轉(zhuǎn)化姜黃素加氫衍生物菌株的篩選鑒定及培養(yǎng)基優(yōu)化

吳傳超，徐富成，顧秋亞，余曉斌*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫， 214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

姜黃素(C21H20O6，curcumin,CUR)是從姜科姜黃屬一些植物的根莖中提取的一種天然多酚類化合物[1]，為橙黃色結(jié)晶粉末，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑[2]。其結(jié)構(gòu)式中獨特的β-二酮結(jié)構(gòu)，使其具有酮與烯醇式互變異構(gòu)體[3-4]，在酸性或中性溶液中以酮式結(jié)構(gòu)存在，在堿性溶液中呈紅褐色的烯醇式[5]。因其具有抗氧化作用[6]、抗炎作用[7]、抗腫瘤作用[8]等多種生理生化活性，日益受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。但水溶性低、生物利用度低、易降解、穩(wěn)定性差[9-12]等特性，限制其在臨床上的廣泛應(yīng)用。

因此，在保留姜黃素原有藥效的基礎(chǔ)上，通過化學(xué)法和微生物法對姜黃素的結(jié)構(gòu)改造以獲得新的衍生物成為近年來研究的熱點[13-14]。

通過對其連接鏈中4個雙鍵不同程度的還原，可以得到相應(yīng)的加氫衍生物[15]。相比于化學(xué)合成法，微生物轉(zhuǎn)化[16-18]具有反應(yīng)條件溫和,選擇性強(qiáng),成本低,環(huán)境友好等特點。MAEHARA SHOJI等[19]從姜黃根莖中分離篩選到1株可制得4種姜黃素衍生物的Diaporthesp.菌株，通過結(jié)構(gòu)鑒定，分別為四氫姜黃素(tetrahydrocurcumin,THC)、六氫姜黃素、(3S,5S)-八氫姜黃素和八氫姜黃素。張維宇等[20]從土壤中分離出1株能夠以姜黃素為底物轉(zhuǎn)化成四氫姜黃素與六氫姜黃素的酵母菌株。羅楊春[21]利用紅球菌90-4以姜黃素為底物生成六氫姜黃素與八氫姜黃素。目前對于姜黃素的加氫衍生物的研究主要集中在四氫姜黃素[22-23]，尚未見對于其他的加氫衍生物，尤其是二氫姜黃素(dihydrocurcumin, DHC)發(fā)酵方面的研究報道。

本研究以實驗室保藏菌種及不同種類的蜂蜜為樣品，首次篩選得到1株酵母菌，它能夠同時以姜黃素為底物生成二氫姜黃素與四氫姜黃素，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)姜黃素加氫衍生物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種,實驗室菌種庫保藏、不同種類的蜂蜜。

試劑：姜黃素(AR級)、乙腈(色譜純)，國藥集團(tuán)有限公司；姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品，大連生物美侖技術(shù)有限公司；二氫姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品，武漢天植生物技術(shù)有限公司；四氫姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；其他實驗所用試劑均為分析純。

篩選培養(yǎng)基[20]:姜黃素2 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO41 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，agar 20 g/L。

固體培養(yǎng)基:YPD、PDA培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基:YPD、PDA液體培養(yǎng)基。

酵母菌基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖40 g/L，蛋白胨2 g/L，姜黃素0.1 g/L，吐溫20 mL/L。

曲霉基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:大米粉5 g/L，玉米粉5 g/L，黃豆粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，甘油20 mL/L,NaNO35 g/L，KH2PO42.5 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

日立U-3900紫外可見光分光光度計，日本日立株式會社；Agilent-1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司；超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國沃特世公司；高速冷凍離心機(jī)，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 菌種篩選方法

菌種初篩:將實驗室保藏的菌種在篩選培養(yǎng)基(以姜黃素為唯一碳源)中培養(yǎng)3 d，挑選能夠在篩選培養(yǎng)基上生長的單菌落。將1 g不同種類的蜂蜜用無菌水稀釋到10-4～10-6的菌懸液，取100 μL涂布于篩選培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)5 d。觀察菌落的生長狀況，從平板上生長的菌落中挑取各種形態(tài)不一樣的單菌落，置于甘油管中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

菌種復(fù)篩：將初篩得到的菌種經(jīng)過基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后，采用HPLC檢測產(chǎn)物，通過比對CUR、DHC、THC標(biāo)準(zhǔn)品HPLC的出峰時間和峰面積，確定待檢測菌種能否將底物姜黃素轉(zhuǎn)化成加氫衍生物及其產(chǎn)率。

1.4 分析檢測方法

1.4.1 樣品前處理方法

將篩選的菌種取固體培養(yǎng)基上單菌落接種至種子液培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min條件下，培養(yǎng)2 d，以10%的接種量接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，在30 ℃、180 r/min條件下，培養(yǎng)3 d。實驗中同時設(shè)立菌種對照和底物對照，即轉(zhuǎn)化體系中只加菌體不加姜黃素和轉(zhuǎn)化體系中只加入姜黃素不加菌種。轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液離心(8 000 r/min，10 min)分離菌體，取上清液，用乙酸乙酯萃取3次，每次30 mL，合并萃取液，于45 ℃減壓蒸餾除去乙酸乙酯，用10 mL的色譜級甲醇溶解，用0.22 μm微孔濾膜過濾得到轉(zhuǎn)化液，待檢測分析。

1.4.2 CUR、DHC與THC檢測波長的選擇

稱取CUR、DHC和THC標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%)適量，溶于色譜甲醇，定容得標(biāo)準(zhǔn)溶液。稀釋到適宜的濃度后，在200～600 nm內(nèi)進(jìn)行全光譜掃描，確定其檢測波長[24]。

1.4.3 液相色譜檢測方法[25]

將轉(zhuǎn)化液樣品譜圖與底物對照組樣品、菌種對照組樣品和標(biāo)準(zhǔn)品組圖譜進(jìn)行相互比對，觀察是否出現(xiàn)新的峰。色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，Agilent)。流動相：0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，30%～60% B，10～12 min，60%～65% B，12～15 min，65%～70% B，15～20 min，70%～100% B)。檢測波長：280 nm(THC與CUR)、370 nm(DHC)，進(jìn)樣量：15 μL,流速:1 mL/min，檢測溫度：30 ℃。

1.4.4 液質(zhì)聯(lián)用測定方法

轉(zhuǎn)化液使用UPLC-Q-TOF SYNAPT MS(美國Waters公司)進(jìn)一步測定，分析軟件為Mass Lynx V4.3。色譜條件：色譜儀為Waters Acquity UPLC；檢測器為Waters Acquity PDA；檢測波長：200～600 nm；柱溫：45 ℃；流速：0.3 mL/min；流動相：A-100%甲醇，B-0.1%甲酸。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源：負(fù)離子電離模式(ESI-)；離子源溫度, 100 ℃；脫溶劑溫度, 400 ℃；毛細(xì)管電壓, 3 kV；錐孔電壓, 20 V；碰撞能量6 V；選擇離子掃描范圍m/z20～1 000。

1.5 產(chǎn)率的計算

(1)

式中：C，濃度，mol/L;M,摩爾質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 篩選培養(yǎng)基的結(jié)果

按照1.3的方法，在篩選培養(yǎng)基(以CUR為唯一碳源)能夠生長的菌種有83株，其中酵母菌種有52株，曲霉菌種有31株。

2.2 高效液相復(fù)篩結(jié)果

采用HPLC測定83株菌種轉(zhuǎn)化液中是否含有DHC與THC。結(jié)果如圖1所示，能夠通過轉(zhuǎn)化DHC與THC的菌種有5株(其中酵母菌種有3株、曲霉菌種有2株)，只產(chǎn)DHC有3株，只產(chǎn)TCH有5株。菌株ISO344的姜黃素轉(zhuǎn)化率最優(yōu)，DHC為10.49%,THC為13.67%。選取ISO344菌株作為目的菌種。

圖1 菌株對姜黃素的生物轉(zhuǎn)化率

Fig.1 Biotransformation rate of curcumin by strain

2.3 HPLC高效液相色譜法分析產(chǎn)物

2.3.1 DHC與THC標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取5 mg DHC與THC標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于10 mL色譜甲醇，稀釋到不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)液(0.05、0.1、0.15、0.2、0.3 g/L)，每組重復(fù)3次，檢測各自的質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系，DHC的標(biāo)準(zhǔn)方程為Y

=16 092X+15.016，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，出峰時間為10.973 min。THC的標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=28 922X+63.919，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，出峰時間為10.558 min。

2.3.2 菌種ISO344轉(zhuǎn)化液高效液相的結(jié)果

分別將處理后菌種ISO344的樣品組、底物對照組、菌種對照組的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行HPLC進(jìn)一步鑒定，如圖2右邊所示，樣品組(圖2-A)在10.963 min處出峰，與DHC標(biāo)準(zhǔn)品(圖2-D)、CUR標(biāo)準(zhǔn)品(圖2-E)基本吻合，底物對照組與菌種對照組在該時間點均未出現(xiàn)峰。如圖2左邊所示，樣品組(圖2-a)在10.473 min處出峰，與THC標(biāo)準(zhǔn)品(圖2-d)、CUR標(biāo)準(zhǔn)品(圖2-e)基本吻合，底物對照組與菌種對照組在該時間點均未出現(xiàn)峰?？梢猿醪酱_定該菌種能夠以CUR為底物生產(chǎn)DHC與THC。

A-樣品組在370 nm下HPLC圖；B-底物對照在370 nm下HPLC圖；C-菌種對照在370 nm下HPLC圖；D-DHC標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖；E-CUR標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖;a-樣品組在280 nm下HPLC圖；b-底物對照在280nm下HPLC圖；c-菌種對照在280 nm下HPLC圖；d-THC標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖；e-CUR標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖圖2 菌株ISO344轉(zhuǎn)化液液相圖譜

Fig.2 Liquid phase map of strain ISO344

2.4 菌種ISO344轉(zhuǎn)化液液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果

將菌種ISO344轉(zhuǎn)化液，進(jìn)行UPLC-TOF-MS分析，進(jìn)一步確定目標(biāo)產(chǎn)物的相對分子量，根據(jù)離子色譜圖、負(fù)離子一級質(zhì)譜圖以及一些特征的碎片離子進(jìn)一步推斷轉(zhuǎn)化液中是否含有DHC與THC。質(zhì)譜掃描范圍m/z0～700。如圖3-A所示轉(zhuǎn)化液在分子量370(DHC)處保留時間TR分別為4.69 min和5.75 min(具有酮式和烯醇式互變結(jié)構(gòu))，圖3-B所示轉(zhuǎn)化液在分子量372(THC)處保留時間TR分別為4.76 min和5.68 min (具有酮式與烯醇式結(jié)構(gòu))。

轉(zhuǎn)化液在4.69 min與5.75 min處的負(fù)離子吸收峰(一級質(zhì)譜圖)如圖4-A和4-B所示，轉(zhuǎn)化液的負(fù)離子圖譜中主要有一個明顯的最高峰，在m/z369.1和370.01分別代表[M]-和[M+H]-的質(zhì)譜信號峰,可以推測該物質(zhì)為DHC。圖4-C、4-D分別是轉(zhuǎn)化液在4.76 min與5.68 min的負(fù)離子吸收峰(一級質(zhì)譜圖)，其負(fù)離子圖譜中分別在m/z371.1和372.1分別代表[M]-和[M+H]-的質(zhì)譜信號峰，可以推測該物質(zhì)為THC。故可進(jìn)一步確認(rèn)該菌株ISO344可以姜黃素為底物轉(zhuǎn)化為DHC及THC。

A-轉(zhuǎn)化液在370分子量下的離子色譜圖；B-轉(zhuǎn)化液在372分子量下的離子色譜圖圖3 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用選擇離子色譜圖

Fig.3 High performance liquid chromatography-mass spectrometry combined ion chromatogram

A-轉(zhuǎn)化液在4.69 min處一級質(zhì)譜圖；B-轉(zhuǎn)化液在5.75 min處一級質(zhì)譜圖;C-轉(zhuǎn)化液在4.76 min處一級質(zhì)譜圖；D-轉(zhuǎn)化液在5.68 min處一級質(zhì)譜圖圖4 菌株ISO344轉(zhuǎn)化液的一級質(zhì)譜圖

Fig.4 Primary mass spectrum of strain ISO344

2.5 真菌的初步鑒定

2.5.1 菌種形態(tài)特征

將菌株ISO344在YPD固體平板上培養(yǎng)3 d，觀察該菌種在平板上的菌落形態(tài)，其結(jié)果如圖5-A所示。

A-菌株ISO344平板菌落形態(tài)；B-菌株ISO344的顯微特征圖5 菌株ISO344形態(tài)特征

Fig.5 Morphological characteristics of strain ISO344

形狀：圓形；色澤:灰白；質(zhì)地：干燥、粗糙、疏松；邊緣：鋸齒狀隆起；狀況：扁平。顯微鏡檢該菌種，觀察該菌種的形態(tài)，其結(jié)果如圖5-B所示。細(xì)胞呈圓形或橢圓形，緊密排列形成假菌絲。

2.5.2 菌種序列分析

挑取菌株ISO344的單菌落送上海生工生物科技有限公司進(jìn)行基因測序，序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫獲序列號(基因庫登錄號為MH894770)。利用BLAST程序?qū)λ鶞y菌種26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列進(jìn)行同源性比對，并用MEGA7.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。用鄰接法(neighbor-joining)進(jìn)行發(fā)育樹分析。

由圖6可知，通過與模式菌株和試驗菌株基因序列比對分析，發(fā)現(xiàn)該菌株與Cyberlindnerarhodanensisstrain DMKU-RK452相似性的高達(dá)100%，因此確定該菌株為Cyberlindnerarhodanensis。

圖6 基于26S rDNA Dl/D2區(qū)序列構(gòu)建的菌株ISO344的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

Fig.6 Phylogenetic tree of ISO344 based on the 26S rDNA D1/D2 domain sequence alignment

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.6.1 碳源對菌株轉(zhuǎn)化姜黃素的影響

以酵母菌的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，考察不同碳源以及不同濃度對產(chǎn)率的影響，如圖7所示。以葡萄糖為碳源時，DHC與THC的產(chǎn)率達(dá)到最大，分別為(9.85±0.12)%和(14.48±0.13)%，與其他碳源相比DHC和TCH產(chǎn)率存在顯著性差異(P<0.05)。因此選取40 g/L與20 g/L葡萄糖進(jìn)行后續(xù)的試驗。

圖7 不同碳源(A)及碳源質(zhì)量濃度(B)對DHC和THC的影響

Fig.7 Effects of different carbon sources(A) and carbon source concentrations(B) on DHC and THC

2.6.2 氮源對菌株轉(zhuǎn)化姜黃素的影響

DHC與THC產(chǎn)率隨著氮源種類及質(zhì)量濃度的變化而變化。由圖8可知，在30 g/L蛋白胨時，DHC產(chǎn)率達(dá)到最大，為(15.48±0.22)%。

圖8 不同氮源(A)及氮源質(zhì)量濃度(B)對DHC和THC的影響

Fig.8 Effects of different nitrogen sources(A) and nitrogen sources concentration(B) on DHC and THC

在20 g/L蛋白胨時，THC產(chǎn)率達(dá)到最大，為(20.52±0.13)%,與其他氮源相比，DHC和TCH產(chǎn)率存在極顯著性差異(P<0.01)。因此確定DHC與THC發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)氮源為蛋白胨，質(zhì)量濃度分別為30 g/L和20 g/L。

2.6.3 無機(jī)鹽對菌株轉(zhuǎn)化姜黃素的影響

無機(jī)鹽是菌體細(xì)胞生長代謝不可或缺的成分，如圖9所示。在最優(yōu)的碳源與氮源基礎(chǔ)上，DHC在2 g/L K2HPO4產(chǎn)率達(dá)到最大，為(20.20±0.25)%。THC在3 g/L K2HPO4可達(dá)(24.31±0.12)%。K2HPO4不僅為菌體生長代謝提供鉀元素和磷元素，磷酸氫根還能在發(fā)酵液pH的緩沖和調(diào)節(jié)方面發(fā)揮一定的作用。因此選取2 g/L和3 g/L K2HPO4為發(fā)酵培養(yǎng)基最佳無機(jī)鹽。

圖9 不同無機(jī)鹽(A)及無機(jī)鹽質(zhì)量濃度(B)對DHC和THC的影響

Fig.9 Effects of different inorganic salts(A) and inorganic salts concentration(B) on DHC and THC

3 結(jié)果與討論

本試驗采取以姜黃素為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基，篩選出83株菌種。通過HPLC初步確定有5株菌種能夠以姜黃素為底物，轉(zhuǎn)化生成DHC和THC。選擇初始產(chǎn)率最高的菌株ISO344作為目的菌種，進(jìn)而通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對轉(zhuǎn)化液進(jìn)行分析，進(jìn)一步推測是否含有DHC與THC。經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察和26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列比對分析，鑒定為Cyberlindnerarhodanensis。對基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行單因素試驗優(yōu)化，使DHC產(chǎn)率由10.49%提高至20.20%,THC產(chǎn)率由13.67%提高至24.31%。還需要多因素多水平的組合優(yōu)化實驗，得到更為準(zhǔn)確的優(yōu)化培養(yǎng)基，此外還需分離提純DHC與THC做進(jìn)一步鑒定。