表皮生長因子受體在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系*

周修明， 徐靜， 陳旭娜， 何桂錄， 馬宇強， 趙華福， 李維平， 劉文蘭， 陳保東△

1安徽醫(yī)科大學(xué)深圳二院臨床學(xué)院(廣東深圳 518035); 2深圳市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科(廣東深圳 518035)； 3廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗科(廣東深圳 518034)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是預(yù)后較差的腦腫瘤之一，具有增殖性強，侵襲性高，及對常規(guī)治療耐受的特點[1]?，F(xiàn)如今對于GBM，臨床主要通過手術(shù)切除肉眼可見范圍腫瘤組織，并選擇性切除少許臨近肉眼正常組織，術(shù)后輔以放化療，靶向治療等方式對患者進行治療[2]。然而擺在外科醫(yī)生面前的一大難題就是GBM患者預(yù)后較差，標(biāo)準(zhǔn)治療方案治療后中位生存期仍只有14.6個月左右[3]?，F(xiàn)在有很多與GBM相關(guān)的分子靶向藥物被科研人員一一開發(fā)，然而目前對GBM更深層次的研究仍然不夠充分。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是表皮生長因子細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體[4]。研究表明許多實體瘤存在EGFR的異常表達(dá)[5]。EGFR與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)[6]。而眾多相關(guān)的數(shù)據(jù)都可以在癌癥基因組圖譜中查到[7]。本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中EGFR的表達(dá)與GBM患者預(yù)后的關(guān)系，以及對本院42例GBM樣本、2例Ⅰ級膠質(zhì)瘤和4例對照樣本的分析來研究EGFR對GBM患者預(yù)后的評估價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究共納入我院2016年1月至2017年1月42例GBM樣本、2例Ⅰ級膠質(zhì)瘤和4例對照組樣本，并從我院病例系統(tǒng)中收集患者年齡、性別、臨床癥狀、切除部位及病理類型的數(shù)據(jù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：GBM樣本選取首次確診為GBM且經(jīng)病理證實的患者，Ⅰ級膠質(zhì)瘤患者選取首次確診為Ⅰ級膠質(zhì)瘤且經(jīng)病理證實的患者。對照組為我院外傷及癲癇患者的病變樣本。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除兒童患者。腫瘤的病理分型等數(shù)據(jù)同時由兩名神經(jīng)外科醫(yī)生獨立判斷。本研究及收集的患者病理標(biāo)本由我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 本研究使用Trizol法提取總RNA。先將組織在液氮中能研磨成粉末，再以50～100 mg組織加入1 mL Trizol液研磨。研磨液室溫放置5 min，以每毫升Trizol液加入0.2 mL的比例加入氯仿，蓋緊離心管后振蕩15 s。取上層水相于新離心管，按照每毫升Trizol液加0.5 mL異丙醇比例加入異丙醇，室溫放置10 min后12 000×g離心10 min。棄去上清液并按照每毫升Trizol液加入至少1 mL的比例加入75%乙醇，混勻后4℃下離心5 min。棄去上清液后室溫干燥10 min，再將其溶于水中即為總RNA。

1.2.2 cDNA合成 使用RNA逆轉(zhuǎn)錄酶與相應(yīng)引物，通過oligo(dT)短片段合成cDNA的第一條鏈。再以mRNA雜交體作為切口平移的模板，RNA酶H在雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成cDNA的第二條鏈。將cDNA保存在-80℃冰箱中保存。

1.2.3 實時聚合酶鏈反應(yīng) 本實驗使用華大基因公司的EGFR引物，正向序列5′-TCCTCGATGAAGCCTACGTGATGG-3′，反向序列5′-AAGCGACGGTCCTCCAAGTAGTT-3′。使用Roche公司的FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑。首先將試劑溶解保存于冰上，在16 μL的單個PCR反應(yīng)體系中依次加入8 μL FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)，0.5 μL正向引物，0.5 μL反向引物，6.6 μL PCR等級的水，混勻。將15.6 μL混合液吸取至PCR微孔板中。加入0.4 μL的DNA模板，小心混勻。將微孔板置于real-time PCR 7500儀器中，95℃變性15 s，60℃退火并延長1 min，完成40個循環(huán)，同時檢測引物效率。

以EGFR為目的基因，GAPDH為內(nèi)參基因。計算基因差異表達(dá)的倍數(shù)，計算公式為2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。將PCR結(jié)果中2-ΔΔCt值>2設(shè)置為EGFR高表達(dá)組，2-ΔΔCt值≤2設(shè)置為非EGFR高表達(dá)組。

1.2.4 TCGA數(shù)據(jù)庫樣本篩選 TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選2017年當(dāng)年錄入患者，年齡>25歲，且為初發(fā)GBM，對錄入的患者進行EGFR關(guān)聯(lián)蛋白網(wǎng)絡(luò)、拷貝數(shù)、無進展生存期和總生存率的分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 20.0和GraphPad Prism 6.0軟件分析實驗結(jié)果。通過非配對t檢驗評估表達(dá)差異性，Pearson2檢驗和連續(xù)性校正的2檢驗比對臨床數(shù)據(jù)特征，log-rank檢驗評價生存曲線。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GBM患者臨床病理特征與EGFR表達(dá)的相關(guān)性分析 按照年齡、性別、是否存活及是否復(fù)發(fā)分組，EGFR高表達(dá)組與低表達(dá)組現(xiàn)存活患者生存期均值分別為26.1和27.1個月，死亡患者生存期均值分別為18.7和13.0個月。分析后發(fā)現(xiàn)EGFR高表達(dá)組和非高表達(dá)組與年齡、性別、存活和復(fù)發(fā)均無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 GBM患者臨床病理特征與EGFR表達(dá)的相關(guān)性例

2.2 44例GBM患者EGFR的PCR結(jié)果及分析 4例對照組的2-ΔΔCt值均<6，GBM樣本的2-ΔΔCt值分布在0～500范圍內(nèi)。GBM組2-ΔΔCt值均值明顯高于對照組(圖1)。根據(jù)先前收集的患者資料及隨訪結(jié)果，對患者的生存時間進行統(tǒng)計(圖2)，但可能由于手術(shù)效果及樣本量原因，本院患者生存時間明顯高于數(shù)據(jù)庫中的14個月平均生存期，而從兩組生存時間差異角度比較，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 GBM患者EGFR的表達(dá)

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫中EGFR表達(dá)情況及其關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò) 本研究篩選TCGA數(shù)據(jù)庫中520個樣本的EGFR mRNA表達(dá)情況進行分析。二倍體幾乎無突變，相比之下高表達(dá)的樣本中有大量錯義突變(圖3)。EGFR與BIK3CA、PTEN、LAT2、P3GFA、FGF6、STAT6、EPHB3、AP2M1、SH3GL2、ACTA2、FGF23、CPSF6、LAT2等蛋白有緊密聯(lián)系(圖4)。

圖2 44例GBM患者的生存曲線

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫中EGFR拷貝數(shù)變化

2.4 TCGA數(shù)據(jù)庫中EGFR表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫資料分析得出，GBM平均存活時間只有14個月，無論是EGFR高表達(dá)還是非高表達(dá)，30個月后其生存率已非常低，在納入分析的TCGA數(shù)據(jù)庫的520個病例中，402例患者已死亡。而通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中兩組總生存率對比，EGFR高表達(dá)組明顯低于非EGFR高表達(dá)組(log-rank檢驗P=0.003 64)。然而，對于無進展生存時間差異的分析發(fā)現(xiàn)，兩組之間無進展生存時間之間差異無統(tǒng)計學(xué)差異(log-rank檢驗P=0.163)(圖5)。

圖4 TCGA數(shù)據(jù)庫中EGFR關(guān)聯(lián)蛋白網(wǎng)絡(luò)

A：總生存曲線；B：無進展生存曲線

2.5 本組病例與TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)對比 通過對我院44例GBM的分析，進一步證實了520例TCGA數(shù)據(jù)庫中EGFR在GBM中高表達(dá)的結(jié)果。但在生存期方面，由于樣本量有限，暫時沒有未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)，而TCGA數(shù)據(jù)庫中兩組總生存率對比，EGFR高表達(dá)組明顯低于非EGFR高表達(dá)組(log-rank檢驗P=0.003 64)，無進展生存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(log-rank檢驗P=0.163)。

表2 TCGA數(shù)據(jù)庫中EGFR高表達(dá)組與非高表達(dá)組中位生存期

3 討論

目前臨床對于GBM患者采用以手術(shù)切除為主，放化療為輔的綜合治療方法[8]。然而，雖然GBM患者的中位生存期得到延長，但近年來仍未發(fā)現(xiàn)更好的治療方法[9]?，F(xiàn)如今，分子靶向治療和免疫治療在臨床越來越受到重視，但臨床實際開展的項目較少[10]。我院針對少量GBM患者開展CAR-T治療，其療效正進一步觀察中。

EGFR在許多實體瘤異常表達(dá)，其與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)[11-12]。本研究旨在探索EGFR作為膠質(zhì)瘤的致病因素，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。在TCGA數(shù)據(jù)庫中我們研究了520例膠質(zhì)瘤患者，對他們已錄入TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行分析，并在本院40余例臨床標(biāo)本中進一步證實。除了GBM患者的樣本分析，本實驗室在其他級別膠質(zhì)瘤中也對EGFR進行初步分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)可能與膠質(zhì)瘤級別相關(guān)。目前，GBM根據(jù)基因表達(dá)譜可以分為4型：前神經(jīng)元型(26%)、神經(jīng)元型(17%)、經(jīng)典型(27%)及間質(zhì)型(29%)[13-14]。不同分型預(yù)后不同，而在不同分型中EGFR的表達(dá)水平也不盡相同，這提示GBM中EGFR的表達(dá)可能與不同分子分型及預(yù)后相關(guān)[15]。TCGA數(shù)據(jù)庫中對于不同EGFR擴增水平的患者標(biāo)本進行分析，發(fā)現(xiàn)EGFR高表達(dá)組，其患者預(yù)后要明顯差于非EGFR高表達(dá)組，這提示EGFR表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)。而針對這一改變，可能是EGFR的擴增使其蛋白表達(dá)水平升高，進而影響下游相關(guān)信號通路，從而對GBM的生長、侵襲、遷移和凋亡等細(xì)胞過程產(chǎn)生決定性影響。從本研究的分析來看，EGFR與BIK3CA、PTEN、LAT2、P3GFA、FGF6、STAT6、EPHB3等密切相關(guān)，因此與之相關(guān)的蛋白可能是EGFR上下游的信號通路上的蛋白[16]，后續(xù)進一步的研究可以從這一系列蛋白著手，例如EGFR的擴增通常伴隨著PTEN的擴增，那么二者之間是否有相應(yīng)信號通路相互作用，影響GBM的生長、凋亡與耐藥等。

我院近年來收治了非常多的膠質(zhì)瘤患者，通過不斷對患者術(shù)后情況進行隨訪以及對患者術(shù)后標(biāo)本的分析研究，以期能進一步探尋GBM的分子機制和關(guān)鍵靶點。GBM是膠質(zhì)瘤中惡性度最高，預(yù)后最差，平均生存期最短的腫瘤。本研究對44例GBM的分析，與TCGA數(shù)據(jù)庫中EGFR在GBM中高表達(dá)的結(jié)果基本一致，但在生存期方面，由于樣本量有限，暫時沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)上的差異。

總而言之，EGFR在GBM中異常表達(dá)，且作為獨立因素對患者預(yù)后有明顯影響。因此EGFR可能在GBM中起到至關(guān)重要的作用，而以EGFR蛋白及其相互關(guān)聯(lián)蛋白為突破口，可以進一步對GBM的發(fā)生發(fā)展有更進一步的了解，并通過對其分子機制的進一步研究來改變其遷移、侵襲及耐藥等特性，以期望能找到更好的治療方法并有效改善膠質(zhì)瘤患者預(yù)后。