基于高倍物鏡的相位顯微成像方法?

楊 穎 張 巖

(首都師范大學(xué)物理系,北京 100048)

0 引 言

顯微成像技術(shù)在光學(xué)測量領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用.傳統(tǒng)的成像器件只對強(qiáng)度敏感,采集的圖像中只包含振幅信息,忽略了相位信息.對于相位型樣品,相位信息通常包含更多的細(xì)節(jié)特征.通過相位信息的測量,可以觀測到傳統(tǒng)方式無法檢測到的信息.在一些特定的應(yīng)用領(lǐng)域,如顯微成像[1-2]、圖像加密解密[3-4]、精密元件檢測[5]、生物醫(yī)學(xué)研究[6]等具有重要的意義.

目前在顯微成像領(lǐng)域大多采用干涉方法.干涉方法主要通過記錄、解析物光與參考光的干涉信息,得到樣品的相位信息.激光技術(shù)及電耦合元件CCD(charge coupled device)的相繼發(fā)明,促進(jìn)了數(shù)字全息等基于干涉方法的相位成像技術(shù)發(fā)展,很快應(yīng)用于相位顯微成像領(lǐng)域[7].隨著技術(shù)及硬件的不斷發(fā)展,新興的干涉技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞級別的相位顯微成像.2007年Choi 等[8]利用層析相位顯微術(shù)技術(shù)定量測定活體組織中三維折射率的分布情況,并展示了細(xì)胞結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的演變情況.2017年,Chowdhury 等[9]提出了一種基于結(jié)構(gòu)照明的顯微成像方法,通過標(biāo)準(zhǔn)衍射層析計(jì)算,重建乳腺細(xì)胞三維折射率分布.這些基于干涉技術(shù)的相位成像方法,相位測量結(jié)果精度很高,然而對參考光有較強(qiáng)依賴,測量光路復(fù)雜光學(xué)器件成本高昂.迄今為止,如何實(shí)現(xiàn)既簡單又高效的相位顯微成像仍然是一個(gè)挑戰(zhàn).

相位恢復(fù)方法作為一種非干涉相位測量技術(shù),克服了干涉法的弊端,無需參考光束,光路簡單.相位恢復(fù)方法直接測量強(qiáng)度分布,經(jīng)反復(fù)迭代計(jì)算得出相位信息.Gerchberg-Saxton(GS)算法開創(chuàng)了雙強(qiáng)度面迭代相位恢復(fù)方法的先河[10].楊顧算法是繼GS 算法后又一經(jīng)典迭代類相位恢復(fù)算法,擴(kuò)大了GS 算法的適用范圍[11].這兩種迭代類型的經(jīng)典相位恢復(fù)算法,計(jì)算過程依賴于初始采集的兩個(gè)或單個(gè)強(qiáng)度面數(shù)據(jù)進(jìn)行反復(fù)迭代.如果這兩個(gè)強(qiáng)度面給予的已知信息不夠充分,容易導(dǎo)致計(jì)算陷入局部極小停滯.并且這兩個(gè)面的測量數(shù)據(jù)伴隨整個(gè)迭代過程,如果初始采集存在實(shí)驗(yàn)誤差,會(huì)制約重建結(jié)果的精度.因此繼GS 算法和楊顧算法之后,一些研究提出了多強(qiáng)度面重構(gòu)完整波場的方法[12].這種方法增加了測量面的個(gè)數(shù).每增加一個(gè)測量面的數(shù)據(jù)都增加了計(jì)算時(shí)的已知信息,可以迅速高精度地逼近重建目標(biāo),從而可以不經(jīng)迭代[13]或僅迭代有限的次數(shù)[14],即可得到良好的重建結(jié)果.相位恢復(fù)方法廣泛用于相位測量、圖像處理和圖像加密.然而,相位恢復(fù)方法在顯微成像領(lǐng)域應(yīng)用尚且不多.

本文將相位恢復(fù)方法與顯微成像相結(jié)合,通過光場強(qiáng)度測量,由相位恢復(fù)算法重構(gòu)物體相位信息.顯微系統(tǒng)采用高倍大數(shù)值孔徑物鏡,提出了一種同步移動(dòng)CCD 和顯微物鏡的拍攝方式,改變了傳統(tǒng)相位恢復(fù)方法單純移動(dòng)CCD 位置的拍攝方法.解決了高數(shù)值孔徑物鏡的焦距值小,傳播面間采樣距離無法滿足成像關(guān)系的問題.本文所提出的顯微方法,重建過程無需迭代處理.與其它相位顯微方法相比,它具有非干涉、無迭代,實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)不復(fù)雜,成本低,操作方便等優(yōu)點(diǎn).可以應(yīng)用于微米量級尺寸樣品的三維相位顯微成像研究.

1 高倍物鏡顯微成像原理

本文用普通光學(xué)高倍顯微物鏡構(gòu)建顯微系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)相位顯微成像.用顯微系統(tǒng)拍攝樣品成像最清晰位置及兩個(gè)不同傳播距離的放大強(qiáng)度像,利用相位恢復(fù)算法重建物體的相位信息.采樣定理對傳播面的間隔距離有要求,如果間隔距離小于采樣要求,則可能無法恢復(fù)相位[15].

1.1 采樣定理及成像關(guān)系對傳播面間距的要求

基于高倍物鏡的顯微系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)相位顯微成像的關(guān)鍵是如何保證各物面位置滿足成像關(guān)系的同時(shí),使它們之間距離滿足采樣公式的要求.顯微系統(tǒng)的成像關(guān)系與凸透鏡的成像規(guī)律一致.如果CCD能采集到放大實(shí)像,樣品所在平面(O0)及其衍射物面O1、O2應(yīng)位于顯微系統(tǒng)2 倍焦距與焦距之間(圖1)[16].且3個(gè)采樣面間的距離應(yīng)滿足采樣條件的要求.傳統(tǒng)的拍攝方法是移動(dòng)CCD 位置采集O0、O1、O2的衍射放大像,以便進(jìn)行相位重建.高倍物鏡數(shù)值孔徑較大焦距較短,物距(W0)大小與焦距(f)非常接近,二者差值應(yīng)滿足采樣公式要求,以便能容納3個(gè)衍射物面.根據(jù)采樣關(guān)系,當(dāng)入射波長(λ)一定時(shí),相鄰衍射面間傳播距離(z)的取值,與衍射面像素?cái)?shù)M、N以及采樣面上的采樣間隔Δx、Δξ相關(guān),如圖2所示.z需至少滿足采樣公式的最低距離要求才能恢復(fù)相位[15].

圖1 顯微成像關(guān)系示意圖

圖2 采樣關(guān)系示意圖

如果λ=632.8 nm,相鄰衍射物面間像素大小Δξ=Δx=0.1 μm,像素?cái)?shù)目(N)=512,那么z至少需大于29 μm.本文使用高倍物鏡(100 ×,數(shù)值孔徑(NA)=0.9)搭建顯微系統(tǒng),f=2.149 8 mm,雖然理論上2 倍焦距與f之間的距離足夠容納多個(gè)衍射物面,但是由于高倍物鏡焦距很小,且物鏡鏡頭表面在物鏡套筒內(nèi),實(shí)驗(yàn)中不容易測量物距,因而很難控制這一距離.2.2 節(jié)的實(shí)驗(yàn)中,由物像變換關(guān)系實(shí)際得到物距w0=2.178 6 mm,算得樣品與焦距間的距離為29.1 μm.顯微成像關(guān)系要求物面位于系統(tǒng)2 倍焦距與焦距之間,若第一個(gè)衍射物面O1與樣品O0間的距離滿足了采樣公式要求,則第二個(gè)物面O2的位置不會(huì)處于樣品O0與焦距之間,而是位于焦距與透鏡之間,對應(yīng)像面為虛像,因此導(dǎo)致無法恢復(fù)相位.

1.2 同時(shí)移動(dòng)顯微物鏡與CCD的拍攝方法

為了使衍射物面間距既能滿足菲涅爾近似又能滿足采樣定理及成像位置的要求,本文提出一種固定像距,同步移動(dòng)顯微物鏡及CCD 的拍攝方式,可以更方便地滿足上述采樣距離的要求.拍攝方法如圖3所示.

顯微系統(tǒng)的入射光源為相干平面波,照射樣品后,樣品的衍射花樣經(jīng)顯微系統(tǒng)放大,由CCD 相機(jī)記錄物體放大衍射圖樣.O0面為樣品所在平面,首先用CCD 記錄其成像最清晰平面I0的強(qiáng)度信息.像面與顯微物鏡間的距離(Z)為像距,對應(yīng)物面到顯微物鏡的距離(W)為物距.保持Z不變,將顯微物鏡與CCD 沿光場傳播方向同步向后移動(dòng)Δd距離,采集第一個(gè)衍射物面O1的放大像面信息.拍攝完畢后,再次將顯微物鏡與 CCD 同步向后移動(dòng) Δd距離,記錄樣品的第二個(gè)衍射面O2面的放大像.O1、O2、O0三個(gè)衍射面間的距離為 Δd.本文的目標(biāo)是由O1、O2面的強(qiáng)度分布重建O0面的相位分布.

圖3 拍攝方法示意圖

CCD 拍攝的衍射像是物面O1、O2的放大像,由于顯微系統(tǒng)的Z是固定不變的,因此拍攝的三個(gè)放大像相對于物面O0、O1、O2的放大倍率相同.原物面與其放大像的強(qiáng)度分布情況相同,但原衍射物面的像素大小需由物像面間的放大關(guān)系計(jì)算得出.將放大像面的像素尺寸除以顯微系統(tǒng)的放大倍率,就得到O0、O1、O2面的實(shí)際像素大小.顯微系統(tǒng)的放大倍率可利用已知尺寸的樣品來計(jì)算.拍攝樣品成像最清晰位置的放大圖像,將拍攝的樣品尺寸與實(shí)際尺寸相比,得到系統(tǒng)放大倍率(M).M=LI/LO,其中LI為拍攝尺寸,LO為樣品實(shí)際尺寸.拍攝尺寸LI=NΔξ,其中N表示樣品所占像素?cái)?shù)量,Δξ表示CCD 單個(gè)像素尺寸.由放大像的像素大小 Δξ及系統(tǒng)放大倍率M,可計(jì)算出樣品所在平面O0及其衍射物面O1、O2面的像素大小 Δx =Δξ/M.

1.3 相位恢復(fù)方法

已知相鄰衍射面間隔距離Δd,計(jì)算出衍射物面O1、O2的像素大小 Δx,得到振幅分布即可由相位恢復(fù)方法重建O0面的相位分布.重建過程既可沿光場傳播方向由物體所在O0平面向O1、O2面?zhèn)鞑ビ?jì)算,也可由遠(yuǎn)離物體的O2面向物體所在面O0反向傳播計(jì)算.物面O0與衍射面O1、O2間的傳播滿足菲涅爾近似條件.如果已知O2面的復(fù)振幅分布U2(ξ,η),那么O1面的復(fù)振幅分布可由菲涅爾變換表示為[17]：

O1、O0面的傳播過程也可同樣計(jì)算.公式(1)中U2(ξ,η)為O2面的復(fù)振幅分布,U1(x,y)為O1面的復(fù)振幅分布;z為傳播面間的距離;k為波數(shù),k =2π/λ;脈沖函數(shù)為公式(1)也可寫作卷積形式[15]：

重建過程從衍射面O2開始,步驟如下：賦予O2面(-π,π)區(qū)間初始隨機(jī)相位分布φ2,與振幅值(IO2)1/2結(jié)合,得到面的復(fù)振幅分布U2=(IO2)1/2exp(jφ2).將復(fù)振幅U2從面?zhèn)鞑サ絆1面,由公式(2)計(jì)算得到面的復(fù)振幅A1exp(jφ1).將振幅A1替換為(IO1)1/2,保留相位分布φ1,合成新的復(fù)振幅U1=(IO1)1/2exp(jφ1).將U1傳播至O0面,同樣由公式(2)得到樣品所在平面的復(fù)振幅U0=A0exp(jφ0),其中相位φ0即為樣品的重建相位分布.

重建過程也可以由衍射面O0開始,由菲涅爾衍射依次計(jì)算光場傳播到O1、O2面的復(fù)振幅分布,并將計(jì)算振幅替換為測量振幅,最終將O2面的復(fù)振幅分布逆向傳播至O0面,提取相位信息得到重建相位分布.

2 相位顯微成像實(shí)驗(yàn)

使用直徑5 μm 的單分散聚苯乙烯微球作為成像實(shí)驗(yàn)的樣品.用移液槍吸取20 μL 樣本移入清潔的離心管中,加入2 mL 酒精試劑與樣本混合均勻,然后放入超聲波清洗器中超聲分散1 min.用滴管從離心管中吸取樣本,滴一滴在潔凈的載玻片上,用鑷子小心夾住蓋玻片邊緣輕輕蓋在樣品上,將蓋玻片與載玻片接觸的邊緣均勻的滴上密封膠隔絕空氣,制作好樣品裝片.

2.1 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果

搭建顯微系統(tǒng),圖4為系統(tǒng)光路圖.激光器輸出波長632.8 nm,使用奧林巴斯物鏡(100 ×,NA =0.9),CCD(MV1-D2080-160-CL-12,photon focus)所拍圖像像素?cái)?shù)2 080 ×2 080,像素大小 8 μm.由電動(dòng)平移臺控制CCD 的移動(dòng)過程,平移臺可移動(dòng)的最大距離為15 cm,每步最小可移動(dòng)0.1 μm.物鏡可以沿光場傳播方向調(diào)整前后位置,控制與樣品的距離.首先將CCD 調(diào)至成像最清晰的位置,采集此處的圖像.此時(shí)樣品與成像面間的距離約為150 mm.按照1.2 節(jié)所述拍攝方式,每次將CCD 和物鏡均沿傳播方向移動(dòng) Δd =50 μm 的距離,采集另外兩張衍射放大像.截取圖像512 ×512 大小的部分,見圖5(a)和5(b).

圖4 顯微系統(tǒng)光路圖

采集完畢后,測量3個(gè)微球直徑,計(jì)算出成像最清晰處圖像放大倍數(shù)為M=80.物面的像素大小為 8 μm/M=0.1 μm,利用O1和O2面的強(qiáng)度分布,由1.3 節(jié)所述相位恢復(fù)方法重建物體完整光場信息,結(jié)果見圖6(a)和6(b).

圖5 拍攝的像面.(a)CCD從焦面移動(dòng)50μm所拍圖像;(b)CCD從焦面移動(dòng)100μm所拍圖像

圖6(a)為重建的樣品相位信息,從相位分布情況可以清晰地看出微球厚度從中心到邊緣是徑向變化的.如果僅從圖6(c)樣品的強(qiáng)度分布上則無法觀測出有厚度分布變化的情況.如果得知樣品的折射信息,結(jié)合相位去包裹算法,可以應(yīng)用于計(jì)算樣品的真實(shí)厚度值.

圖6 重建結(jié)果.(a)重建物體O處的相位;(b)重建物體O處的振幅;(c)CCD在成像最清晰位置的成像

2.2 與只移動(dòng)CCD拍攝的成像結(jié)果對比

為了進(jìn)一步佐證本文提出方法的有效性,對比了只移動(dòng)CCD 拍攝成像的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,所用物像關(guān)系如圖7所示.拍攝焦面I0及與其相距 20 mm 及140 mm的放大像面I1、I2面,見圖8(a)和 8(b).Z0、Z1、Z2為 3個(gè)放大像面到物鏡的距離,W0、W1、W2為樣品及其衍射物面到物鏡的距離.像面與物面間的放大關(guān)系為Mi=Zi/Wi(i =0,1,2).物像關(guān)系測出焦面放大倍率M0=Z0/W0=74,樣品與焦面距離約為W0+ Z0=165 mm.解得W0=2.178 6 mm,Z0=162.8214 mm,焦距f=2.1498 mm.由物像關(guān)系計(jì)算每個(gè)物面與物鏡的距離W1=2.172 8 mm、W2=2.164 5 mm.三個(gè)物面的像素大小為 8 μm/M0=0.1 μm.O1、O2面間的距離為W1- W2=8.3 μm,O0與O1面的距離約為W0- W1=5.8 μm.解出M1、M2,算出I1、I2面與I0面的放大率比值Xi=Mi/M0(i =1,2),I1、I2面按照1/Xi縮放比例進(jìn)行縮小,得到物面O1、O2的強(qiáng)度分布.由強(qiáng)度分布對物體進(jìn)行相位恢復(fù),重建結(jié)果如圖9所示.

圖7 移動(dòng)CCD拍攝方法的物像關(guān)系示意圖

結(jié)果顯示,只移動(dòng) CCD 拍攝的成像方法,由1.1 節(jié)所述原因,在高倍大數(shù)值孔徑的顯微系統(tǒng)中并不能重建相位結(jié)果.結(jié)合2.1 及2.2 節(jié)的成像結(jié)果,證實(shí)了本文所提出顯微成像方法,應(yīng)用于高倍大數(shù)值孔徑物鏡系統(tǒng)的有效性.本文所提出的拍攝方式,CCD 采集的三個(gè)放大像,因?yàn)橄窬嘞嗤?放大倍率是相同的.因此不必由物像關(guān)系計(jì)算每個(gè)物面與樣品的距離,省去了物像面縮放轉(zhuǎn)換的過程,與傳統(tǒng)移動(dòng) CCD 的拍攝方式相比,計(jì)算過程更加簡潔.

圖8 拍攝的像面與轉(zhuǎn)換后的物面.

圖9 僅移動(dòng)CCD拍攝成像的重建結(jié)果.

3 結(jié) 論

本文通過將相位恢復(fù)與顯微成像相合,提出了一種適用于高倍物鏡顯微系統(tǒng)的相位顯微方法.由100 ×顯微系統(tǒng),成功重建了5 μm 直徑微球樣品的相位分布,證實(shí)了所提出的相位顯微方法的有效性.該方法相對于干涉方法的顯微方法優(yōu)勢在于光路及計(jì)算過程均更加簡便.本工作對于生物醫(yī)學(xué)樣品折射率或厚度分布計(jì)算具有實(shí)際應(yīng)用意義.