胞攜載藥物或納米載體的方式主要包括細胞內(nèi)吞，以及通過非共價鍵或共價鍵在細胞表面連接納米載體。

2.1 細胞內(nèi)吞 將細胞與藥物共同孵育，通過細胞的內(nèi)吞將藥物載入細胞內(nèi)是一種簡單高效的載藥方式。在上述介紹的載藥細胞中，免疫細胞具有最強的吞噬能力，能通過內(nèi)吞作用吞噬納米藥物形成細胞-納米藥物遞送系統(tǒng)。Tao等[24]研究顯示，將巨噬細胞與載有紫杉醇的納米載體共同孵育，當紫杉醇的濃度達到100 μmol/L 時，8 h后幾乎所有的載藥納米粒均被細胞攝取。在生理條件下，通過該方法制備的載藥巨噬細胞在4 d內(nèi)能將80%的紫杉醇排出細胞。為了進一步提高載藥細胞對納米載體的有效攝取，可以在納米載體的表面修飾靶向配體。Qin等[25]將RGD肽(Arg-Gly-Asp)連接到脂質體表面，RGD作為靶向配體可與中性粒細胞和單核細胞表面的整聯(lián)蛋白受體相結合，促進細胞對脂質體的內(nèi)吞作用。經(jīng)過RGD 修飾后，單核細胞對脂質體的攝取效率由41.72%提高至64.89%。并且有研究顯示，隨著納米載體表面修飾配體密度的增加，細胞對納米載體的攝取效率也有所提高[26]。內(nèi)吞的方法裝載藥物雖然簡單高效，但也存在以下一些缺點：(1)裝載的藥物或納米載體可能會影響細胞的活性，對細胞的腫瘤靶向性和遷移能力產(chǎn)生影響。(2)細胞內(nèi)吞可能會導致納米載體的降解，從而影響療效[27]。為解決以上問題，可將納米載體通過共價鍵或非共價鍵的方式連接在細胞表面，隨著細胞轉運至炎癥和腫瘤部位。

2.2 非共價偶聯(lián) 非共價偶聯(lián)的過程中只需簡單混合，納米載體便可通過氫鍵、范德華力或靜電力等形式附著在細胞表面。納米載體的尺寸以及納米載體/細胞的比例是影響細胞攜載納米載體數(shù)目的兩個最重要的因素。提高納米載體/細胞間的比例可以使細胞表面附著更多的納米粒，但過量的納米載體會導致細胞間的相互凝集。納米載體的尺寸對細胞表面附著的納米載體數(shù)目也有著較大影響。Anselmo等[28]采用非共價偶聯(lián)的方式將PLGA納米膠束連接在紅細胞表面，提高了納米膠束的血液循環(huán)時間，減少了肝臟和脾臟的攝取。這種連接方式不會影響紅細胞的功能，也不會發(fā)生溶血現(xiàn)象。但非共價偶聯(lián)是一種脆弱的連接方式，靜脈給藥后，在血流剪切應力和細胞間的相互作用下，納米載體容易從細胞表面解離。因此，須采用共價偶聯(lián)的方式增加納米載體與細胞之間的黏合強度。

2.3 共價偶聯(lián) 研究發(fā)現(xiàn)，許多細胞表面存在著大量的功能基團(如氨基、巰基和唾液酸殘基等)。因此可以對合成的納米載體進行化學修飾，以共價偶聯(lián)的方式連接到細胞表面。共價偶聯(lián)是一種相對穩(wěn)定的連接方式，可以有效防止載體在體內(nèi)循環(huán)的過程中從細胞表面解離。Stephan等[29]將脂質體納米粒用馬來酰亞胺修飾后，與T細胞表面的巰基通過共價偶聯(lián)的方式結合。通過該方法可將大量直徑在100～300 nm的納米載體連接在T細胞表面。與未經(jīng)修飾的T細胞相比，經(jīng)共價鍵連接納米載體的T細胞其遷移能力未發(fā)生明顯改變。穿越內(nèi)皮屏障后，約有83%的納米載體保留在T細胞表面。然而這種穩(wěn)定的共價偶聯(lián)使得納米載體在到達治療部位后難以從細胞表面解離。因此，在今后的研究中，有必要開發(fā)設計一種能在體內(nèi)循環(huán)過程中保持穩(wěn)定，經(jīng)環(huán)境刺激后有效釋放載體的細胞給藥系統(tǒng)。

3 展 望

細胞載體具有良好的生物相容性及靶向能力，是一種極具應用前景和臨床發(fā)展?jié)摿Φ慕o藥系統(tǒng)。但這類給藥系統(tǒng)仍處于發(fā)展初期，還存在一些問題有待解決。(1)細胞經(jīng)修飾和載藥后其生物活性和趨向性可能會受到影響[30]。(2)細胞載體的體內(nèi)安全性評價仍然有待探索。目前大多數(shù)關于細胞載體的研究僅在體外進行，動物實驗和人體試驗相對較少，其安全性尚未滿足臨床應用的要求。(3)細胞載體源于生物體，其提取制備過程復雜，目前難以實現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化制備。隨著研究的深入，今后會有更多類型的細胞應用于細胞載藥系統(tǒng)，其安全性也會進一步提高。相信細胞介導的藥物遞送系統(tǒng)會為藥物的靶向遞送及精準治療提供一種新思路。