內(nèi)蒙勝利褐煤生物產(chǎn)氣前后微生物群落變化

趙 晗，何 環(huán)，王江澤，譚凱麗，趙 娜，任恒星

(1.山西晉城無煙煤礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司 煤與煤層氣共采國家重點實驗室，山西 晉城 048000; 2.中國礦業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院,江蘇 徐州 221116; 3.中國礦業(yè)大學(xué) 煤炭加工與高效潔凈利用教育部重點實驗室，江蘇 徐州 221116; 4.易安藍(lán)焰煤與煤層氣共采技術(shù)有限責(zé)任公司，山西 晉城 048000)

煤的生物產(chǎn)氣是由產(chǎn)甲烷相關(guān)功能菌厭氧代謝煤或煤層物質(zhì)產(chǎn)生的以甲烷為主要成分的氣體[1-2]。已有研究表明，褐煤中含有較多有機(jī)物質(zhì)，所以容易被本源和外源微生物降解形成生物氣[3-4]。我國擁有豐富的褐煤資源，主要分布在內(nèi)蒙和云南等地，其中內(nèi)蒙褐煤約占我國褐煤資源的70%，因此對內(nèi)蒙褐煤資源開展生物產(chǎn)氣研究對拓寬煤炭清潔利用途徑具有重要意義。

目前國內(nèi)外學(xué)者對煤生物產(chǎn)氣環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)研究表明，不同來源樣品中微生物群落組成差異較大[5-6]。HE等[7]發(fā)現(xiàn)山東趙樓一處不產(chǎn)煤層氣煤層水樣品中細(xì)菌種類豐富而產(chǎn)甲烷古菌豐度較低。而DARIUSZ等[8]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌Methanocorpusculum是伊利諾斯盆地環(huán)境中的主要菌屬。也有研究人員報道日本近海的海底煤層中存在一類能夠直接利用煤中苯甲氧基化合物形成甲烷的古菌Methermicoccus[9-10]。

研究過程中也發(fā)現(xiàn)同一個取樣點的煤層和煤層水中微生物群落也存在較大差異[11]。DONALD等[12]研究發(fā)現(xiàn)粉河盆地煤層中的產(chǎn)甲烷菌主要有Methanobacterium等古菌，而地下水中主要為Methanocaldococcus等古菌。GUO等[13]發(fā)現(xiàn)鄂爾多斯盆地中煤層水、煤和巖石表面微生物分布存在差異，其中煤和巖石表面的細(xì)菌組成較接近，但是和煤層水中細(xì)菌組成差異卻很大，古菌Methanolobus在水、煤和巖石表面分布均較多，而Methanobacterium卻僅在煤中有分布。VICK等[14]報道產(chǎn)氣初期Desulfuromonas，Campylobacter，Sulfurospirillum和Streptobacillus是吸附到煤表面的微生物，而游離體系中豐度最高的微生物卻是產(chǎn)甲烷古菌?？梢?，不同來源的環(huán)境樣品以及同一樣品不同時間和空間的微生物群落組成均存在差異。

也有研究人員報道不同來源富集到的外源環(huán)境微生物樣品也可以利用其他礦區(qū)開采煤進(jìn)行生物產(chǎn)氣[6-7]。晉城是我國重要的無煙煤產(chǎn)區(qū)，前期研究表明該地區(qū)寺河礦煤層氣抽采排出水中微生物富集樣品可以利用無煙煤進(jìn)行生物產(chǎn)氣[15]，但是否也可以利用褐煤產(chǎn)氣卻不清楚。筆者利用寺河礦區(qū)煤層氣抽采井排出水富集菌群作為產(chǎn)氣微生物，內(nèi)蒙勝利褐煤作為產(chǎn)氣底物，在實驗室進(jìn)行褐煤微生物產(chǎn)氣模擬實驗，采用高通量測序方法分析了產(chǎn)氣前后微生物菌群組成變化情況，并對產(chǎn)氣前后煤的物化性質(zhì)進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 褐煤樣品采集及理化性質(zhì)分析

煤樣取自內(nèi)蒙古神華北電勝利露天煤礦褐煤5號煤層，試驗時將煤樣破碎篩分至1～2 mm顆粒進(jìn)行生物產(chǎn)氣模擬試驗。其中煤工業(yè)分析和元素分析按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 30732—2014和GB/T 31391—2015進(jìn)行。

1.2 產(chǎn)氣菌群富集培養(yǎng)和生物產(chǎn)氣實驗

實驗采用寺河礦區(qū)煤層氣井產(chǎn)出水，采集水樣后置于厭氧發(fā)酵罐內(nèi)添加培養(yǎng)基和寺河礦開采新鮮無煙煤煤塊進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)基制備方法同文獻(xiàn)[15]。定期放出部分菌液，補充等量新鮮培養(yǎng)基，減少有害代謝產(chǎn)物對菌群產(chǎn)氣能力的影響，待產(chǎn)氣能力穩(wěn)定后作為菌液待用。

選用500 mL厭氧瓶進(jìn)行褐煤產(chǎn)氣實驗，設(shè)置試驗組和對照組，每組3個平行，實驗數(shù)據(jù)為平均值。對照組加入250 mL培養(yǎng)基和50 mL菌液;試驗組，加入等量培養(yǎng)基、菌液和10 g煤樣。實驗時，在厭氧工作站(英國，DWS DG1000)中按設(shè)置分裝好培養(yǎng)基、菌液和煤樣，密封保證厭氧環(huán)境，35 ℃恒溫培養(yǎng)。每7 d檢測氣體組分，并記錄產(chǎn)氣量，同時在實驗初期、末期分別取樣進(jìn)行高通量測序，分析微生物群落結(jié)構(gòu)。

產(chǎn)氣過程中氣體組分采用美國Angilent 7890 氣相色譜儀分析，配Carbonplot色譜柱(60 m×320 μm×1.5 μm)和 TCD 檢測器，氣密針進(jìn)樣，進(jìn)樣量0.5 mL。色譜進(jìn)樣口溫度150 ℃，柱溫箱溫度30 ℃，檢測器溫度200 ℃[15]。甲烷體積分?jǐn)?shù)=甲烷實際出峰面積×甲烷標(biāo)氣中甲烷體積分?jǐn)?shù)/標(biāo)氣中甲烷平均峰面積。為準(zhǔn)確研究煤樣產(chǎn)甲烷率，通過去除對照組產(chǎn)甲烷量計算凈產(chǎn)甲烷率。凈產(chǎn)甲烷率計算公式為

Q=(qncn-q0c0)/m

式中，qn為試驗組產(chǎn)氣量，mL;cn為試驗組產(chǎn)甲烷體積分?jǐn)?shù)，%;q0為對照組產(chǎn)氣量，mL;c0為對照組產(chǎn)甲烷體積分?jǐn)?shù)，%;m為實驗所用煤量，g。

1.3 褐煤產(chǎn)氣前后菌群結(jié)構(gòu)和煤物化性質(zhì)分析

取10 mL培養(yǎng)液(包含煤粉)樣品10 000 rpm離心收集沉淀，采用試劑盒(EZNA water DNA kit，OMEGA)提取沉淀樣品中基因組DNA，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提基因組的完整性，利用 Qubit2.0 DNA 試劑盒檢測基因組 DNA 濃度。利用特異性引物PCR擴(kuò)增V3-V4可變區(qū)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，采用DNA膠回收試劑盒(RTP2201，中科瑞泰)對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收?；厥盏腜CR產(chǎn)物通過Qubit2.0 DNA 檢測試劑盒精確定量，并添加測序標(biāo)簽，采用賽哲生物的 Illumina測序平臺完成對樣品高通量測序。測序結(jié)果采用分析軟件將序列按照序列相似性為97%的閾值進(jìn)行OTUs(operational taxonomic units)操作分類單元聚類，此外對樣品序列進(jìn)行Alpha多樣性統(tǒng)計分析，包括ACE，Chao1，OTUs和Shannon等。其中Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，是反映豐富度和均勻性的綜合指標(biāo)，群落豐富度的指數(shù)主要包括Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)，群落多樣性的指數(shù)主要包括Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。

褐煤生物產(chǎn)氣實驗后，用無菌超純水浸泡洗滌3次，室溫下充分干燥后，對殘煤進(jìn)行工業(yè)分析和元素分析。另取部分產(chǎn)氣前后煤樣品用于電鏡(ZEISS EVO MA15)觀察，原煤干燥后直接用離子濺射儀噴金(ETD-2000C)觀察，殘煤先使用2.5%(V/W)戊二醛在pH 7.2的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液固定2.5 h，然后對樣品進(jìn)行乙醇逐級脫水[16]并在空氣干燥24～48 h后，噴金觀察煤表面微生物形貌特征。

圖1 褐煤產(chǎn)甲烷變化曲線Fig.1 Methane product curves of lignite

2 結(jié)果與討論

2.1 勝利褐煤生物產(chǎn)氣

褐煤生物產(chǎn)氣試驗結(jié)果如圖1所示，對照組在0～7 d有短暫的延滯期，接種微生物利用培養(yǎng)基進(jìn)行大量繁殖，7～14 d開始有甲烷產(chǎn)生，體積分?jǐn)?shù)緩慢上升，在14 d達(dá)到峰值4%，利用完可用有機(jī)物后，產(chǎn)氣停滯甲烷體積分?jǐn)?shù)保持不變，累計產(chǎn)甲烷量為4.7 mL。相比之下試驗組因反應(yīng)體系中加有煤樣，可利用底物豐富，微生物快速繁殖代謝，0～7 d甲烷體積分?jǐn)?shù)達(dá)4.5%，7～14 d甲烷體積分?jǐn)?shù)速增至25%，隨后產(chǎn)氣開始緩慢穩(wěn)定的持續(xù)升高，峰值達(dá)41%，42 d后甲烷體積分?jǐn)?shù)降低，產(chǎn)氣周期結(jié)束。整個實驗周期內(nèi)累計產(chǎn)甲烷量為83.1 mL，凈產(chǎn)甲烷率為7.84 mL/g。

有報道稱褐煤利用外源產(chǎn)甲烷菌群的產(chǎn)氣周期為28 d，可以分為產(chǎn)氣速率顯著增高、緩慢增高、趨于停止3個階段[7]，這與本研究中外源產(chǎn)甲烷菌群產(chǎn)氣規(guī)律不同。原因可能有兩方面:① 上述文獻(xiàn)中所用煤樣與本文不同，不同煤樣具有不同的理化性質(zhì)，可被微生物利用降解的程度也不相同;② 雖然同為產(chǎn)甲烷菌群，但菌群結(jié)構(gòu)差異較大，文獻(xiàn)所用菌源為馴化沼液，而本文為煤層水微生物富集培養(yǎng)得到。

2.2 褐煤生物產(chǎn)氣前后微生物群落結(jié)構(gòu)分析

表1為實驗所用微生物在培養(yǎng)前后的Alpha多樣性統(tǒng)計結(jié)果。其中寺河煤層水富集微生物樣本中共觀察到964個OTU，而經(jīng)過產(chǎn)氣培養(yǎng)后的對照組和試驗組分別下降為368和436個OTU，結(jié)合Shannon值等多樣性指數(shù)可以看出群落多樣性由高到低分別為:原始>試驗組>對照組，原始微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性較高，經(jīng)生物產(chǎn)氣后，對照組與試驗組群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化。其中對照組只添加了少量培養(yǎng)基，營養(yǎng)單一，試驗組添加了褐煤煤粉，雖然底物較對照組豐富，但兩者微生物多樣性均有降低，推測可能是由于寺河礦區(qū)為無煙煤，富集時采用煤也為無煙煤，所以得到菌群對無煙煤有更好的適應(yīng)性，而采用褐煤做底物或者是基本培養(yǎng)基培養(yǎng)時，微生物菌群適應(yīng)性降低，所以菌群多樣性下降。

表1 樣品間Alpha多樣性統(tǒng)計Table 1 Alpha diversity of bacterial communities at different fermentation stages

圖2和3分別為原始和試驗及對照組產(chǎn)氣后菌群在門和屬水平的群落組成分析。由圖2可知褐煤生物產(chǎn)氣所用原始微生物中主要優(yōu)勢菌門包括厚壁菌門(Firmicutes，27%)、WWE1(25%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，21%)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes，13%)以及豐度較低的變形菌門(Proteobacteria，5%)和綠彎菌門(Chloroflexi，1%)。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后微生物門類結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，其中試驗組微生物中主要優(yōu)勢菌門主要為厚壁菌門(Firmicutes，40%)、變形菌門(Proteobacteria，19%)、WWE1(13%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，8%)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes，6%)和少量的脫鐵桿菌門(Deferribacteres，2%);而對照組中微生物優(yōu)勢門類則減少為3類，依次為厚壁菌門(Firmicutes，73%)、變形菌門(Proteobacteria，22%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，3%)。從屬水平上群落豐度分析可以發(fā)現(xiàn)，在原始微生物中W22(38%)是該富集樣本中豐度最高的微生物，其次為Proteiniclasticum(21%)和VadinCA02(18%)。經(jīng)褐煤生物產(chǎn)氣培養(yǎng)后的試驗組中W22(22%)依然保持優(yōu)勢地位，脫硫弧菌屬Desulfovibrio(22%)也占有相同比重，其次為Tissierella_Soehngenia(11%)和VadinCA02(10%)(b)?？梢?，褐煤富集會對原始菌群的組成產(chǎn)生影響，原始菌群中的Proteiniclasticum相對豐度急劇減少，而脫硫弧菌屬Desulfovibrio和Tissierella_Soehngenia在原始菌群中可能豐度較低均沒有檢測到，但是產(chǎn)氣后其豐度明顯上升。對照組中豐度最高的微生物則為厚壁菌門中的Tissierella_Soehngenia(58%)，其次為Clostridium(16%)(c)。

圖2 原始微生物、試驗組、對照組在門水平多樣性分析Fig.2 Biodiversity analysis of original microorganism, experimental group and control group at phyla level

厚壁菌門在3組樣品中占比最大，其中的微生物主要參與一些混合酸、醇和中性物質(zhì)的生成。其中的Proteiniclasticum和梭菌屬(Clostridium)均屬于梭菌科參與一些纖維質(zhì)、幾丁質(zhì)等水解過程[17]。Tissierella菌屬可以利用有機(jī)物代謝產(chǎn)生乙酸、丁酸、氨氮、CO2等物質(zhì)[18]?；ヰB(yǎng)單胞菌(Syntrophomonas)、醋桿菌屬(Anaerovorax)等在降解多糖、脂肪酸等有機(jī)物、產(chǎn)氫產(chǎn)酸等過程中扮演重要角色[19-21]。未培養(yǎng)WWE1菌門在產(chǎn)甲烷混合菌群中常被檢測到，在降解烴類和纖維素等物質(zhì)過程中發(fā)揮重要作用[22-23]，可能具有將丙酸氧化為乙酸和 CO2的能力[24]。WWE1菌門中的W22其具體功能還未見文獻(xiàn)報道，有待進(jìn)一步研究。擬桿菌門是一類化能自養(yǎng)型微生物，樣品中屬于該門的微生物主要有產(chǎn)電菌(Dysgonomonas)和產(chǎn)酸菌(Paludibacter)，它們可能參與苯酚等有機(jī)物的降解產(chǎn)酸等過程，在微生物燃料電池等反應(yīng)器中也有發(fā)現(xiàn)報道[25-26]。變形菌門物種豐富，具有極為廣泛的代謝類型，其中脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)為硫酸鹽還原菌，可將硫酸鹽還原為H2S，為微生物提供能量，減輕對甲烷菌的競爭性抑制和毒害作用[27]。檢測到的檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)具有降解長鏈烷烴、還原硫酸鹽等功能[28-29]，互營菌屬(Syntrophus)常在降解石油烴等富集物中被檢測到，具有降解烷烴、長鏈脂肪酸等功能[30-31]。地桿菌(Geobacter)是隸屬變形桿菌δ亞綱的Fe(Ⅲ)還原細(xì)菌，廣泛分布于厭氧沉積環(huán)境中，具有代謝乙酸鹽的特征[32]。樣品中屬于互養(yǎng)菌門中的微生物分別有胺小桿菌屬(Aminobacterium)、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌屬(Sedimentibacter)，它們是厭氧系統(tǒng)中重要的氨基酸降解和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸的功能細(xì)菌，該類微生物在連接水解發(fā)酵過程與產(chǎn)甲烷過程中起重要作用[33-34]。脫鐵桿菌門是一類通過專性或兼性厭氧代謝獲得能量的細(xì)菌，可利用多種電子受體，在試驗組中檢測到較低豐度的菌群[35]。VadinCA02和VadinHB04在原始和試驗組樣品中豐度較高，有研究表明在廢水處理器中常被檢測到，在有機(jī)物降解過程中發(fā)揮重要作用[36-37]。

圖3 原始微生物、試驗組、對照組在屬水平多樣性分析Fig.3 Biodiversity analysis of original microorganism, experimental group and control group at genus level

原始微生物中古菌主要為廣古菌門(Euryarchaeota)中的甲烷囊菌屬Methanoculleus(1%)，而培養(yǎng)后的試驗組中古菌主要為瘤胃古菌中的VadinCA11(1%)。Methanoculleus屬于甲烷微菌球綱，該綱是目前產(chǎn)甲烷古菌研究報道最多的微生物，可以利用 H2/CO2、甲酸鹽等小分子產(chǎn)生甲烷[38-39]。

2.3 褐煤生物產(chǎn)氣前后煤理化特性和表面微生物形貌分析

勝利褐煤基本理化性質(zhì)分析見表2，煤樣揮發(fā)分較高為33.96%，具有富氫、富氧等基本特征。對比試驗前后煤樣理化特性可知，經(jīng)微生物降解作用后，水分、灰分揮發(fā)份均降低，固定碳百分比升高，在脫硫菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌等的作用下，煤樣H/C升高，S,O元素比例下降，說明煤中易被微生物利用的短鏈和側(cè)鏈被降解，剩下復(fù)雜的高分子結(jié)構(gòu)難以降解。

表2 褐煤工業(yè)分析和元素分析結(jié)果Table 2 Lignite industry analysis and elemental analysis results

原煤樣品的掃描電鏡結(jié)果(圖4(a))表明煤表面結(jié)構(gòu)松散，有明顯的裂隙，有的裂隙大于10 μm有利于微生物附著降解，適宜進(jìn)行生物產(chǎn)氣模擬試驗。生物產(chǎn)氣試驗后，觀察煤樣表面(圖4(b))出現(xiàn)大量不同細(xì)胞形態(tài)的微生物結(jié)構(gòu)，其中最豐富的是形態(tài)為1.0～1.5 μm短桿狀和球狀細(xì)胞，部分稍彎曲，主要位于煤表面較平整的區(qū)域。因厚壁菌可以產(chǎn)生芽孢，可以抵抗脫水和極端環(huán)境，結(jié)合測序結(jié)果分析可能是厚壁菌門的Tissierella_Soehngenia,Clostridium和Desulfovibrio等。同時還有一些形態(tài)較為特別的類型，比如直徑約0.2 μm，長度為15 μm甚至更長更細(xì)的桿狀結(jié)構(gòu)，形態(tài)為3～5 μm的鏈球狀結(jié)構(gòu)等等，這些絲狀結(jié)構(gòu)的微生物有可能與微生物之間形成的納米導(dǎo)線相關(guān)，其具體形成及其作用還有待進(jìn)一步研究[40]。

圖4 褐煤原煤樣品和生物產(chǎn)氣后樣SEM照片F(xiàn)ig.4 SEM images of lignite and after biogas production

3 結(jié) 論

(1)寺河礦區(qū)的煤層水富集微生物可以利用勝利褐煤進(jìn)行產(chǎn)氣，其產(chǎn)氣周期為49 d，期間累計產(chǎn)甲烷量為83.1 mL，凈產(chǎn)甲烷率為7.84 mL/g煤。

(2)測序結(jié)果表明，褐煤產(chǎn)氣微生物門類主要集中在厚壁菌門、WWE1、互養(yǎng)菌門、變形菌門、擬桿菌門和廣古菌門。原始微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性較高，經(jīng)褐煤和基本培養(yǎng)基產(chǎn)氣后，群落多樣性降低。其中W22,Proteiniclasticum,VadinCA02,Tissierella_Soehngenia,Clostridium,Desulfovibrio等菌屬在褐煤產(chǎn)氣過程中發(fā)揮重要功能。

(3)褐煤在生物產(chǎn)氣作用后，水分、灰分、揮發(fā)分均降低，固定碳百分比升高，H/C升高，S元素比例下降，利用掃描電鏡觀察表面附著大量短桿狀和球狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并存在類似微生物納米導(dǎo)線結(jié)構(gòu)。