手性藥物分離方法的研究進(jìn)展?

石 磊 顏雪明

(南華大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖南 衡陽(yáng) 421001)

0 引 言

手性藥物是指藥物分子中引入手性源后,得到的一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體.對(duì)映異構(gòu)體在物理化學(xué)性質(zhì)上存在一定的差異,其中最顯著的差異是旋光性不同.在化學(xué)藥物、天然藥物、生化藥物這 3 大藥源中,手性藥物占據(jù)相當(dāng)大的比例.藥物在人體內(nèi)藥理作用的發(fā)揮主要是依靠與人體內(nèi)的生物大分子的特異性結(jié)合,不同的立體異構(gòu)體藥物在人體內(nèi)的藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、毒理學(xué)等性質(zhì)存在較大差別,因而表現(xiàn)出不同的治療效果和不良反應(yīng).自20世紀(jì)50年代席卷全球的反應(yīng)停事件起[1],手性藥物的研究引起了人們的極大興趣,手性藥物的分離也因此得到重視.研究還表明,對(duì)手性藥物的對(duì)映異構(gòu)體的分離也有助于提高藥物的生理活性,例如,茚達(dá)利酮的2個(gè)對(duì)映異構(gòu)體都具有促利尿作用,但其R 型的對(duì)映導(dǎo)構(gòu)體作用效果是 S 型的近20倍[2].對(duì)R 型對(duì)映異構(gòu)體的分離純化可以提高其藥效,減小用藥量.正因?yàn)楣鈱W(xué)純藥物具有更好的藥效、用藥也更安全,手性分離技術(shù)的研究也因此得到了廣泛的重視,而今已成為藥物研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域.手性藥物的分離方法主要有3種,分別是物理拆分法、化學(xué)拆分法和生物拆分法。 本研究圍繞這3種方法展開(kāi)綜述。

1 物理拆分法

物理拆分法是利用對(duì)映異構(gòu)體在物理性質(zhì)上的差異,如溶解度、熔沸點(diǎn)、密度等,通過(guò)物理手段將對(duì)映異構(gòu)體拆分的一種方法.但由于對(duì)映體的化學(xué)性質(zhì)極為相似,單純的利用物理性質(zhì)的差異很難達(dá)到較好的分離效果,而往往需要借助一些現(xiàn)代化儀器才能實(shí)現(xiàn)對(duì)映體的高分離純度.現(xiàn)代色譜分離技術(shù)在對(duì)映異構(gòu)體分離方面有巨大的優(yōu)越性.常用的手性藥物分離技術(shù)有：超臨界流體色譜(SFC)、高效液相色譜(HPLC)、高速逆流色譜(HSCCC)等.

1.1 色譜分離法

1.1.1 超臨界流體色譜

超臨界流體色譜是以超臨界流體做流動(dòng)相,依靠流動(dòng)相的溶劑化能力來(lái)進(jìn)行分離、分析的一種色譜過(guò)程,是20世紀(jì)80年代發(fā)展和完善起來(lái)的新型分離技術(shù).超臨界流體色譜兼具有氣相色譜和液相色譜的特點(diǎn),可以分析沸點(diǎn)高、揮發(fā)性低的樣品,這是氣相色譜所做不到的,而它的分析速度又比液相色譜快,常用的流體有超臨界二氧化碳和氧化亞氮.相比于一般的色譜分離,手性色譜法的特點(diǎn)在于固定相或流動(dòng)相中必須有一相是手性相,從而使得手性藥物在不同的固定相中有不同的吸附能力,在不同的流動(dòng)相中有不同的溶解度,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)手性藥物對(duì)映異構(gòu)體的分離.

常用的手性固定相有Pirkle 刷型手性固定相、π-酸手性固定相、π-堿手性固定相、環(huán)糊精手性固定相、大環(huán)抗生素類手性固定相、冠醚類手性固定相、天然的多糖衍生物手性固定相等,不同的固定相應(yīng)用于不同手性藥物的分離,如Pirkle 刷型手性固定相是以3,5-二硝基苯甲酰為母體,再接上苯基甘氨酸或亮氨酸形成的手性配體,可直接分離內(nèi)酰胺、安息香類鎮(zhèn)靜劑[3];π-酸、π-堿手性固定相是利用 π-酸、π-堿的手性特異性識(shí)別,對(duì)內(nèi)酰胺類藥物具有很好的分離效果[4];環(huán)糊精類手性固定相是利用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)化酶對(duì)淀粉進(jìn)行水解得到的具有6～12個(gè)葡萄糖單元的手性環(huán)狀低聚糖,水解程度的不同可得到不同的環(huán)糊精,此類手性固定相可用來(lái)分離巴比妥類、胺類等極性較大的藥物[5];大環(huán)抗生素類手性固定相可用來(lái)分離甲苯巴比妥對(duì)映體[6].

手性色譜的流動(dòng)相往往需要根據(jù)特定的固定相來(lái)選擇,超臨界流體所用的溶劑是CO2,分離不同的手性藥物時(shí),需要添加一些夾帶劑以改善其溶解性能,夾帶劑可以是極性溶劑(如甲醇、乙醇等),也可以是酸堿.Svensson 等[7]用 N,N-二甲基正辛烷、乙酸和20%的甲醇改性的超臨界CO2做流動(dòng)相分離了美托洛爾等相似的手性藥物;陳海等[8]用乙腈作為改性劑,在 CO2∶乙腈 =90 ∶(2～15),CO2流速為1.8 mL/min 的條件下,分離安息香和反式-二苯乙烯氧化物(TSO),其結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

圖1 S-安息香(a)和R-安息香(b)結(jié)構(gòu)式

SFC 法正處于迅速發(fā)展的階段,該法分離手性藥物具有選擇性高,分離效果好,分離速度快等優(yōu)勢(shì),但其可用的固定相和流動(dòng)相的物質(zhì)往往較為昂貴,操作條件嚴(yán)格,對(duì)設(shè)備要求高等因素,導(dǎo)致SFC技術(shù)分離手性藥物的成本較高,經(jīng)濟(jì)效益不高等劣勢(shì).SFC 技術(shù)目前仍有很大的提升空間,在節(jié)約成本,尋找低廉、更好的固定相、流動(dòng)相方面,在未來(lái)幾年將會(huì)是分離手性藥物的研究熱點(diǎn).

1.1.2 高效液相色譜

高效液相色譜是目前應(yīng)用最廣泛的色譜分析方法,其分離手段主要分為直接法和間接法兩種.直接法又可分為手性固定相法和手性流動(dòng)相添加劑法;間接法又稱為手性衍生化添加劑法.

手性固定相法,所采用的固定相與超臨界流體色譜法的固定相相似,目前所應(yīng)用的范圍主要有冠醚,纖維素衍生物為固定相,用正己醇-異丙醇為流動(dòng)相分離左旋半托拉唑[9];Chiralpk DI 手性色譜柱,在流動(dòng)相為正己烷-乙醇下分離N-叔丁氧羰基-3-羥基-1-金剛烷甘氨酸對(duì)映體[10];周敏等[11]以羧甲基-β-環(huán)糊精為手性固定相,拆分了17種順式β-內(nèi)酰胺.

手性流動(dòng)相添加劑法,如王嘉林和王斯坦[12]以β-環(huán)糊精為手性流動(dòng)相添加劑,在反向高效液相色譜下分離鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)映體;謝升谷等[13]用乙酸銅和N,N-二甲基-L-苯丙氨酸為手性流動(dòng)相添加劑,拆分多巴異構(gòu)體,多巴結(jié)構(gòu)如圖2,其分離度為6.1.具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn).

圖2 S-多巴(a)和R-多巴(b)結(jié)構(gòu)式

手性衍生化添加劑法,如以R-4-N,N-二甲基磺酰胺-7-(3-異氰酸吡咯烷)-2,1,3-苯并氧雜咪唑?yàn)槭中匝苌噭?利用反相高效液相色譜法拆分甲狀腺素對(duì)映體D,L-四碘甲狀腺原氨酸(T4)和 L-三碘甲狀腺原氨酸(T3),同時(shí)該方法也可成功地應(yīng)用于甲狀腺片中T3和T4的含量測(cè)定[14];袁明輝等[15]使用苯甲酰氯對(duì)(R,S)-3-奎寧環(huán)醇進(jìn)行柱前衍生化,衍生化方法如下圖3所示,引入的苯甲?；鶊F(tuán)能增強(qiáng)其手性中心對(duì)手性色譜柱填料的辨識(shí)能力,從而更快的分離奎寧環(huán)醇對(duì)映體.

圖3 (R,S)-3-奎寧環(huán)醇苯甲酰氯衍生化流程圖

高效液相色譜法分離手性對(duì)映體具有應(yīng)用性廣,分離純度高等優(yōu)勢(shì),但也存在所用的固定相同超臨界流體固定相相似,對(duì)流動(dòng)相的要求又比較高(流動(dòng)相試劑純度等方面)等劣勢(shì),同時(shí),由于HPLC本身發(fā)展時(shí)間較長(zhǎng),技術(shù)相對(duì)成熟,在手性藥物的分離中具有非常重要的地位.

1.1.3 高速逆流色譜

高效逆流色譜技術(shù)是基于高效液相色譜發(fā)展起來(lái)的色譜分離技術(shù),不同的是,高效逆流色譜的色譜柱采用的是螺旋柱,可以做高速離心運(yùn)動(dòng).在螺旋色譜柱中加入互不相容的兩相,其中一相為密度較大的固定相,另一相為密度較小的流動(dòng)相,被分離的對(duì)映體在兩相之間具有不同的分配系數(shù),利用螺旋柱運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的離心力,實(shí)現(xiàn)逐一分離.

高效逆流色譜較其他色譜方法有很多優(yōu)點(diǎn),如分離有固定相的色譜法更加徹底,不存在樣品與固定相之間的吸附、變性等弊端,同時(shí)液-液分配體系還有利于節(jié)約材料和溶劑,利用螺旋柱的運(yùn)動(dòng),使得分離效率和分離速度具有更進(jìn)一步的提升.

王小平[16]用羥丙基-β-環(huán)糊精為手性試劑,采用高速逆流色譜對(duì)芳基羧酸衍生物以及薄荷醇酯進(jìn)行手性拆分;吳燕燕[17]在基于高效逆流色譜的條件下,對(duì)苦參中的黃酮類成分進(jìn)行提取和分離.目前,利用高速逆流色譜分離的藥物有大豆異黃酮、黃酮苷類等天然藥物.

1.2 毛細(xì)管電泳分離法

毛細(xì)管電泳法主要是利用樣品中各組分的離子淌度或分配系數(shù)不同,在電流的作用下,實(shí)現(xiàn)樣品各組分分離的手段.毛細(xì)管分離方法機(jī)理主要是手性藥物對(duì)映體與固定相形成不同的包合物,對(duì)映體之間所形成的包合物穩(wěn)定性存在差異,在電流作用下,穩(wěn)定性差的包合物被破壞,穩(wěn)定性好的包合物在流動(dòng)相中隨流動(dòng)相流出,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)映體的分離.包合物的穩(wěn)定性主要由分子間作用力、氫鍵等控制.常用的固定相有環(huán)糊精衍生物、冠醚、蛋白質(zhì)衍生物[18]等,流動(dòng)相一般需要根據(jù)手性藥物的極性做選擇,選擇原則為相似相溶原理,如 Wistuba等[19]采用甲基化β-環(huán)糊精(CD)固定相鍵合的毛細(xì)管電色譜,以磷酸-甲醇緩沖溶液為流動(dòng)相,在加壓的條件下,分離 N-甲基-5-苯基-5-乙基巴比妥酸、環(huán)己烯巴比妥、戊巴比妥等對(duì)映體;李英杰等[20]用毛細(xì)管電泳色譜,以順丁烯二酸酐-β-CD 為手性選擇劑分離了沙丁胺醇;趙楠和李英杰[21]以6-乙二胺-β-CD 和馬來(lái)酸酐為原料,合成了 6-(N-乙基氨基馬來(lái)酸)-氨基-β-CD(UPA-β-CD),并以此為手性選擇劑,利用毛細(xì)管電泳法對(duì)鹽酸克倫特羅、非尼拉敏這兩種手性藥物進(jìn)行拆分.目前,還有人將納米粒子用于毛細(xì)管電泳分離手性藥物[22].

毛細(xì)管電泳法主要有以下幾種不同的分離模式：毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)、毛細(xì)管等速電泳(CITP)、毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)、毛細(xì)管電色譜(CEC)和非水毛細(xì)管電泳(NACE).近年來(lái),新發(fā)展的毛細(xì)管微乳電動(dòng)色譜(MEEKC)與親和毛細(xì)管電泳(ACE)等在手性藥物分離方面也有著廣闊的應(yīng)用前景.毛細(xì)管電泳分離法具有成本低、分離模式多、分離效率高等諸多優(yōu)點(diǎn),前六種分離方法已得到廣泛的應(yīng)用,在手性藥物的分離中發(fā)揮著重要的作用.

1.3 結(jié)晶法

結(jié)晶法是利用結(jié)晶的方法分離外消旋混合物.結(jié)晶法是利用外消旋混合物中不同對(duì)映體具有不同的熔點(diǎn),在不需要添加任何添加劑輔助劑的情況下,實(shí)現(xiàn)外消旋體的拆分.具體操作是：在一種外消旋混合物的過(guò)飽和溶液中,直接加入某一種對(duì)映體的晶種,即可得到該對(duì)映體.工業(yè)上根據(jù)操作方式的不同,可將結(jié)晶法分為同時(shí)結(jié)晶法和有擇結(jié)晶法.

1.3.1 同時(shí)結(jié)晶法

使外消旋混合物的過(guò)飽和溶液通過(guò)兩個(gè)結(jié)晶室,在不同的結(jié)晶室中投入不同的晶種,從而在一條生產(chǎn)線中,得到兩種對(duì)映體結(jié)晶.將剩余的溶液進(jìn)行濃縮,再一次通過(guò)結(jié)晶室,從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)化的分離.如工業(yè)生產(chǎn)抗高血壓藥物 L-甲基多巴的中間體[23].

1.3.2 有擇結(jié)晶法

是在同一個(gè)容器中,交替加入兩種對(duì)映體的晶種,對(duì)映體先后從溶液中析出的過(guò)程.工業(yè)上生產(chǎn)氯霉素、甲砜霉素等都是利用該方法進(jìn)行分離[23],有擇結(jié)晶分離過(guò)程是亞穩(wěn)態(tài)的,體系受外界影響較大,循環(huán)次數(shù)越多,摻雜雜質(zhì)的可能性越大,會(huì)影響對(duì)映異構(gòu)體的分離.

2 化學(xué)拆分法

化學(xué)拆分法是通過(guò)在外消旋混合物中添加手性添加劑,手性添加劑往往是手性酸或者手性堿.手性添加劑與外消旋混合物中的對(duì)映體反應(yīng)生成非對(duì)映異構(gòu)體混合物,生成的非對(duì)映異構(gòu)體混合物在物理性質(zhì)上存在很大的差異,利用非對(duì)映異構(gòu)體混合物的物理差異,可以結(jié)合結(jié)晶法對(duì)其進(jìn)行分離,因此,這種分離方法也被叫做間接結(jié)晶法.

化學(xué)拆分的前提是外消旋混合物能與添加的手性拆分劑發(fā)生反應(yīng)生成非對(duì)映異構(gòu)體混合物,且非對(duì)映異構(gòu)體混合物中至少有一種非對(duì)映體能形成結(jié)晶或兩種非對(duì)映體在同一種溶劑中的溶解度具有顯著差異.

常用的手性酸有酒石酸、扁桃酸和樟腦磺酸;常用的手性堿有麻黃堿、α-甲基芐胺和2-氨基-1-丁醇,常用的手性酸和手性堿見(jiàn)圖4.

圖4 常用的手性酸和手性堿

普瑞巴林就是利用(S)-扁桃酸和 γ-氨基酸反應(yīng)生成非對(duì)映異構(gòu)體,在四氫呋喃/H2O 中結(jié)晶獲得普瑞巴林[23];工業(yè)上生產(chǎn)抗生素的中間體 D-苯甘氨酸是添加光學(xué)純的(+)-樟腦磺酸為拆分劑進(jìn)行拆分[23];酒石酸-硼酸絡(luò)合酸在 NACE 中能分離11種氨基醇類手性藥物[24].

雖然化學(xué)拆分法操作簡(jiǎn)單易行,但其明顯的局限性在于拆分劑和溶劑的選擇較為盲目,拆分劑價(jià)格昂貴等,這些因素也限制了化學(xué)拆分在分離手性藥物中的使用.

3 生物拆分法

生物拆分法分離手性藥物主要有生物酶分離法和生物膜分離法兩種.

3.1 生物酶分離法

生物酶分離法主要是應(yīng)用酶與手性藥物的特異性結(jié)合而實(shí)現(xiàn)分離,生物酶具有四維空間結(jié)構(gòu),不同的空間結(jié)構(gòu)和藥物的結(jié)合位點(diǎn)不同,酶的活性中心是不對(duì)稱結(jié)構(gòu),這是酶特異性識(shí)別手性藥物的基礎(chǔ),從而導(dǎo)致不同結(jié)構(gòu)的底物與酶的結(jié)合能力不同,可以利用這一性質(zhì),將手性藥物進(jìn)行分離.

生物酶分離手性藥物具有副產(chǎn)物少,分離效率高,操作簡(jiǎn)單和無(wú)污染等優(yōu)勢(shì),但由于酶的活性受溫度、pH 等環(huán)境因素影響較大,因此生物酶催化法仍有其局限性.熊吉濱和劉均忠[25]利用氨基?；腹潭ɑ?xì)胞,考察了溫度、 pH 值、底物濃度等對(duì)酶促反應(yīng)的影響.在最佳條件下成功拆分 N-乙酰-D,L-3-甲氧基丙氨酸,且氨基?；腹潭ɑ?xì)胞對(duì) N-乙酰-L-3-甲氧基丙氨酸的拆分率可達(dá)96%;柯彩霞等[26]介紹了不同種生物酶在外消旋體拆分中的應(yīng)用.

3.2 生物膜分離法

生物膜分離技術(shù)主要是利用膜的孔徑對(duì)藥物分子進(jìn)行篩分的過(guò)程,而生物膜由于其表面有一定的生物分子的存在,在藥物分子穿過(guò)膜孔時(shí),還會(huì)受到生物分子的特異性識(shí)別,能被識(shí)別的藥物分子將正常通過(guò)膜孔,而不能被識(shí)別的藥物分子將繼續(xù)留在膜的一側(cè),從而達(dá)到生物分離的作用.目前的生物膜往往需要加入一定的手性拆分劑來(lái)分離手性藥物,如 Higuchi 等[27]用固定 DNA 膜和DNA 溶劑體系兩種方法比較對(duì)外消旋苯丙氨酸進(jìn)行拆分的異同.DNA 膜與L-苯丙氨酸的相互作用,使得L-苯丙氨酸優(yōu)先透過(guò)固定DNA 的纖維素手性拆分膜,而在 DNA 溶劑體系的超濾中,則是 D-苯丙氨酸優(yōu)先透過(guò)膜;張志良和王兵[28]利用合成的手性杯[4]芳烴修飾生物膜分離了萘普生對(duì)映異構(gòu)體.

膜分離技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的新興節(jié)能技術(shù),對(duì)其的研究尚處于起步階段,但生物膜分離技術(shù)的連續(xù)性和能量低耗有效等眾多優(yōu)點(diǎn),已成為許多研究員研究熱點(diǎn).

生物分離法相比與物理和化學(xué)分離法具有污染少,條件相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì),在未來(lái)將會(huì)是手性藥物分離研究的熱點(diǎn).

4 結(jié)束語(yǔ)

手性藥物的分離純化有助于提高藥物的療效,減小藥物對(duì)人體的不良作用,從而提高用藥安全.目前應(yīng)用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中的手性藥物分離方法各有不同的優(yōu)點(diǎn)和適用范圍,但各類分離方法仍有諸多不足,如何改善分離效果,提高分離效率,并能使其工業(yè)化生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)無(wú)污染,高效率,高經(jīng)濟(jì)效益等將會(huì)成為今后研究的重點(diǎn),同時(shí),通過(guò)計(jì)算機(jī)技術(shù)模擬藥物分離過(guò)程也將大大促進(jìn)手性分離技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展,手性分離技術(shù)研究也必將成為藥物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn).