紅葡萄酒中花色苷的超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜檢測方法建立

陳欣然, 張波, 張歡, 解迎雙, 王波, 周小平, 李敏, 韓舜愈*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730700) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué))，甘肅 蘭州，730700) 3(甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州，730000)

顏色是評價(jià)葡萄酒質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，花色苷作為顏色的物質(zhì)基礎(chǔ)，在其中發(fā)揮著重要的作用。檢測發(fā)現(xiàn)，花色苷是一類多酚類物質(zhì)，作為一種安全性高的天然色素已在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[1]。紅葡萄酒中的花色苷可以從葡萄果皮中浸漬而來，并在生產(chǎn)和貯藏中轉(zhuǎn)化形成以花色苷及其衍生物為主要類型的花色苷體系，從而影響葡萄酒的色澤[2]。這其中花翠素(delphinidin，Dp)、花青素(cyanidin，Cy)、3’-甲基花翠素(petunidin，Pt)、3’-甲基花青素(peonidin，Pn)和3’, 5’-二甲花翠素(malvidin，Mv)的3-O-單葡萄糖苷形式和其?；问?乙?；?、p-香豆酰基和咖啡?；?的衍生物是葡萄和葡萄酒中主要的花色苷[3]。

近年來，由于缺乏花色苷標(biāo)準(zhǔn)品，導(dǎo)致可準(zhǔn)確鑒定的花色苷數(shù)量有限。因此，建立高靈敏度、高準(zhǔn)確度的花色苷分析方法越來越受到人們的關(guān)注。目前，國外對葡萄及葡萄酒中花色苷物質(zhì)及其衍生物的鑒定研究比較成熟[4-5]，但國內(nèi)對葡萄及葡萄酒中花色苷的研究卻主要集中在對總花色苷的提取及含量測定方面，其中紫外分光光度法最為常見[6]，而對花色苷的定性鑒定則多采用液相色譜技術(shù)[7-8]。超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography tandem triple quaternary mass spectrometry，UPLC-ESI-QQQ)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新的天然產(chǎn)物有效成分定性定量分析方法，可以在缺少標(biāo)準(zhǔn)品的情況下對提取物中微量成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，具有靈敏度高，選擇性強(qiáng)，分析快速，定量重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，是目前最受關(guān)注的分析檢測技術(shù)。

本研究以紅葡萄酒為材料，以UPLC-ESI-QQQ為檢測方法，通過不同洗脫程序選擇最佳方案，建立超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)檢測葡萄酒花色苷的分析方法，進(jìn)一步采用UPLC-ESI-QQQ技術(shù)，判斷花色苷結(jié)構(gòu)類型，為深入研究葡萄及葡萄酒中色素種類提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣：本實(shí)驗(yàn)室自釀的紅葡萄酒樣品：美樂干紅葡萄酒(2017年)、赤霞珠桃紅葡萄酒(2017年)、混釀干紅葡萄酒(2017年)。將1 mL紅酒樣品直接注入0.45 μm無機(jī)膜(聚醚砜)過濾，然后分析。

標(biāo)準(zhǔn)品：花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、3’-甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、3’, 5’-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、3’-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷(美國Miragen公司，純度均≥98.0%)。

試劑：甲酸(分析級)、乙腈(色譜級)、甲醇(色譜級)、水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.2 儀器

Agilent 1290系列UPLC(G1316C二元高壓梯度泵，G4226A自動(dòng)進(jìn)樣器，G4220A柱溫箱)；Agilent 6460型三重四級桿質(zhì)譜；SK8200H型超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；OFO-945601型渦旋混合器，美國Talboys公司；CP224S型分析天平，德國Sartorius公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將購得的標(biāo)準(zhǔn)品分別用2%甲酸甲醇溶解，然后轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中定容，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存于-20 ℃。根據(jù)試驗(yàn)情況，再把標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成不同質(zhì)量濃度的工作液。

1.3.2 色譜條件

參考LI[9]的方法并略有改動(dòng)。色譜柱：Poroshell 120 EC-C18柱(150 mm×2.1 mm，2.7 μm；Agilent Technologies)；進(jìn)樣體積：3 μL；流動(dòng)相A(V(甲酸)∶V(水)=0.2∶100)，流動(dòng)相B(V(甲酸)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=0.2∶50∶50)；柱溫：30 ℃。具體的梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.3 質(zhì)譜條件

ESI離子源溫度350 ℃；正離子模式；霧化器壓力35 psi；干燥氣流速12 L/min；干燥氣溫度350 ℃；m/z掃描范圍100～1 000。

1.3.4 花色苷成分的定量分析

以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)3’,5’-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)，對其進(jìn)行相關(guān)外標(biāo)定量，質(zhì)量濃度梯度為0～50 mg/L，9個(gè)水平，其他花色苷以相當(dāng)于3’, 5’-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析由安捷倫質(zhì)譜亨特工作站軟件版本b.04.00數(shù)據(jù)采集和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷分析方法的建立

2.1.1 色譜柱的選擇

本試驗(yàn)首先使用葡萄及葡萄酒中5種基本花色苷標(biāo)準(zhǔn)品建立液相方法。花色苷作為極性化合物，易溶于水、甲醇和乙腈等極性溶劑[10]，我們通常采用非極性固定相和極性流動(dòng)相的反相色譜法分析花色苷。首先選擇用Zorbax SB C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)色譜柱對其進(jìn)行分離。當(dāng)甲酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH為1.5時(shí)，鍵合相會逐漸水解，降低柱效，造成峰展寬，保留時(shí)間長，并且存在拖尾現(xiàn)象，影響本試驗(yàn)對5種花色苷的準(zhǔn)確定性和定量。而Poroshell 120 EC-C18(150 mm×2.1 mm，2.7 μm)色譜柱有較強(qiáng)的耐酸性，可在pH 1.5條件下重復(fù)進(jìn)樣，縮短了保留時(shí)間，獲得了良好的峰形、優(yōu)異的重現(xiàn)性。該色譜柱為亞3 μm填料和表面多孔層，顆粒分布度小，柱效高。其多孔層和實(shí)心核的特點(diǎn)限制了擴(kuò)散距離，提高了花色苷物質(zhì)的分離速度，而窄粒徑分布則提高了柱效和分離度，實(shí)現(xiàn)了花色苷物質(zhì)的快速、高效分離[11]。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

在分離的反相系統(tǒng)中，常采用混合水相和有機(jī)相作為流動(dòng)相，并隨著時(shí)間改變流動(dòng)相的洗脫能力，從而改變被測組分的相對保留值[12]。由于花色苷類物質(zhì)結(jié)構(gòu)類似，不能通過改變?nèi)軇?qiáng)度而增加分離度，而當(dāng)有機(jī)相為甲醇、乙腈(V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1)時(shí)，花色苷物質(zhì)響應(yīng)更高且噪音更低。此外，pH較高時(shí)(pH>2.5)，由于花色苷中常有的烊陽離子形式存在干擾[3]，導(dǎo)致色譜峰加寬。為了避免這種現(xiàn)象發(fā)生，本試驗(yàn)選擇甲酸調(diào)節(jié)pH環(huán)境至1.5水平，在此條件下對花色苷進(jìn)行分離，并進(jìn)行準(zhǔn)確定量。另外，在ESI+模式下，甲酸還可以提供H+，提高了花色苷的離子化效率[13]。因此，當(dāng)以V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1為有機(jī)相，并加入0.2%甲酸時(shí)，樣品中花色苷分離度、重現(xiàn)性均較好，得到了理想的分離效果。

2.2 方法學(xué)評價(jià)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍的確定

取高于定量下限不同濃度的含花色苷混合標(biāo)準(zhǔn)液，配成9個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)樣，每個(gè)水平點(diǎn)重復(fù)操作3次，進(jìn)樣分析，分別獲得各自的峰面積，通過建立樣品質(zhì)量濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其回歸方程，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)R2?？紤]到進(jìn)樣質(zhì)量濃度太高，質(zhì)譜響應(yīng)值將過大，超過儀器所能響應(yīng)的上限會導(dǎo)致質(zhì)量數(shù)不準(zhǔn)確，因此，檢測樣品時(shí)將通過稀釋相關(guān)倍數(shù)，使質(zhì)量濃度在線性范圍之內(nèi)。

由表2可知，5種花色苷標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程的R2在0.99以上，各方法檢出限較低(0.001～0.010 mg/L)，表明該方法對花色苷檢測有較高的靈敏度。

表2 五種花色苷回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2.2 精密度及回收率試驗(yàn)

分別以0.02、0.04、0.06 mg/L三個(gè)質(zhì)量濃度為添加水平，每個(gè)水平重復(fù)6次，在已知花色苷含量的葡萄酒樣中添加相應(yīng)質(zhì)量濃度的5種基本花色苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫靜置30 min后，按照1.3.2和1.3.3方法測定葡萄酒中5種花色苷含量，結(jié)果見表3。由表3可知，回收率為83.38%～118.71%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。日內(nèi)精密度與日間精密度RSD分別為0.62%～1.70%，2.13%～3.90%，表明日內(nèi)與日間有良好的穩(wěn)定性，可用于葡萄酒中花色苷的定量分析。

表3 精密度及添加回收率(n=6)

2.3 花色苷物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定

在QQQ儀器中，Q1和Q3為兩掃描四極模塊，在其之間，包含有Q2模塊，作為碰撞池結(jié)構(gòu)。選擇性離子檢測(selected ion monitor)即單離子監(jiān)測(single ion monitor)掃描方式，對于已知化合物，為了提高某個(gè)離子的靈敏度，并排除其他離子的干擾，Q1只允許目標(biāo)離子通過，而其他離子不被記錄，Q2碰撞單元產(chǎn)生碎片離子，Q3只分析一個(gè)碎片離子。[M+H]+為花色苷的分子離子，可以利用不同的毛細(xì)管電壓掃描固定[M+H]+，根據(jù)各離子在不同電壓下碎裂的相應(yīng)豐度找出最佳的碰撞誘導(dǎo)解離電壓。而在碎片離子掃描模式下找出最佳的碰撞能量，以及各化合物的碎片離子。優(yōu)化好分子離子解離電壓和碎片離子碰撞能量后，采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測葡萄酒中目標(biāo)花色苷。

源于葡萄原料中的花色素的單葡萄糖苷、乙?；咸烟擒铡⑾愣辊；咸烟擒找约翱Х弱；咸烟擒?，分別通過丟失一個(gè)葡萄糖、乙?；咸烟?、香豆?；咸烟呛涂Х弱；咸烟?，產(chǎn)生[M-162]+、[M-204]+、[M-308]+和[M-324]+特征性碎片離子，而在葡萄酒發(fā)酵和陳釀過程中形成的4位乙烯甲酸、乙烯基兒茶酚、乙烯基苯酚等衍生物，由于4位上基團(tuán)比較穩(wěn)定，在ESI-QQQ的正離子模式下不發(fā)生裂解，僅從3位上丟失葡萄糖、乙?；咸烟?、香豆?；咸烟呛涂Х弱；咸烟悄阁w，產(chǎn)生相應(yīng)的[M+A-162]+、[M+A-204]+、[M+A-308]+、[M+A-324]+的特征性碎片離子(A為4位上縮合的基團(tuán)分子量)。

花色苷的極性不同，其洗脫順序也不同[9,14]。其洗脫規(guī)律可總結(jié)為：(1)對于具有相同取代基的花色苷，洗脫順序?yàn)榛ù渌?、花青素?’-甲基花翠素、3’-甲基花青素、3’, 5’-二甲花翠素；(2)對于其?；ㄉ障疵擁樞?yàn)椋悍酋；?、乙酰化、香豆?；⒖Х弱；Ｆ渲?，香豆?；樖疆悩?gòu)體較反式異構(gòu)體洗脫時(shí)間早，這與之前報(bào)道相一致[15-16]。研究表明，出現(xiàn)香豆?；ㄉ盏捻樖疆悩?gòu)體，是葡萄皮經(jīng)過陽光照射的緣故[16-17]；(3)對于吡喃型花色苷，其洗脫順序?yàn)橐蚁┗姿幔胰?，丙酮?-乙烯基鄰苯二酚，4-乙烯基苯酚，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等。

依據(jù)花色苷母離子、子離子質(zhì)譜信息并結(jié)合其洗脫規(guī)律，可推測出花色苷類物質(zhì)，如表4所示。

表4 花色苷物質(zhì)譜信息表

續(xù)表4

序號化合物母離子(m/z)碎裂電壓/V子離子(m/z)碰撞能量/V保留時(shí)間/min424-乙烯苯酚3’, 5’-二甲花翠素香豆?；?3-O-葡萄糖苷4-vinylphenol adduct of Mv-3-O-coumaroylglu7551054473027.427434-乙烯愈創(chuàng)木酚花翠素-3-O-葡萄糖苷4-vinylguaiacol adduct of Dp-3-O-glu6111034493024.005444-乙烯愈創(chuàng)木酚3’, 5’-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷4-vinylguaiacol adduct of Mv-3-O-glu6391354771924.665454-乙烯愈創(chuàng)木酚花翠素香豆?；?3-O-葡萄糖苷4-vinylguaiacol adduct of Dp-3-O-coumaroylglu7571054492527.425

注：glu為glicoside的縮寫。(下同)。

2.4 花色苷物質(zhì)含量分析

利用上述建立的優(yōu)化技術(shù)檢測來自本實(shí)驗(yàn)室自釀的美樂干紅葡萄酒(2017年)、赤霞珠桃紅葡萄酒(2017年)、黑比諾赤霞珠美樂混釀干紅葡萄酒(2017年)3種酒樣，從其中共鑒定出45種花色苷類物質(zhì)(表5)。

表5 不同葡萄酒樣中花色苷含量以Mv-3-O-glu計(jì))

續(xù)表5

序號化合物品種(均為2017年葡萄酒)赤霞珠桃紅美樂干紅混釀干紅324-乙烯兒茶酚3’-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷4-vinylcatechol adduct of Pt-3-O-glu0.01±0.520.25±0.300.21±0.94334-乙烯兒茶酚3’-甲基花青素-3-O-葡萄糖苷4-vinylcatechol adduct of Pn-3-O-glu0.04±0.960.54±0.610.54±0.79344-乙烯兒茶酚3’, 5’-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷4-vinylcatechol adduct of Mv-3-O-glu0.42±0.993.45±0.803.96±1.00354-乙烯兒茶酚花青素乙?；?3-O-葡萄糖苷4-vinylcatechol adduct of Cy-3-O-acetylgluTrace0.10±0.570.10±0.84364-乙烯兒茶酚3’-甲基花翠素香豆?；?3-O-葡萄糖苷4-vinylcatechol adduct of Pt-3-O-cou-maroylgluND0.01±0.640.01±0.81374-乙烯苯酚3’-甲基花青素-3-O-葡萄糖苷4-vinylphenol adduct of Pn-3-O-glu0.03±0.910.18±0.960.18±0.87384-乙烯苯酚3’, 5’-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷4-vinylphenol adduct of Mv-3-O-glu0.96±0.625.06±0.804.30±0.93394-乙烯苯酚花翠素乙?；?3-O-葡萄糖苷4-vinylphenol adduct of Dp-3-O-acetylgluTrace0.01±0.860.01±0.94404-乙烯苯酚3’-甲基花青素乙酰化-3-O-葡萄糖苷4-vinylphenol adduct of Pn-3-O-acetylglu0.01±0.870.18±0.410.13±1.00414-乙烯苯酚3’, 5’-二甲花翠素乙?；?3-O-葡萄糖苷4-vinylphenol adduct of Mv-3-O-acetylglu0.15±0.422.37±0.511.58±0.78424-乙烯苯酚3’, 5’-二甲花翠素香豆酰化-3-O-葡萄糖苷4-vinylphenol adduct of Mv-3-O-coumaroylglu0.01±0.950.47±0.480.31±0.98434-乙烯愈創(chuàng)木酚花翠素-3-O-葡萄糖苷4-vinylguaiacol adduct of Dp-3-O-glu0.05±0.840.25±0.630.21±0.62444-乙烯愈創(chuàng)木酚3’, 5’-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷4-vinylguaiacol adduct of Mv-3-O-glu0.15±0.800.29±0.740.29±0.44454-乙烯愈創(chuàng)木酚花翠素香豆?；?3-O-葡萄糖苷4-vinylguaiacol adduct of Dp-3-O-coumaroyl-gluTrace0.02±0.770.01±0.86

注：Trace，痕量；ND，未檢測到。

從表5中可以看出，無論是從種類還是含量的分布上，主要以源自葡萄的5種花色素葡萄糖苷、花色素乙?；咸烟擒占盎ㄉ叵愣辊；咸烟擒諡橹?，而對與在葡萄酒發(fā)酵和陳釀過程中形成的衍生物，盡管在部分酒樣中只被少量的檢測到，但它們對葡萄酒口味的改變起著重要的作用。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在色譜柱Poroshell 120 EC-C18柱(150mm × 2.1 mm，2.7 μm)，流動(dòng)相A：V(甲酸)∶V(水)=0.2∶100，流動(dòng)相B：V(甲酸)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=0.2∶50∶50色譜條件下，以葡萄和葡萄酒中5種基本花色苷為標(biāo)準(zhǔn)，建立了花色苷分析方法。采用UPLC-ESI-QQQ技術(shù)，結(jié)合MRM多反應(yīng)監(jiān)測，在28 min內(nèi)從不同的葡萄酒樣品中準(zhǔn)確鑒定出45種花色苷及其衍生物。本方法簡單、快速，直接可用于對花色苷類物質(zhì)的準(zhǔn)確定性、定量分析。