白細胞介素9在重癥肌無力發(fā)病中的作用

何柳平，楊歡

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是一種由于神經肌肉接頭突觸后膜乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AchR）被自身抗體破壞，從而引發(fā)神經肌肉接頭傳遞障礙的自身免疫性疾病，其主要癥狀是骨骼肌易疲勞性[1]。研究顯示，AChR-特異性的輔助性T（Th）細胞與自身反應性抗體的產生密切有關，并在MG和實驗性自身反應性重癥肌無力（experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG）中起著重要作用[2]。CD4+T細胞可分為Th1、Th2、Th17及調節(jié)性T細胞等[3,4]，在MG的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用。既往認為IL-9是Th2相關的細胞因子，現已表明IL-9主要是由CD4+Th細胞亞群中的Th9所分泌[5]，在炎癥性疾病中有著重要作用[6-8]。研究顯示，血清IL-9水平在EAMG中上升，IL-9抗體能抑制EAMG動物疾病進展和降低血清中抗AChR Ab IgG的水平[9]。但針對IL-9在MG患者中的研究極少，本研究通過檢測MG患者治療前后血清及CD4+T細胞中IL-9的水平，進一步分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年3月至2018年4月就診于中南大學湘雅醫(yī)院神經內科確診為MG的患者22例納入MG組，14例患者有抗膽堿酯酶劑服用史，均無免疫抑制劑服用史。MG診斷標準：具備MG典型的臨床癥狀和體征，即疲勞試驗陽性，同時新斯的明試驗陽性，并經神經電生理檢查確診。記錄患者年齡、性別、用藥史、定量重癥肌無力評分（quantitive myasthenia gravis score，QMG）及抗AChR抗體滴度。選擇我院排除感染、神經系統及自身免疫系統疾病、且性別和年齡匹配的健康體檢者21例納入對照組。2組年齡和性別差異無統計學意義，見表1。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

表1 2組一般情況比較

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與材料 人血清IL-9檢測試劑盒購于美國ThermoFisher公司，人外周血CD4+T分選磁珠購于德國Miltenyi公司，逆轉錄及熒光定量PCR試劑盒購于加拿大Abm公司。

1.2.2 血清標本收集及指標檢測 MG組患者給予免疫抑制劑治療（其中口服糖皮質激素15例，口服他克莫司3例）治療，共治療8周。于治療前、后，抽取患者靜脈血10 mL，分離血清，－80℃保存。對照組于體檢時抽取患者靜脈血10 mL，分離血清，－80℃保存。①血清IL-9水平檢測：采用ELISA法檢測血清IL-9水平，試驗步驟及結果定性嚴格參照ELISA試劑盒說明書。②CD4+T細胞IL-9表達水平檢測：2組各隨機選取8例受試，密度離心法提取人外周血中單個核細胞，免疫磁珠分選單個核細胞中的CD4+T細胞，流式檢測分選細胞純度＞95%。Trizol法提取CD4+T細胞總mRNA，采用RT-qPCR法檢測IL-9表達。所有實驗步驟均按照說明書操作。③抗AChR抗體滴度檢測：送血清樣本至廣州達安檢驗公司，采用ELISA法檢測抗AChR抗體滴度。④于治療前、后對患者進行進行QMG評分[10]。

1.3 統計學處理

采用SPSS 23.0及Graph Prism5.0軟件處理數據。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本均數t檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

本研究結束時，MG組失訪4例，共獲得18例數據，納入分析。MG組治療前血清IL-9水平為（9.12±1.13）pg/mL，高于對照組的（4.51±0.96）pg/mL（P＜0.05）；MG組治療后血清IL-9水平為（3.13±0.42）pg/mL，低于本組治療前（P＜0.05）；見圖1。

RT-qPCR法檢測結果顯示，治療前MG組外周血CD4+T細胞中IL-9的相對表達水平高于對照組（P＜0.05）；治療后MG組CD4+T細胞中IL-9的相對表達水平為低于本組治療前（P＜0.05）；見圖2。

將MG患者治療前、后血清IL-9水平分別與對應時間點的QMG評分和抗AChR抗體滴度進行相關性分析，未發(fā)現IL-9水平與QMG評分，IL-9水平與抗AChR抗體滴度之間存在顯著相關性，見圖3。

圖1 各組血清IL-9水平及治療前后變化

圖2 各組CD4+T細胞中IL-9的表達水平及治療前后變化

圖3 血清IL-9水平與QMG評分和抗AChR抗體滴度的相關性

3 討論

既往研究顯示，CD4+T細胞及其輔助細胞亞群中的Th1、Th2及Th17、調節(jié)性T細胞（Treg）均參與了MG和EAMG的發(fā)生[2,11]。當CD4+初始T細胞受到轉化生長因子β（TGF-β）和IL-4的共同刺激后，可分化為Th9[12]。Th9在Ⅱ型變態(tài)反應方面的功能與Th2細胞有關，而在自身免疫方面與Th1細胞和Th17細胞有關，其分泌的IL-9可在Th1/Th17細胞介導的炎癥和Treg中產生廣泛作用[13,14]。MG是一種自身免疫性疾病，探討IL-9在MG患者中的表達與作用有助于闡釋MG的發(fā)病機制。本研究結果顯示，與對照組相比，MG組治療前血清IL-9水平明顯升高，MG組治療后血清IL-9水平較治療前下降（均P＜0.05）。這與EAMG動物實驗結果顯示的Th9比例及血清IL-9水平上升相一致[9]。在其他自身免疫相關性疾病也有類似報道，IL-9細胞比例及血清IL-9在類風濕性關節(jié)炎[15]、系統性紅斑狼瘡[16,17]中升高。IL-9在MG發(fā)病機制中所起作用，可能是由于Th9細胞能通過分泌IL-9介導募集自身免疫功能的Th17細胞[18]，而Th17細胞和調節(jié)性T細胞失衡在MG發(fā)病機制中的作用已被報道[2,19]。進一步研究顯示Th17細胞也可產生大量IL-9[20]，而產生的IL-9反過來可使Th17擴增，從而在類風濕關節(jié)炎[21]、多發(fā)性硬化[22]和系統性紅斑狼瘡[23]等自身免疫疾病中起作用。在IL-9R敲除的EAE小鼠模型中，Th17數量減少[24]。與此一致，在MG外周血中Th17比例增加[19]，由此推測IL-9可能通過影響CD4+T的不同亞群細胞，在MG中起作用，這需要進一步的研究去驗證。

Th9細胞主要由CD4+初始T細胞分化而來，而IL-9主要由Th9分泌[18]。因此，本研究進一步分析MG患者CD4+T細胞中IL-9的水平，結果顯示與對照組相比，MG組治療前CD4+T細胞中IL-9表達上調，且MG組治療后其IL-9水平較治療前下降（均P＜0.05）。Ouyang等[25]研究發(fā)現在未接受治療的系統性紅斑狼瘡患者中，血清IL-9水平升高，經過激素治療，其水平出現下降。目前的研究尚未闡明免疫治療使血清IL-9水平下調的機制。推測有以下幾個原因：①免疫治療使血清中IL-4下降[26]，從而引起由CD4+初始T細胞轉化分泌IL-9的Th9細胞減少。②激素治療可降低外周血中產生IL-9的CD4+T數量[25]。這提示IL-9在MG的發(fā)病過程中可能起了一定的作用，需進一步研究證實。

研究顯示，IL-9能促進B細胞分泌IgE和IgG抗體[27-30]。本研究結果顯示：IL-9與患者血清中抗AChR抗體滴度之間并無明顯相關性，這與前人的研究不一致。既往研究顯示，IL-9抗體能抑制EAMG動物疾病進展和降低血清中anti-AChR Ab IgG的水平[9]。在系統性紅斑狼瘡動物模型中，也發(fā)現IL-9抗體能降低血清抗dsDNA抗體滴度，緩解狼瘡腎炎的癥狀[31]。在系統性紅斑狼瘡中，IL-9和IL-17能通過激活B細胞內的JAK/STAT途徑，增加STAT3磷酸化，進而誘導B細胞的活化與自身抗體的產生[32,33]。在EAMG中，應用IL-9抗體后也發(fā)現STAT3表達是下調的[9]，但是在MG患者中尚無此研究，故需要進一步擴大樣本量去驗證IL-9與MG血清中抗AChR抗體的關系，并提示最好的是驗證AChR抗體特異性B細胞與IL-9之間的關系。本研究中未發(fā)現IL-9與患者QMG評分之間的明顯相關性。血清IL-9水平與自身免疫性疾病的嚴重程度及治療的關系尚存在爭議，既往也有研究顯示在系統性紅斑狼瘡及風濕性關節(jié)炎患者中，其血清IL-9與疾病的嚴重程度之間無明顯相關性[16]。這可能與IL-9既能促進Th17擴增，又增強Treg細胞的抑制功能[19,34]有關。在不同疾病的復雜機體免疫反應過程中，Th9可作為一把“雙刃劍”，既有免疫保護的作用，也有免疫致病的方面。

綜上所述，本試驗結果顯示IL-9在成年人MG患者治療前的血清和CD4+T細胞中表達升高，且治療后下降，其可能參與了MG的發(fā)病過程。但是否可作為評價MG的治療監(jiān)測指標，還需進一步加大樣本量，進行臨床分析。