NOD2、TNF-α、MMP-9及Caspase-3在胎膜早破發(fā)病中的作用及意義

宋春紅，馬倩，甄娟，許紅，劉洋，畢學杰△

胎膜在臨產(chǎn)前自發(fā)性破裂稱為胎膜早破（premature rupture of the fetal membranes, PROM）。胎膜早破導致早產(chǎn)發(fā)生率升高，宮內(nèi)及產(chǎn)褥感染率皆增加，嚴重危害母嬰安全。導致胎膜早破發(fā)生的原因眾多，包括感染因素、社會因素及遺傳因素等。宮內(nèi)感染及由此導致的炎癥反應在胎膜早破發(fā)生中發(fā)揮了重要作用［1］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體2 （nucleotide - binding oligomerization domaincontaining 2，NOD2）是固有免疫的胞質(zhì)受體，能識別革蘭陽性菌及陰性菌的肽聚糖，介導病原體所產(chǎn)生的炎癥反應。目前對NOD2及其下游轉(zhuǎn)導通路在胎膜早破發(fā)病中作用的研究較少。本研究檢測了NOD2、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9、活化型Caspase-3在胎膜早破胎膜組織中的表達及羊水中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，探討各分子表達的相關(guān)性，為胎膜早破的預防和治療探索新的靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月—2016年12月在石家莊市第四醫(yī)院住院的產(chǎn)婦90 例。其中足月胎膜早破組（tPROM組，妊娠滿37 足周）30 例，平均年齡（29.3±2.7）歲；未足月胎膜早破組（pPROM 組，妊娠不滿37 足周）30 例，平均年齡（26.2±4.0）歲；正常妊娠晚期婦女（對照組）30 例，平均年齡（28.7±3.5）歲。各組均以剖宮產(chǎn)結(jié)束妊娠，無妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓綜合征等產(chǎn)科并發(fā)癥，且均為單胎初產(chǎn)，在臨產(chǎn)前未接受抗生素治療。胎膜早破的診斷標準參考全國高等學校教材《婦產(chǎn)科學》第7版。該試驗經(jīng)石家莊市第四醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，并取得孕產(chǎn)婦本人同意后取得標本。

1.2 標本采集 羊水采集：在行剖宮產(chǎn)術(shù)時切開子宮肌層、胎膜充分暴露后，取羊水5 mL，所取羊水均于室溫下2 500 r/min離心5 min，取上清液，-70 ℃冰箱保存集中待測。胎膜采集：胎盤娩出后，立即取胎膜破口處全層胎膜組織5～10 g，以無菌0.9%氯化鈉溶液漂洗干凈，一部分組織吸干水分后置于凍存管中，-70 ℃保存、備用；另一部分于中性甲醛溶液固定后常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片。

1.3 主要試劑 兔抗人MMP-9單克隆一抗購自上?；蚩萍加邢薰荆∈罂谷薔OD2單克隆一抗購自美國Santa Cruz公司，兔抗人活化型Caspase-3 單克隆一抗、兔抗人β-actin單克隆一抗、TNF-α ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程公司，山羊抗兔/小鼠二抗購自上?；蚩萍加邢薰?。

1.4 免疫組織化學染色檢測胎膜組織中NOD2、MMP-9及活化型Caspase-3 的表達 免疫組化染色采用SP 法。胎膜組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，微波加熱修復抗原；3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；采用山羊血清于室溫封閉；一抗4 ℃冰箱過夜，采用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）代替一抗作為陰性對照。隔日PBS 洗滌，滴加抗體增強劑，37 ℃孵育20 min；沖洗后二抗37 ℃孵育20 min，PBS 洗滌后，采用DAB 染色，于顯微鏡下控制染色強度；自來水沖洗，蘇木素復染、鹽酸乙醇分化、氨水返藍；常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片、鏡檢。檢測NOD2、MMP-9及活化型Caspase-3在胎膜組織中的表達。以細胞膜/細胞質(zhì)/細胞核出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色為陽性，在顯微鏡下不著色或個別細胞淺著色等判讀為陰性。

1.5 Western blot 檢測 胎膜組織NOD2、MMP-9 及活化型Caspase-3 的表達水平 剪碎胎膜組織，加入細胞裂解液RIPA提取蛋白。檢測蛋白濃度后，每孔上樣60μg。行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，PBS 洗膜后，一抗4 ℃過夜，洗膜后加入二抗，37 ℃孵育1 h，用化學發(fā)光劑避光反應，將硝酸纖維素膜放至暗室中曝光顯影。以β-actin 為內(nèi)參照，目的蛋白與其相比進行半定量分析。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測羊水TNF-α 水平 采用雙抗體夾心ELISA測定羊水中TNF-α水平，操作方法嚴格按說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 15.0 軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t 法，采用Pearson相關(guān)進行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NOD2、MMP-9、活化型Caspase-3 在胎膜組織中的定位 免疫組織化學染色結(jié)果顯示，NOD2、MMP-9、活化型Caspase-3 主要表達于胎膜組織羊膜上皮細胞和絨毛膜滋養(yǎng)細胞胞質(zhì)，弱表達于蛻膜細胞胞質(zhì)，MMP-9 還表達于中性粒細胞胞質(zhì)，見圖1。

2.2 各組胎膜組織中NOD2、MMP-9 及活化型Caspase-3 的表達水平 Western blot 結(jié)果顯示，tPROM 組、pPROM 組NOD2、MMP-9 及 活 化 型Caspase-3 相對表達水平高于對照組（P＜0.05），pPROM 組NOD2 表達高于tPROM 組（P＜0.05），tPROM 組與pPROM 組MMP-9、活化型Caspase-3 表達水平相比差異無統(tǒng)計學意義，見表1、圖2。

Fig.1 Expressions of NOD2,MMP-9 and activated Caspase-3 in fetal membranes(IHC,×100)圖1 NOD2、MMP-9及活化型Caspase-3在胎膜組織中的表達（IHC，×100）

Tab.1 Comparison of relative expression levels of NOD2,MMP-9 and activated Caspase-3 proteins between three groups表1 各組相關(guān)蛋白相對表達量的比較 （n=30，±s）

Tab.1 Comparison of relative expression levels of NOD2,MMP-9 and activated Caspase-3 proteins between three groups表1 各組相關(guān)蛋白相對表達量的比較 （n=30，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與tPROM組比較，P＜0.05

組別對照組tPROM組pPROM組F NOD2/β-actin 0.22±0.08 0.46±0.10a 0.52±0.08ab 95.563＊＊MMP-9/β-actin 0.98±0.21 1.28±0.15a 1.29±0.20a 27.660＊＊活化型Caspase-3/β-actin 0.27±0.08 0.68±0.10a 0.71±0.11a 191.230＊＊

Fig.2 Expression levels of NOD2,MMP-9 and activated Caspase-3 in fetal membranes of three groups圖2 胎膜組織中的NOD2、MMP-9及活化型Caspase-3蛋白表達

2.3 各組羊水中TNF-α 水平 tPROM 組、pPROM組羊水TNF-α 水平分別為（34.48±13.32）ng/L 及（56.40±11.66）ng/L，較對照組（8.89±3.37）ng/L 明顯升高（F=156.712，P＜0.01），pPROM 組水平高于tPROM組（P＜0.05）。

2.4 相關(guān)性分析 針對胎膜早破組的Pearson 相關(guān)分析顯示，胎膜組織NOD2 表達水平與羊水TNF-α水平呈正相關(guān)（r=0.373，P＜0.01），與胎膜組織中MMP-9的表達呈正相關(guān)（r=0.412，P＜0.01），與胎膜組織中活化型Caspase-3 的表達呈正相關(guān)（r=0.448，P＜0.01）。

3 討論

本研究顯示，在胎膜早破患者，胎膜組織NOD2、MMP-9、活化型Caspase-3 表達及羊水TNFα水平升高，胎膜組織NOD2表達水平與羊水TNF-α水平呈正相關(guān)，與胎膜組織中MMP-9、活化型Caspase-3的表達呈正相關(guān)，表明NOD2及其下游信號轉(zhuǎn)導通路分子激活/表達增加，在胎膜早破的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

3.1 MMP-9 與胎膜早破 完整的胎膜可以阻擋病原微生物上行感染，從而維持羊膜腔的無菌環(huán)境。任何影響胎膜的完整性、彈性和張力強度的因素都可以導致胎膜早破［2］。MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，是鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，激活后主要形成Ⅳ型膠原酶，降解細胞外基質(zhì)的明膠和Ⅳ、Ⅴ型膠原，在分娩發(fā)動及胎膜早破過程中發(fā)揮作用。宮頸陰道液體中MMP-9水平在妊娠前期處于較低水平，在妊娠37周后明顯升高。在胎膜早破患者，血漿鋅水平升高，羊水和血漿中MMP-9 水平增加，而血清及胎膜中Ⅳ膠原含量下降，表明血漿鋅濃度增加導致MMP-9水平升高，從而降解胎膜組織中的Ⅳ膠原［3］。本研究直接檢測了胎膜組織中MMP-9表達水平，發(fā)現(xiàn)其在胎膜早破組明顯高于正常對照組。MMP-9水解胎膜組織的細胞外基質(zhì)后，導致胎膜組織的脆性增加，尤其是在宮頸附近胎膜組織形成薄弱區(qū)，促進了胎膜早破的發(fā)生。

3.2 細胞凋亡與胎膜早破 細胞凋亡是一種基因控制的細胞自主性死亡過程，參與了許多疾病的發(fā)生發(fā)展。胎膜早破與細胞凋亡之間存在密切關(guān)系。胎膜早破患者胎膜組織中DNA 片段、Fas 及Caspase-8 表達增加，促凋亡蛋白Bax 及P53 表達增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2 表達減少［4］。Caspase-3位于凋亡信號轉(zhuǎn)導通路的最末端，是細胞凋亡的最終執(zhí)行者和特異性分子標記之一。本研究發(fā)現(xiàn)，胎膜早破患者活化型Caspase-3表達增加，胎膜細胞死亡增多，脆性增加，從而導致胎膜早破。其發(fā)生原因為宮內(nèi)感染發(fā)生時，促炎細胞因子級聯(lián)反應被激活，細胞因子如TNF-α 促進腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白（TNFR-associated death domain protein,TFADD）表達，從而激活caspase基因表達，誘導細胞凋亡［5］。另外宮內(nèi)感染發(fā)生時MMP 增加導致細胞外基質(zhì)降解后，對細胞的形態(tài)和功能的支持作用喪失，胎膜細胞形態(tài)、功能發(fā)生改變，導致細胞凋亡。

3.3 TNF-α 與胎膜早破 TNF-α 是一種生物學功能廣泛的多肽細胞因子，能夠促進炎性反應，并能誘導細胞凋亡，是重要的炎性介質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子。在胎盤及其附屬物中，蛻膜細胞、絨毛膜細胞、羊膜細胞及滋養(yǎng)細胞等也能產(chǎn)生一部分TNF-α。本研究表明，在胎膜早破患者羊水中TNF-α 水平升高，結(jié)合文獻及本研究結(jié)果，TNF-α 導致胎膜早破的機制如下：（1）與腫瘤壞死因子受體1 結(jié)合后，通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 及絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）途徑誘導MMP-9 表達［6］，促進胎膜細胞外基質(zhì)降解。（2）如上所述，TNF-α 與受體結(jié)合，募集TFADD，激活Caspase-8，最終激活Caspase-3 而發(fā)揮促細胞凋亡作用［5］。（3）MMP-9降解細胞外基質(zhì)促進細胞凋亡，并通過裂解膜結(jié)合細胞因子如TNF-α進一步促進細胞凋亡，而凋亡又可誘導MMP-9激活，由此形成正循環(huán)促進胎膜早破的發(fā)生。（4）在體外培養(yǎng)羊膜細胞中，TNF-α促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低羊膜破裂所需時間及機械壓力，促進胎膜破裂［7］。

3.4 NOD2 與TNF-α、MMP-9、Caspase-3 及胎膜早破 NOD2 屬于胞漿內(nèi)NOD 樣受體家族，作為胞內(nèi)的模式識別受體，可以識別革蘭陰性菌及陽性菌的胞壁酰二肽，可以抵御多種細菌，在宿主防御病原體中起到重要作用。NOD 信號轉(zhuǎn)導可以激活NF-κB及MAPK 途徑［8］，在調(diào)節(jié)基因表達及細胞功能活動中發(fā)揮重要作用。研究顯示NOD2存在于妊娠相關(guān)組織，并發(fā)揮病理生理作用，妊娠早期蛻膜間質(zhì)細胞表達NOD2，在配體胞壁酰二肽刺激下NOD2表達水平升高，蛻膜間質(zhì)細胞分泌白細胞介素（IL）-1β 等促炎細胞因子，且蛻膜間質(zhì)細胞凋亡增加［9］。胎膜早破患者胎兒體內(nèi)NOD2 基因存在突變，表明參與固有免疫的基因突變在胎膜早破的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用［10］。在體外培養(yǎng)胎膜組織中，NOD2 在配體胞壁酰二肽刺激下可以促進胎膜組織TNF-α 及MMP-9 分泌［11］。本研究顯示NOD2 在胎膜早破患者胎膜組織中表達升高，且與TNF-α、MMP-9、活化型Caspase-3表達呈正相關(guān)，表明NOD2在胎膜早破發(fā)動過程中起到重要作用，與TNF-α、MMP-9、活化型Caspase-3表達相關(guān)，TNF-α又可以促進NOD2表達，并誘導MMP-9 產(chǎn)生及細胞凋亡，從而形成正反饋，促進細胞外基質(zhì)降解和胎膜細胞凋亡，導致胎膜早破的發(fā)生。

綜上，胎膜早破患者胎膜組織中NOD2、MMP-9、活化型Caspase-3 表達水平升高，羊水中TNF-α水平增加，四者表達存在關(guān)聯(lián)作用，提示在胎膜早破發(fā)生發(fā)展中，NOD2信號轉(zhuǎn)導途徑激活，導致炎性細胞因子升高、胎膜細胞外基質(zhì)降解及胎膜細胞凋亡，從而為胎膜早破的病因?qū)W研究提供了新的視角。