支鏈氨基酸作為糖尿病的生物標志物

郝文來　宋毅

摘要：目的：探究支鏈氨基酸作為糖尿病的生物標志物，分析血漿氨基酸水平在糖尿病患者中的變化及聯(lián)系。方法：選取某院2017年3月-2018年12月收納的2型糖尿病患者54例作為研究對象，按照糖化血紅蛋白將其分為異常組25例（HbAlc>6.5%），29例正常組（HbAlc<=6.5%），選取于我院的同期體檢的25例正常人組。對三組受檢人群進行血漿檢測，觀察體內氨基酸水平改變。結果：異常組和正常組在成酮氨基酸（賴氨酸和亮氨酸）以及支鏈氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸）水平均較健康人組顯著更高（P<0.05），同時正常組水平升高幅度低于異常組（P<0.05）;異常組和正常組在成糖氨基酸（絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸以及蘇氨酸）水平和健康人組顯著減少（P<0.05），而異常組減少水平比異常組更顯著（P<0.05）。結論：針對2型糖尿病患者的疾病和代謝狀態(tài)通過檢驗支鏈氨基酸等血漿氨氨基酸水平可反映出二者之間存在一定聯(lián)系，有利于糖尿病患者早期的診斷。

關鍵詞：支鏈氨基酸;糖尿病;生物標志物

近些年來，人們經濟條件、生活水平以及飲食結構等不斷發(fā)生變化，糖尿病在國內乃至世界范圍內的患病人數處于逐年上升的趨勢，而糖尿病的相關臨床研究也成為熱點之一，受到了較大的社會關注。糖尿病國際聯(lián)盟數據表明，世界范圍內糖尿病患病人數2013年統(tǒng)計為3.81億，保守預計糖尿病患者在2035年將超過5.5億。因我國人口眾多等因素，糖尿病患者人數長期處于世界首位。同時，隨著科研者對于血漿水平內蛋白質和氨基酸的認知不斷提高，研究發(fā)現，支鏈氨基酸（BCAAs）水平和2型糖尿病存在一定聯(lián)系。作為人體必需的氨基酸之一，支鏈氨基酸被制成營養(yǎng)劑在臨床中廣泛應用。支鏈氨基酸的研究較早，于上世紀五六十年代，國外研究發(fā)現血清中支鏈氨基酸出現水平上升^[1]。而隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，核磁共振、分析化學技術以及質譜法的聯(lián)合應用，對于有機代謝檢測起到極大的促進作用，這對于糖尿病早期診斷創(chuàng)造了有利條件。同時近些年來有學者發(fā)現，胰島素敏感人群和抵抗人群中的外周血液的諸多代謝物質中，和胰島素敏感性脂質分子并不是相關性最強的物質，而是芳香族氨基酸以及支鏈氨基酸及產物分子。另外還有研究表明，糖耐量不同的患者中經過橫斷面探究得出，糖尿病和支鏈氨基酸聯(lián)系密切。因此，本文為探究支鏈氨基酸作為糖尿病的生物標志物，分析血漿氨基酸水平在糖尿病患者中的變化及聯(lián)系，選取我院2017年3月-2018年12月收納的2型糖尿病患者54例作為研究對象，結果報告如下。

1 一般資料與方法

1.1一般資料

選取某院2017年3月-2018年12月收納的2型糖尿病患者54例作為研究對象，按照糖化血紅蛋白將其分為異常組25例（HbAlc>6.5%），29例正常組（HbAlc<=6.5%），選取于我院的同期體檢的25例健康人組。其中，異常組患者男15例，女10例，年齡為44-73歲，平均年齡為（52.48±6.33）歲。正常組患者男14例，女15例，年齡為42-75歲，平均年齡為（53.50±6.21）歲。健康人組男10例，女15例，年齡為41-76歲，平均年齡為（55.51±6.05）歲。三組患者基線資料無明顯差異，不具備統(tǒng)計學意義（P>0.05），有可比性。納入標準：（1）患者年齡低于80歲;具有一定自理能力，無需他人協(xié)助;身體基本健康;診斷標準符合《中國糖尿病2型防治指南》2007版;所有受檢者均知情本次實驗研究且經過我院倫理委員會同意。排除標準：（1）腎臟疾病于早期診斷，如自身免疫性疾病、腎炎以及藥物導致的腎臟疾病;具有冠狀動脈心臟疾病，如心絞痛史以及心肌梗死等;（2）腎功能衰竭;（3）伴有嚴重的肝臟疾病，如肝硬化、脂肪肝等;（4）嚴重的基礎性疾病，外周動脈硬化;（5）精神病史或意識不清者;（6）急性感染、、自身免疫力疾病、惡性腫瘤;（7）先天性心臟病及其它心腦血管疾病者;（8）哺乳期婦女、孕期女性。

1.2糖尿病診斷依據

口服葡萄糖耐量試驗的2h血漿葡萄糖超過或等于200mg/dl或FPG超過或等于126mg/dl;前期糖尿?。篎PG處于100mg/dl及125mg/dl之間;或OGTT血漿2h葡萄糖處于75-199mg/dl之間。

1.3方法

本次實驗儀器選用有：美國公司AB Sciex的串聯(lián)質譜儀（API 4000）;日本島津公司出品的液相系統(tǒng)：兩臺輸液泵（LC-20AD）、1臺子宮進樣器（SIL-HTc）、1臺在線脫氣儀（DGU-20A3）、1臺控制器（CBM-20A）。美國AB Sciex出品的mino Acid4.6*150mmC18分析柱;Analyl1.5.1數據處理和采集軟件。

空腹血糖監(jiān)測時，于第二日早8點取靜脈血液3-5ml，注意保持空腹。進行抽血樣品采集和預處理：將血清等置于冰箱（78℃）冷凍保存。（1）蛋白稀釋和沉淀，沉淀通過磺基水楊酸10ul以及樣本40ul混合;標記緩沖液40ul加上清液10ul;取上清液稀釋的約10ul將其換至離心管中，注意離心管無菌消毒。（2）標記iTRAQ，取iTRAQ115待其溫度至室溫，稀釋加70ul異丙醇;然后加入稀釋的iTRAQ115 5ul于預處理樣品中，反應時間需保持30分鐘;標記反應終止時可加羥胺NH₂OH;使用氮氣風干。（3）樣品重組以及iTRAQ114試劑配制，iTRAQ114在混旋之后底部沉入;加入標準稀釋液1.8ml于iTRAQ114標準液中，混合混勻約一分鐘，直至沉淀消失;iTRAQ115標記樣本吹干后混加iTRAQ114稀釋且重組的32ul標準液。

1.3.1液相條件

水相：七氟丁酸水0.01%，甲酸0.1%。有機相：七氟丁酸乙腈0.01%，甲酸0.1%。氨基酸分析時，2ul進樣量、50℃柱溫、0.8ml/min流速。

1.2.3質譜條件 ?掃描方式：MRM;電噴霧離子源;極性為正離子;掃描間隔時間10ms;電壓設置為5500V;溫度設置為500℃;儀器參數有：EP（10V）、DP（20V）、CXP（5V）、CE（30V）。

1.3.2檢測

氨基酸：體內氨基酸需同時監(jiān)測通過液質聯(lián)用方式進行（AB Amino Acid45/32TM Kit）。沉淀蛋白樣品后，氨基酸衍生化通過iTRAQ115衍生化試劑進行。氨基酸濃度標記為114標準品對未知濃度樣品標記^[2]。氨基酸測定種類又：蘇氨酸、丙氨酸、甘氨酸以及絲氨酸等成糖氨基酸;異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸等支鏈氨基酸;賴氨酸、亮氨酸等成酮氨基酸。

1.4統(tǒng)計學分析

將研究所得的最后數據使用spss22.0統(tǒng)計學軟件進行數據處理。在數據處理過程中，t值檢驗計量資料，卡方檢驗計數資料，組間差異經P值判定，以P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

異常組和正常組在成酮氨基酸（賴氨酸和亮氨酸）以及支鏈氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸）水平均較健康人組顯著更高（P<0.05），同時正常組水平升高幅度低于異常組（P<0.05）;異常組和正常組在成糖氨基酸（絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸以及蘇氨酸）水平和健康人組顯著減少（P<0.05），而異常組減少水平比異常組更顯著（P<0.05）。

3 討論

糖尿病患者在全球范圍內患病人數極多，目前以接近4億。而2型糖尿病患者現在任然不清楚其發(fā)病機制，但臨床學者也達成普遍共識，即高血脂、高血糖以及細胞因子屬于β細胞和IR細胞分泌缺陷的主要機制^[3]。作為人體必需的氨基酸之一，支鏈氨基酸被制成營養(yǎng)劑在臨床中廣泛應用。支鏈氨基酸的研究較早，于上世紀五六十年代，國外研究發(fā)現血清中支鏈氨基酸出現水平上升。相關研究表明，通過液質聯(lián)用技術等代謝組學方案對相關糖尿病患者對照研究得出，芳香族氨基酸以及支鏈氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸）等當其水平提高時，糖尿病發(fā)病風險就大大增加。而經過氨基三羧酸循環(huán)后，可將葡萄糖、氨基酸以及脂質代謝緊密結合。等可氨基酸代謝生酮氨基酸和糖，其具有與糖脂代謝轉化的能力。而氨基酸代謝異?？捎商谴x紊亂造成，相反，糖代謝異常也可由氨基酸代謝異常造成。而近些年來醫(yī)療技術以及生物科學的不斷發(fā)展和進步，越來越多的臨床研究者發(fā)現，糖類代謝結果和氨基酸代謝等相關間的影響緊密，得到了人們廣泛關注。李偉，童星^[4]等人通過對糖尿病模型小鼠的血漿氨基酸組分采取HPLC法進行分析乳清蛋白后發(fā)現，乳清蛋白中異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸等在氨基酸總量中占比分別為5.92%、14.39%、5.31%，即總含量上支鏈氨基酸占比超過25%。但在造模鼠和正常鼠中，灌胃了乳清蛋白的支鏈氨基酸血漿含量顯著增加，同時支鏈氨基酸濃度隨著灌胃濃度升高而升高，且支鏈氨基酸濃度正常鼠含量遠低于造模鼠，該結果提示出，血漿中氨基酸水平可能會對葡萄糖的吸收和轉運造成阻礙，使得肌糖原合成減少，從而誘發(fā)胰島素抵抗。而常盼，張曉萌^[5]等為驗證糖尿病心肌患者中血漿支鏈氨基酸水平表達通過檢測后發(fā)現，兩組患者中，糖尿病心肌患者的支鏈氨基酸（0.998±0.076）mM與對照組（0.135±0.068）mM相比其血漿含量發(fā)生明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;而對糖尿病心肌患者通過Tei指數和血漿支鏈氨基酸的相關性比較統(tǒng)計后發(fā)現兩者間呈現正相關（r=0.820，P<0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。還有學者通過對2型糖尿病進行測定血漿氨基酸發(fā)現，糖尿病患者的血漿氨基酸變化具有獨特性，主要為成酮氨基酸、支鏈氨基酸等水平增加，而成糖氨基酸濃度則呈現降低趨勢，同時正常人群受試者丙氨酸水平則不明顯差異，這與本文中研究結果保持一致，因胰島細胞內科通過谷氨酸進行信息傳遞，對胰島素分泌具有影響作用，臨床大量研究也證實胰島素分泌可由氨基酸所影響決定，這也為糖代謝受氨基酸影響相關理論奠定基礎^[6]。而本文中，通過將糖尿病患者按照糖化血紅蛋白水平分為異常組和正常組，經過實驗室驗證得出，異常組和正常組在成酮氨基酸（賴氨酸和亮氨酸）以及支鏈氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸）水平均較健康人組顯著更高（P<0.05），同時正常組水平升高幅度低于異常組（P<0.05）;異常組和正常組在成糖氨基酸（絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸以及蘇氨酸）水平和健康人組顯著減少（P<0.05），而異常組減少水平比異常組更顯著（P<0.05），結果符合相關文獻報告。本文結果提示出該機理和以下因素可能存在關聯(lián)：在發(fā)生糖代謝障礙后，糖尿病患者因胰島素缺乏而通常發(fā)生蛋白質代謝異常，而作為代謝性疾病的一種，糖尿病因胰島素相對不足或不足進而造成阻礙脂肪酸、葡萄糖氧化，增加蛋白分解等，這也在一定程度上解釋了為何運動員多采取補充相關氨基酸作為能源支持^[7]。此外，如肝外的支鏈氨基酸降解也會因支鏈酮酸脫氫酶的活力降低而有所影響。機體內肌肉組織在對支鏈氨基酸進行攝入時因胰島素不足而受到抑制，進而造成肌肉分解代謝亢進效果，成酮氨基酸和支鏈氨基酸因氨基酸產生過多而出現上升。值得注意的是，因肝臟中幾乎所有氨基酸分解代謝均在其中進行，當患者肝臟器官功能發(fā)生減弱異常時，則血漿中其它必須氨基酸增上升。因此，王思陽、徐蓉^[8]等認為，對于血漿支鏈氨基酸含量過多患者，可通過葡萄糖快速靜滴或者胰島素靜脈注入從而對內生胰島素分泌進行刺激，以降低血漿支鏈氨基酸含量;還可口服降糖藥以及胰島素注射后，糖尿病患者的氨基酸代謝異常以及代謝失調等可得以糾正。

總而言之，針對2型糖尿病患者的疾病和代謝狀態(tài)通過檢驗支鏈氨基酸等血漿氨氨基酸水平可反映出二者之間存在一定聯(lián)系，而代謝組學對于疾病研究起到促進作用，有利于糖尿病患者早期的診斷。

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