米諾環(huán)素對(duì)脊髓損傷大鼠凋亡機(jī)制探索和神經(jīng)紅蛋白表達(dá)的影響

陳萌，馬衛(wèi)軍，馬泉，劉勝，王愛樂

脊髓損傷是一種致殘率高、預(yù)后較差的疾病，主要的病理改變是缺血、缺氧誘導(dǎo)的繼發(fā)性病理?yè)p傷。脊髓繼發(fā)性損傷的重要病理機(jī)制是神經(jīng)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的神經(jīng)元大量丟失，如何有效抑制這部分神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是治療脊髓損傷的關(guān)鍵［1-3］。米諾環(huán)素是四環(huán)素族藥物的衍生物，是一種安全有效的神經(jīng)保護(hù)劑，具有分子質(zhì)量小和易于透過(guò)血腦屏障的特點(diǎn)，長(zhǎng)期口服無(wú)明顯的不良反應(yīng)且安全有效［4］。2003年Wells等［5］首先將其應(yīng)用于脊髓損傷的動(dòng)物研究中，發(fā)現(xiàn)其可以顯著減少創(chuàng)傷后的組織壞死，保護(hù)脊髓白質(zhì)和脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素可以提高脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分［6-7］，但其主要作用機(jī)制和對(duì)細(xì)胞凋亡的影響尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)將米諾環(huán)素預(yù)防性地應(yīng)用于脊髓橫斷大鼠，旨在觀察其對(duì)脊髓橫斷大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3 和Ngb 蛋白表達(dá)及對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步預(yù)防和治療脊髓損傷提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與處理 健康雄性Wistar 大鼠36 只，體質(zhì)量200～250 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、脊髓損傷組、米諾環(huán)素干預(yù)組，每組12只。米諾環(huán)素預(yù)處理組大鼠術(shù)前腹腔注射米諾環(huán)素（90 mg/kg），1 次/d，連續(xù)5 d；脊髓損傷組和假手術(shù)組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。5 d后脊髓損傷組和米諾環(huán)素預(yù)處理組大鼠制備胸3～4節(jié)段交界處的脊髓全橫斷損傷模型。

1.2 藥物、試劑及儀器 米諾環(huán)素膠囊（惠氏制藥有限公司生產(chǎn)，100 mg/粒，批號(hào)：1001012），使用前溶于5 mL生理鹽水中，pH=5.7。一抗分別為兔抗Bcl-2 多克隆抗體（Gene Tex，美國(guó)）、兔抗Bax 單克隆抗體（AR Biosciences，美國(guó)）、兔抗Caspase-3多克隆抗體（Abcam，美國(guó)），濃縮型DAB顯色試劑盒和免疫組化試劑盒（北京中杉金橋公司）；鼠抗Ngb多克隆抗體（Santa Cruz，美國(guó)）；熒光二抗Alexa Fluor?594-羊抗鼠IgG（Invitrogen，美國(guó)）；Hoechst 33342（Sigma，美國(guó)）；倒置熒光顯微鏡、石蠟切片機(jī)（Leica，德國(guó)）。

1.3 動(dòng)物模型制備及給藥 脊髓損傷組和米諾環(huán)素干預(yù)組用4%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠。在無(wú)菌操作下，以第3 胸椎棘突為中心行背部縱行切口。于第3 胸椎椎骨節(jié)段行椎板切開術(shù)。在第3～4 胸椎節(jié)段脊髓交界處剪開硬脊膜和軟脊膜，用手術(shù)刀切斷脊髓，造成脊髓完全橫斷性損傷；術(shù)中注意保留脊髓后靜脈、兩側(cè)的脊髓后動(dòng)脈和脊髓前動(dòng)脈，保證脊髓下段的血液供應(yīng)［6-7］。建模成功大鼠肌張力消失同時(shí)出現(xiàn)損傷平面以下各種反射消失。假手術(shù)組與脊髓損傷組手術(shù)步驟一致，但暴露脊髓后不進(jìn)行橫斷，僅行椎板切除術(shù)。

1.4 病理學(xué)取材及觀察 術(shù)后第22 天，所有大鼠全身灌流固定后取損傷區(qū)脊髓及其上下部分。其中18例標(biāo)本（每組6例）進(jìn)行梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，5 μm 連續(xù)橫切片。HE染色觀察脊髓組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.5 Western blot檢測(cè)脊髓組織Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá) 術(shù)后第22 天，處死剩余大鼠，快速取出胸3～4 節(jié)段脊髓組織約100 mg，放入1.5 mL 離心管，在冰上將組織剪碎。加入蛋白裂解液1 mL 勻漿，12 000 r/min 離心15 min，取上清。蛋白定量后按照4∶1 加入5×SDS buffer，95 ℃煮沸5 min變性，迅速冰浴，-80 ℃保存。每孔上樣30μg蛋白行十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）；PVDF轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜條件：電流100 mA，濕轉(zhuǎn)30 min）。5%脫脂奶粉封閉，分別加入一抗兔抗Bcl-2 多克隆抗體（1∶1 000）、兔抗Bax 單克隆抗體（1∶2 000）、兔抗Caspase-3多克隆抗體（1∶1 000）或β-actin 抗體于4 ℃過(guò)夜；洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h；洗膜，發(fā)光，顯色劑顯影，X 射線膠片定影。掃描后應(yīng)用Image Pro Plus 6.0 軟件分析目的條帶的灰度值，以目的條帶和βactin條帶的積分光密度（IOD）比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 免疫組化染色觀察Bcl-2、Bax 和Caspase-3的表達(dá) 術(shù)后第22天，所有大鼠全身灌流固定后取損傷區(qū)脊髓及其上下部分。每組取6例標(biāo)本進(jìn)行梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋后5μm連續(xù)切片。檸檬酸鈉溶液進(jìn)行熱修復(fù)，3%H2O2封閉，加山羊血清室溫孵育，分別滴加一抗兔抗Bcl-2多克隆抗體（1∶200）、兔抗Bax單克隆抗體（1∶250）、兔抗Caspase-3多克隆抗體（1∶500）4 ℃過(guò)夜，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。PBS沖洗后滴加二抗，37 ℃孵育10 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白工作液37 ℃孵育10 min。DAB顯色，常規(guī)蘇木素復(fù)染。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.7 Hoechst 染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將上述組織切片經(jīng)過(guò)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟、梯度乙醇脫水，PBS清洗2次，每次3 min，吸盡液體；加入0.5 mL Hoechst 33342 工作液，于搖床上避光染色5 min；PBS 搖洗2遍，去染液，每次3 min，50%甘油緩沖液封片。倒置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞核明顯固縮，呈碎塊狀致密濃染的為凋亡細(xì)胞，正常細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色。在200倍鏡下每組取5個(gè)視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)。

1.8 免疫熒光檢測(cè)脊髓組織中Ngb 熒光強(qiáng)度 將石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水，PBS 搖洗，用0.25%Trion X 100室溫處理30 min，PBS 搖洗3 次，將切片放入檸檬酸緩沖液（95～98 ℃）中20 min 進(jìn)行抗原修復(fù)，待恢復(fù)至室溫后取出切片，PBS浸泡5 min。滴加10%山羊血清室溫封閉切片60 min。滴加30μL鼠抗Ngb IgG 多克隆抗體（1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜。次日取出，室溫放置30 min 后用PBS 搖洗。避光滴加山羊抗鼠-594 IgG熒光二抗30μL（1∶200），孵育60 min，PBS搖洗3次。封片劑封片，蓋玻片四周涂指甲油封固，4 ℃避光保存。在高倍視野下隨機(jī)選取5 個(gè)互不重疊的區(qū)域拍攝照片，利用Image Pro Plus 6.0分析各組圖像中Ngb的免疫熒光強(qiáng)度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。2組間均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)學(xué)觀察及分析 假手術(shù)組脊髓組織結(jié)構(gòu)正常，脊髓損傷組脊髓組織正常結(jié)構(gòu)消失，灰質(zhì)可見有較大空腔，膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，白質(zhì)區(qū)出現(xiàn)數(shù)量不等的微囊；米諾環(huán)素干預(yù)組脊髓組織結(jié)構(gòu)較清晰，空腔體積減小，僅輕度膠質(zhì)細(xì)胞增生。米諾環(huán)素干預(yù)微囊數(shù)量和空腔體積均較脊髓損傷組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖1。

Tab.1 Analysis of optical measurement three weeks after operation表1 術(shù)后3周光鏡下計(jì)量分析（n=6，±s）

Tab.1 Analysis of optical measurement three weeks after operation表1 術(shù)后3周光鏡下計(jì)量分析（n=6，±s）

＊＊P＜0.05

組別脊髓損傷組米諾環(huán)素干預(yù)組t微囊（個(gè)/視野）33.50±1.87 18.00±2.53 12.067＊＊空腔（像素點(diǎn)）148.67±14.81 57.50±6.54 13.792＊＊

Fig.1 HE staining of spinal cord tissues in three groups(×200)圖1 各組大鼠脊髓組織HE染色（×200）

2.2 Western blot結(jié)果 與假手術(shù)組比較，脊髓損傷組脊髓組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)明顯升高；與脊髓損傷組比較，米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠脊髓組織Bcl-2表達(dá)明顯升高（P＜0.05），Bax、Caspase-3表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖2、表2。

Fig.2 Western blot analysis of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in three groups圖2 Western blot 檢測(cè)各組Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)

Tab.2 The relative expression of Bcl-2,Bax and Caspase-3 proteins in spinal cord tissues of three groups表2 各組大鼠脊髓組織Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量 （n=6，±s）

Tab.2 The relative expression of Bcl-2,Bax and Caspase-3 proteins in spinal cord tissues of three groups表2 各組大鼠脊髓組織Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與脊髓損傷組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組脊髓損傷組米諾環(huán)素干預(yù)組F Bcl-2 0.96±0.04 1.41±0.12a 1.84±0.09ab 147.831＊＊Bax 0.22±0.04 0.93±0.04a 0.36±0.06ab 337.223＊＊Caspase-3 0.12±0.01 0.46±0.09a 0.34±0.04ab 54.972＊＊

2.3 免疫組化結(jié)果 脊髓灰質(zhì)中Bcl-2、Bax 和Caspase-3 的免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。Bcl-2主要分布在胞質(zhì)中，著黃色；Bax分布在神經(jīng)元胞膜和胞質(zhì)中，呈黃色或棕黃色；Caspase-3 分布在脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞質(zhì)、胞核和突起中，呈黃色或棕黃色。與假手術(shù)組相比，脊髓損傷組Bcl-2、Bax 和Caspase-3 陽(yáng)性細(xì)胞均明顯增多且著色較深；而與脊髓損傷組相比，米諾環(huán)素干預(yù)組Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較脊髓損傷組增加更為明顯（P＜0.05），而Bax 陽(yáng)性細(xì)胞和Caspase-3 陽(yáng)性細(xì)胞較脊髓損傷組有所減少（P＜0.05）。見圖3、表3。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 熒光顯微鏡下可見假手術(shù)組幾乎沒有凋亡細(xì)胞，脊髓損傷組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于假手術(shù)組，米諾環(huán)素干預(yù)組凋亡細(xì)胞數(shù)較脊髓損傷組有所減少（P＜0.05）。見圖4、表4。

2.5 3組Ngb免疫熒光染色結(jié)果 在大鼠脊髓組織中Ngb陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)紅色熒光。假手術(shù)組Ngb呈少量的胞質(zhì)表達(dá)，熒光強(qiáng)度較低；脊髓損傷組Ngb的表達(dá)有所增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度較假手術(shù)組增加；而米諾環(huán)素干預(yù)組Ngb的熒光強(qiáng)度較脊髓損傷組顯著增強(qiáng)。見圖5、表4。

Tab.3 Comparison of Bcl-2,Bax and Caspase-3 positive cells in spinal cord tissue between three groups表3 各組大鼠脊髓組織Bcl-2、Bax和Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞的比較（n=6，個(gè)/視野，±s）

Tab.3 Comparison of Bcl-2,Bax and Caspase-3 positive cells in spinal cord tissue between three groups表3 各組大鼠脊髓組織Bcl-2、Bax和Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞的比較（n=6，個(gè)/視野，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與脊髓損傷組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組脊髓損傷組米諾環(huán)素干預(yù)組F Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞5.00±0.63 32.83±3.00a 59.50±1.76ab 1 038.977＊＊Bax陽(yáng)性細(xì)胞1.00±0.63 76.33±2.42a 53.00±2.10ab 2 509.750＊＊Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞2.33±1.21 50.33±3.14a 32.83±2.32ab 636.018＊＊

Tab.4 Comparison of the number of apoptotic cells and the fluorescence intensity of Ngb positive cells between three groups表4 各組大鼠凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)及Ngb陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度的比較 （n=6，±s）

Tab.4 Comparison of the number of apoptotic cells and the fluorescence intensity of Ngb positive cells between three groups表4 各組大鼠凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)及Ngb陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度的比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與脊髓損傷組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組脊髓損傷組米諾環(huán)素干預(yù)組F凋亡細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）0.50±0.55 19.33±2.16a 14.83±2.04ab 190.639＊＊Ngb免疫陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度0.60±0.03 1.10±0.05a 1.31±0.06ab 315.291＊＊

Fig.3 Immunohistochemical results of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in three groups of rats(×400)圖3 各組大鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3免疫組化結(jié)果（×400）

Fig.4 Results of apoptotic staining in three groups of rats(Immunofluorescence stainning，×200)圖4 各組大鼠細(xì)胞凋亡染色結(jié)果（免疫熒光染色，×200）

Fig.5 Results of immunofluorescence staining of Ngb protein in three groups(×400)圖5 各組Ngb免疫熒光染色結(jié)果（×400）

3 討論

脊髓損傷是一種高致殘率的嚴(yán)重創(chuàng)傷，包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性改變。脊髓功能喪失主要是由繼發(fā)改變引起的，在損傷急性期通過(guò)減輕或消除繼發(fā)性病理變化、保護(hù)殘存的軸突和神經(jīng)元不再遭受二次損傷，是目前關(guān)于脊髓損傷藥物治療研究的重點(diǎn)。原發(fā)性損傷為不可逆改變，故治療脊髓損傷主要應(yīng)防止脊髓的繼發(fā)性損傷。脊髓繼發(fā)性損傷的主要病理變化是神經(jīng)細(xì)胞死亡，發(fā)生在脊髓損傷后急性期，以細(xì)胞腫脹破裂為主要形式；細(xì)胞凋亡是脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要方式，主要是由內(nèi)源性內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致的程序性細(xì)胞死亡，是由多基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程。脊髓損傷主要是由損傷后水腫的發(fā)展，激發(fā)一系列的分子和細(xì)胞機(jī)制，引發(fā)炎癥反應(yīng)等，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡和壞死［9］。脊髓損傷后給予米諾環(huán)素可以調(diào)節(jié)半胱天冬酶的活性，抑制Caspase-1 和Caspase-3 的激活，減少細(xì)胞凋亡［10］。Festoff等［11］也報(bào)道米諾環(huán)素對(duì)脊髓損傷的治療作用，研究結(jié)果顯示米諾環(huán)素可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

有研究表明，Bcl-2、Bax 蛋白和Caspase-3 在脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡中具有非常重要的參考價(jià)值［12］。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制或有效阻止脊髓損傷后各種途徑引起的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)損傷神經(jīng)組織的修復(fù)［13］。Bax蛋白位于細(xì)胞質(zhì)的線粒體內(nèi)，脊髓損傷后可刺激Bax 蛋白使線粒體膜的通透性發(fā)生變化，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平直接影響脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，且凋亡的程度和Bcl-2/Bax呈正相關(guān)［14］。Caspase-3是凋亡的“分子開關(guān)”，控制著凋亡的啟動(dòng)，其活性一定程度上可反應(yīng)脊髓損傷部位細(xì)胞凋亡的狀況［15］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)Bcl-2、Bax 和Caspase-3 的表達(dá)情況，觀察米諾環(huán)素干預(yù)對(duì)損傷脊髓組織凋亡蛋白的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠脊髓組織Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯高于脊髓損傷組，同時(shí)Bax蛋白和Caspase-3 蛋白的表達(dá)在對(duì)應(yīng)時(shí)間明顯低于脊髓損傷組。表明預(yù)防性應(yīng)用米諾環(huán)素可使脊髓損傷大鼠Bcl-2 蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax 和Caspase-3 的蛋白表達(dá)下調(diào)，因而有效抑制了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

Ngb 蛋白是Burmester 等［16］于2000年首次在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種脊椎動(dòng)物攜氧球蛋白，有助于轉(zhuǎn)運(yùn)氧通過(guò)血腦屏障和血脊屏障，從而提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧的利用率。目前在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及缺血的研究方面有較多報(bào)道。于如同等［17］研究了神經(jīng)紅蛋白在脊髓中的表達(dá)與分布情況，發(fā)現(xiàn)Ngb位于神經(jīng)元的胞質(zhì)中，主要集中在脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。其功能可能在于促進(jìn)氧向神經(jīng)元線粒體的擴(kuò)散，供給線粒體能量。因此，Ngb能增加神經(jīng)細(xì)胞的氧供應(yīng)，提高神經(jīng)細(xì)胞的功能和存活率?？琢顒俚龋?8］在研究神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)紅蛋白的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)脊髓損傷組大鼠脊髓在損傷后Ngb陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目、光密度值較正常組增加，神經(jīng)干細(xì)胞移植組大鼠Ngb免疫陽(yáng)性的神經(jīng)元染色強(qiáng)度逐漸增加，在損傷后第14 天達(dá)到最高值，表達(dá)高峰較脊髓損傷組明顯延長(zhǎng)，經(jīng)胚胎干細(xì)胞移植后能明顯上調(diào)Ngb的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素干預(yù)脊髓橫斷損傷大鼠后，米諾環(huán)素干預(yù)組Ngb 的平均熒光強(qiáng)度較脊髓損傷組明顯增強(qiáng)。Ngb 的免疫熒光結(jié)果同脊髓組織Hoechst 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。米諾環(huán)素干預(yù)組的凋亡細(xì)胞數(shù)較脊髓損傷組明顯減少。因此，米諾環(huán)素能上調(diào)Ngb的表達(dá)，進(jìn)而減少脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，具體的調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。臨床上甲潑尼龍具有神經(jīng)保護(hù)作用，其治療脊髓損傷有最佳的時(shí)間窗［19］。而米諾環(huán)素應(yīng)用于脊髓損傷是否有時(shí)間窗，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，期望米諾環(huán)素能從多方位、多靶點(diǎn)對(duì)脊髓損傷患者進(jìn)行有效的防治。