艾灸促進(jìn)壓力性損傷組織血管新生的機(jī)制研究

于杰，孫忠人，李洪玲，趙惠

壓力性損傷（又稱席瘡、壓瘡）是由于局部組織長期受壓，繼而發(fā)生持續(xù)缺血、缺氧以及營養(yǎng)不良，致使組織發(fā)生潰爛、壞死的外科疾患?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為壓力性損傷屬于慢性、難愈性創(chuàng)面，具有缺乏微血管數(shù)量、組織低氧血癥、缺乏相關(guān)修復(fù)因子及上皮化延遲等特點(diǎn)，壓力性損傷一旦形成后將面臨創(chuàng)面難以愈合的問題［1-5］。艾灸可以促進(jìn)壓力性損傷創(chuàng)面組織的愈合，療效確切，但其作用機(jī)制還不完全清楚，因此探索艾灸治療本病的作用機(jī)制尤為重要［1］。本課題組利用免疫組化技術(shù)從蛋白層面對RAS/RAF/ERK 信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子進(jìn)行檢測，旨在為探討艾灸促進(jìn)壓力性損傷愈合、血管新生的作用及可能存在的分子機(jī)制提供療效保障，為皮膚壓力性損傷乃至慢性損傷組織的機(jī)制研究、修復(fù)及愈合相關(guān)研究提供重要理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)［1-5］。

本文創(chuàng)新點(diǎn)：

（1）從祖國醫(yī)學(xué)特色理論層面分析，艾灸治療壓力性損傷切中要害。艾灸治療本病，不僅能夠扶助正氣，提高機(jī)體的免疫力，而且具有殺菌祛邪的作用。艾灸行氣活血，通經(jīng)活絡(luò)，促進(jìn)氣血運(yùn)行，氣機(jī)通暢，營衛(wèi)調(diào)和，故瘀結(jié)自散，其體現(xiàn)了鮮明的中醫(yī)原創(chuàng)特色。（2）從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究前沿角度分析，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）/血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）信號(hào)通路是壓力性損傷組織血管新生的重要理論成果與熱點(diǎn)之一，其主要調(diào)控形成新生血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和其通透性的改變等。通過國內(nèi)外權(quán)威文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)迄今尚未有基于VEGF/VEGFR2 信號(hào)通路的艾灸促進(jìn)壓力性損傷組織血管新生的研究報(bào)道。（3）鑒于其學(xué)術(shù)重要性與臨床指導(dǎo)意義，本課題以“艾灸促進(jìn)壓力性損傷組織血管新生”為切入點(diǎn)，以VEGF/VEGFR2信號(hào)通路為核心，運(yùn)用祖國醫(yī)學(xué)原創(chuàng)理論中的艾灸“行氣活血，通經(jīng)活絡(luò)”治則，優(yōu)化影響其療效發(fā)揮的相關(guān)因素，采用經(jīng)改良及優(yōu)化的壓力性損傷缺血-再灌注損傷大鼠模型，通過免疫組化從蛋白層面檢測RAS/RAF/ERK 信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)，深入研究艾灸促進(jìn)壓力性損傷組織血管新生的分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2015 年12 月—2017 年3 月對120 只體質(zhì)量為230～245 g 的清潔級健康雌性SD 大鼠（系黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）給予單籠喂養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食并活動(dòng)［1-3］。在40%～50%相對濕度、溫度（19.0±2.1）℃、明暗周期12 h的環(huán)境中進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d 后選取85 只給予造模處理，另35 只作為空白組，對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要儀器及試劑 儀器：DHP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），RM2235 型切片機(jī)、EG1160 組織包埋機(jī)、DM4000B 顯微鏡、HI1220 烘片機(jī)（德國LEICA 公司），醫(yī)用微波爐（青島海爾）。包埋盒（世泰實(shí)驗(yàn)耗材有限公司），電動(dòng)理發(fā)器（寧波真漢子電器有限公司），壓力性損傷造模裝置（規(guī)格厚度為1.5 cm 有機(jī)玻璃板、純凈水瓶底座、十字形托盤、不銹鋼絲網(wǎng)、502 膠水、膨脹螺絲、帆布條、鋼珠、塑料制尼龍?jiān)鷰В?，非接觸式電子溫度計(jì)（廣州市金鑫寶電子有限公司），電子天平（MP200A 型，上海精密儀器廠）。試劑：五年陳艾（有煙艾條，規(guī)格18 mm×200 mm，南陽藥益寶艾草制品有限公司）、醫(yī)用碘伏，敏感肌膚型薇婷牌脫毛膏（利潔時(shí)家化中國有限公司），醫(yī)用酒精，醫(yī)用棉簽，0.9%氯化鈉溶液，定性濾紙1001-6508，水合氯醛。磷酸鹽緩沖液（PBS）（SLB-P1010-2、solarbio），蘇木素染液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），無水乙醇、石蠟、二甲苯，BSA 封閉液（SLB-SW3015、solarbio），蒸餾 水，Anti-VEGFA 抗 體（VG-1） （ab1316、ABCAM），Phospho-p44/42 MAPK （ERK1/2） （Thr202/Tyr204） （D13.14.4E）XP ? Rabbit mAb（#4370、Cell Signaling Technology），KRAS Polyclonal Antibody（12063-1-AP、Proteintech） 以及抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒（Proteintech）。

1.3 壓力性損傷動(dòng)物模型的制備 分別用塑料制尼龍?jiān)鷰⒋笫笏膫€(gè)部位固定（腹部、雙側(cè)腋下、雙側(cè)踝部、雙側(cè)腹股溝內(nèi)側(cè)），充分暴露造模部位后備皮（備皮長寬均為20 mm），消毒待造模處及螺釘錐度側(cè)。將造模裝置固定于大鼠腿部近膝關(guān)節(jié)骨隆突處（即造模處），通過缺血-再灌注損傷循環(huán)周期模式制備壓力性損傷動(dòng)物模型。1 個(gè)循環(huán)=缺血期（120 min）+再灌注期（30 min），5 個(gè)循環(huán)/d，持續(xù)3 d。30 min 的再灌注期解壓松綁大鼠，任其活動(dòng)、飲水及進(jìn)食。造模3 d 后，持續(xù)1 d 的觀察期，用以評價(jià)模型制備的成功與否，并剔除制備失敗的動(dòng)物模型［2-3］。動(dòng)物模型的評價(jià)參照2～3 期壓力性損傷（即2016 年NPUAP 公布的最新指南）［6］，并進(jìn)行肉眼（創(chuàng)面顏色、形態(tài)及滲出物性質(zhì)）及行為學(xué)（大鼠整體狀態(tài)、性情、步態(tài)及二便等）的觀察［7］。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)治療 遵循先造模后隨機(jī)的原則，進(jìn)行壓力性損傷缺血-再灌注模型制備。85 只大鼠中，造模過程中死亡9 只，造模失敗6 只。將造模成功的70 只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和艾灸組，35 只/組；造模后至干預(yù)過程中模型組和艾灸組各有5 只大鼠脫落。另35 只大鼠作為空白組，其中5 只大鼠于備皮時(shí)出現(xiàn)負(fù)損傷而給予剔除。3 組動(dòng)物捆綁方式均相同，即對大鼠腹部、雙側(cè)腋下、雙側(cè)踝部、雙側(cè)腹股溝內(nèi)側(cè)四個(gè)部位通過塑料制尼龍?jiān)鷰Ю壒潭ㄓ诓讳P鋼絲網(wǎng)上?？瞻捉M不予造模，僅對模擬造模部位處進(jìn)行碘伏處理。模型組僅對創(chuàng)面進(jìn)行碘伏常規(guī)處理，艾灸組先對創(chuàng)面予碘伏處理，繼予艾灸回旋灸操作，以壓力性損傷創(chuàng)面為中心，10 mm 為半徑，1 次/d，15 min/次。將艾條燃燒端及非接觸式電子溫度儀探頭與壓力性損傷創(chuàng)面的距離控制在30 mm左右，將艾灸溫度控制在40～42℃，每30 s 測量1 次溫度，全程施灸操作需注意對艾條燃燒過程中產(chǎn)生的灰燼及時(shí)處理，旨在達(dá)到艾灸療效最佳化與負(fù)損傷最小化。

1.5 標(biāo)本采集 分別將模型組和艾灸組大鼠于治療第1、3、5、7、10 天進(jìn)行標(biāo)本采集，空白組大鼠隨同以上兩組于上述5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材處理（3 組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各選6 只大鼠進(jìn)行處理）。標(biāo)本采集前測定所有大鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量不同分別給予對應(yīng)的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，取材區(qū)域?yàn)橐詨毫π該p傷創(chuàng)面正中心為圓點(diǎn)、5 mm 為半徑的皮膚全層組織。取材過程中注意勿將組織打卷，展平固定在濾紙中，置于包埋盒中，貯存在盛有10%的中性甲醛溶液，24 h 內(nèi)進(jìn)行包埋處理，標(biāo)本采集后所有大鼠脫頸椎處死。

1.6 免疫組化操作步驟 （1）酒精梯度脫水：60%乙醇溶液浸泡30 min →80%乙醇溶液浸泡30 min →95%乙醇溶液浸泡30 min →100%乙醇Ⅰ浸泡30 min →100%乙醇Ⅱ浸泡30 min。（2）透明：在二甲苯與酒精等量混合溶液中浸泡15 min →二甲苯浸泡30 min。（3）浸蠟：在石蠟和二甲苯等量混合溶液中浸泡15 min→石蠟Ⅰ30min→石蠟Ⅱ 30 min。（4）包埋：將浸蠟后的皮膚組織依次包埋成塊。（5）切片：切片厚度≤4 μm，烘烤60 min。（6）脫蠟及水化：二甲苯脫蠟處理，將切片置于二甲苯中浸泡10 min，共進(jìn)行2 次→在無水乙醇中浸泡1 min，共進(jìn)行3 次→在95%乙醇溶液中浸泡2 min →在85%乙醇溶液中浸泡2 min →在75%乙醇溶液中浸泡2 min →蒸餾水沖洗2 min，共進(jìn)行3 次。（7）抗原修復(fù)：室溫下進(jìn)行3%過氧化氫滅活處理→蒸餾水沖洗2 min，共進(jìn)行3 次→浸入枸櫞酸鹽緩沖液（pH 值為6.0）→微波爐加熱98 ℃，至沸騰狀態(tài)→自然冷卻至室溫20 min →PBS 沖洗1 min，共進(jìn)行3 次→用油性筆畫出加抗體的范圍，一般超過組織3 mm。（8）封固：滴加5%BSA 封固液，在室溫狀態(tài)下封固60 min，將多余的液體甩掉，不洗。（9）孵育一抗：滴加經(jīng)過稀釋后的一抗，4 ℃恒溫過夜→取出后于室溫狀態(tài)下復(fù)溫20 min → PBS 沖洗2 min，共進(jìn)行3 次。（10）孵育二抗：滴加經(jīng)過稀釋后的二抗→37 ℃孵育30 min →PBS 沖洗2 min，共進(jìn)行3 次。（11）DAB 顯色：DAB 顯色1 min →室溫顯色→鏡下觀測顯色結(jié)果，終止顯色→蒸餾水沖洗。（12）復(fù)染：蘇木素復(fù)染1 min →流水沖洗干凈，沖反面→鹽酸酒精分化3 s →流水沖洗返藍(lán)10 min。（13）脫水、透明及封固：在75%乙醇溶液中浸泡2 min →在85%乙醇溶液中浸泡2 min →在95%乙醇溶液中浸泡2 min →在無水乙醇中浸泡1 min，共進(jìn)行2 次→置于二甲苯中浸泡5 min，共進(jìn)行2 次→給予中性樹膠封固→顯微鏡下觀察。

1.7 讀片及結(jié)果判定 采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件，設(shè)置圖像采集系統(tǒng)在同一參數(shù)狀態(tài)，于400 倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行拍攝切片，以胞質(zhì)及細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)未重疊的視野，取均值。對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、RAS、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（P-ERK1/2）的陽性表達(dá)進(jìn)行半定量分析，標(biāo)準(zhǔn)化到每100μm2積分光密度值（IOD），即（IOD 值）/100 μm2。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用ANOVA 檢驗(yàn)，多重比較采用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光學(xué)顯微鏡下VEGF 表達(dá)情況 400 倍高倍鏡下可見，VEGF 在壓力性損傷皮膚組織中的陽性表達(dá)部位位于胞質(zhì)中，在上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中均有表達(dá)。VEGF 在正常大鼠皮膚組織中呈弱陽性表達(dá)，于空白組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均呈弱陽性表達(dá)狀態(tài)。當(dāng)壓力性損傷出現(xiàn)后，創(chuàng)面組織中VEGF 蛋白表達(dá)逐漸升高，而后降低，向正常皮膚組織表達(dá)水平回落。艾灸組與模型組兩組組內(nèi)VEGF蛋白均呈現(xiàn)先升高后降低的表達(dá)趨勢，但兩組組內(nèi)表達(dá)高峰值存在區(qū)別，艾灸組組內(nèi)高峰值出現(xiàn)在治療3 d 后，而模型組組內(nèi)高峰值出現(xiàn)在碘伏處理5 d 后（見圖1）。

2.2 光學(xué)顯微鏡下RAS 表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，400 倍高倍鏡下可見，RAS 蛋白在壓力性損傷皮膚組織中的陽性表達(dá)部位位于胞質(zhì)中。當(dāng)損傷出現(xiàn)后，創(chuàng)面組織中RAS 蛋白表達(dá)較正常組織呈現(xiàn)先降低，而后升高的表達(dá)狀態(tài)。艾灸組與模型組兩組組內(nèi)RAS 蛋白均呈現(xiàn)逐漸升高趨勢（見圖2）。

2.3 光學(xué)顯微鏡下P-ERK1/2 表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，400倍高倍鏡下可見，P-ERK1/2 蛋白在壓力性損傷皮膚組織中的陽性表達(dá)部位位于胞質(zhì)中。當(dāng)壓力性損傷出現(xiàn)后，創(chuàng)面組織中P-ERK1/2 蛋白表達(dá)逐漸升高，再降低，向正常皮膚組織表達(dá)水平回落。艾灸組與模型組兩組組內(nèi)P-ERK1/2 蛋白均呈現(xiàn)先升高后降低的表達(dá)趨勢，但兩組組內(nèi)表達(dá)高峰值存在區(qū)別，艾灸組組內(nèi)高峰值出現(xiàn)在治療3 d 后，而模型組組內(nèi)高峰值出現(xiàn)在碘伏處理5d 后（見圖3）。

圖13 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)壓力性損傷創(chuàng)面組織中VEGF 表達(dá)情況（×400）Figure 1 Expression of VEGF protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different time-points

2.4 VEGF 表達(dá)水平 第1、3、5、7、10 天模型組壓力性損傷創(chuàng)面組織中VEGF 表達(dá)水平高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第3、5 天艾灸組壓力性損傷創(chuàng)面組織中VEGF 表達(dá)水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.5 RAS 表達(dá)水平 第1、3、5、7、10 天模型組壓力性損傷創(chuàng)面組織中RAS 表達(dá)水平低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第3、5、7、10 天艾灸組壓力性損傷創(chuàng)面組織中RAS 表達(dá)水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.6 P-ERK1/2 表達(dá)水平 第3、5、7、10 天，模型組壓力性損傷創(chuàng)面組織中P-ERK1/2 表達(dá)水平高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第3、5 天艾灸組壓力性損傷創(chuàng)面組織中P-ERK1/2 表達(dá)水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

表13 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)壓力性損傷創(chuàng)面組織中VEGF 表達(dá)水平比較（±s，n=6）Table 1 Comparisons of expression levels of VEGF protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different time-points

表13 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)壓力性損傷創(chuàng)面組織中VEGF 表達(dá)水平比較（±s，n=6）Table 1 Comparisons of expression levels of VEGF protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different time-points

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 第1 天 第3 天 第5 天 第7 天 第10 天空白組 9.53±1.44 8.37±0.80 9.20±1.08 8.83±1.10 9.61±0.99模型組 13.11±1.74a 29.17±3.24a 38.66±4.78a 35.37±5.39a 20.61±2.92a艾灸組 14.58±1.6466.42±7.86b 61.10±8.35b 34.96±4.5518.61±2.21

表23 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)壓力性損傷創(chuàng)面組織中RAS 表達(dá)水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparisons of expression levels of RAS protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different time-points

表23 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)壓力性損傷創(chuàng)面組織中RAS 表達(dá)水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparisons of expression levels of RAS protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different time-points

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 第1 天 第3 天 第5 天 第7 天 第10 天空白組 43.14±5.1545.07±5.3141.10±4.4744.09±5.1342.40±4.71模型組 24.47±2.70a 27.13±3.13a 32.20±3.95a 34.38±3.89a 36.22±3.97a艾灸組 22.40±2.2944.21±5.20b 61.19±7.68b 67.33±7.91b 74.56±9.36b

表33 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)壓力性損傷創(chuàng)面組織中P-ERK1/2 表達(dá)水平比較（x±s，n=6）Table 3 Comparisons of expression levels of P-ERK1/2 protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different timepoints

圖23 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)壓力性損傷創(chuàng)面組織中RAS 表達(dá)情況（×400）Figure 2 Expression of RAS protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different time-points

圖33 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)壓力性損傷創(chuàng)面組織中P-ERK1/2 表達(dá)情況（×400）Figure 3 Expression of P-ERK1/2 protein on the wound surface in 3 groups of rats with pressure injuries at different time-points

3 討論

《瘍科心得集·瘍證總論》［8］曾載：“夫病之來也……而其致病之由，又不越乎內(nèi)因、外因二者?！眽毫π該p傷通常繼發(fā)于創(chuàng)傷截癱、痿證、中風(fēng)偏癱等重大慢性疾病后，此類疾病的共性特點(diǎn)為因疾病限制活動(dòng)，故喪失生活自理的能力并長期臥床。艾灸能夠調(diào)暢氣機(jī)，營衛(wèi)自和，可消除久病所致的瘀血等病理產(chǎn)物。艾灸燃燒時(shí)利用其溫?zé)嵝?yīng)，可針對腧穴及所在經(jīng)絡(luò)發(fā)揮溫經(jīng)散寒及調(diào)節(jié)氣血的作用，同時(shí)將艾絨的本身藥效作用于其中，共奏行氣活血，通經(jīng)活絡(luò)之功效［9］。另外，艾灸可以激發(fā)人體的正氣，正氣充實(shí)則足以抵御外來的邪氣。研究表明，艾灸不僅能夠明顯抑制大腸埃希菌、綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌，在改善血供方面兼具優(yōu)勢，其能夠迅速加快肉芽組織的生長，炎癥及其他滲出物亦由此得到有效的消散及吸收，繼而使創(chuàng)面的愈合進(jìn)程得到顯著的加快，明顯縮短創(chuàng)面修復(fù)所需時(shí)間［10-11］。

ERK 存在于諸多細(xì)胞中，具有穩(wěn)定性較強(qiáng)的特點(diǎn)。楊忠華［12］認(rèn)為電針也許通過激活RAS/RAF/MEK/ERK 信號(hào)通路發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)后，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖及分化的作用，由此保護(hù)了由于腦缺血致使的神經(jīng)血管損傷。研究表明，VEGF 在損傷出現(xiàn)以后立即增高，3 d 達(dá)高峰，隨后逐漸降低，對于這一現(xiàn)象考慮為自損傷出現(xiàn)至3 d 階段，機(jī)體通過基因調(diào)控方式加快血管新生，3 d 后，由于其自身修復(fù)能力迅速下降故導(dǎo)致VEGF 低表達(dá)［13］。邵妍等［14］通過構(gòu)建腦缺血-再灌注模型后，觀察眼針運(yùn)動(dòng)療法對腦缺血半暗帶區(qū)VEGF 的影響，分別以基因和蛋白水平測定作為檢測手段，發(fā)現(xiàn)正常組織中的VEGF表達(dá)不活躍，損傷出現(xiàn)后無論基因水平還是蛋白水平均呈過表達(dá)狀態(tài)，繼而加速側(cè)支循環(huán)的建立，充分發(fā)揮腦保護(hù)的功能。另有研究曾報(bào)道，VEGF 及其受體的表達(dá)含量與局部缺血及缺氧的環(huán)境存在密切關(guān)系，后者會(huì)一定程度促進(jìn)前者的表達(dá)，繼而加速新生血管的形成［15］。根據(jù)上述研究結(jié)果可以推斷，VEGF、VEGFR2 的表達(dá)狀況可能與RAS/RAF/MEK/ERK 信號(hào)通路的啟動(dòng)及激活存在密切的關(guān)聯(lián)。

本研究結(jié)果顯示，VEGF 蛋白在正常皮膚組織中呈弱陽性表達(dá)，當(dāng)壓力性損傷出現(xiàn)后，其在創(chuàng)面組織中的表達(dá)呈先高后低趨勢，其陽性表達(dá)部位在胞質(zhì)中，表達(dá)于巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞中。與空白組相比，模型組創(chuàng)面組織中VEGF 蛋白表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著升高。第1、3、5、7、10 天模型組壓力性損傷創(chuàng)面組織中VEGF 表達(dá)水平高于空白組，第3、5 天艾灸組壓力性損傷創(chuàng)面組織中VEGF 表達(dá)水平高于模型組。與正常組織相比，當(dāng)壓力性損傷出現(xiàn)后，其創(chuàng)面組織中RAS 蛋白表達(dá)先低后高的趨勢，其陽性表達(dá)部位在胞質(zhì)中。與空白組相比，模型組創(chuàng)面組織中RAS 蛋白表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著下降，兩組組內(nèi)（即艾灸組和模型組）RAS 蛋白均呈逐漸增高的趨勢。第1、3、5、7、10 天模型組壓力性損傷創(chuàng)面組織中RAS 表達(dá)水平低于空白組，第3、5、7、10 天艾灸組壓力性損傷創(chuàng)面組織中RAS 表達(dá)水平高于模型組。當(dāng)壓力性損傷出現(xiàn)后，創(chuàng)面組織中P-ERK1/2 蛋白表達(dá)較正常皮膚組織呈先高后低趨勢，其陽性表達(dá)部位在胞質(zhì)中，兩組組內(nèi)（艾灸組和模型組）P-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平均呈先高后低趨勢，但在表達(dá)峰值方面確有區(qū)別，前者峰值在治療3 d 后，而后者峰值卻在碘伏處理5 d 后。第3、5、7、10 天，模型組壓力性損傷創(chuàng)面組織中P-ERK1/2 表達(dá)水平高于空白組，第3、5 天艾灸組壓力性損傷創(chuàng)面組織中P-ERK1/2 表達(dá)水平明顯高于模型組。

以上結(jié)果表明，壓力性損傷出現(xiàn)后，創(chuàng)面組織中VEGF表達(dá)水平較正常組織呈高表達(dá)狀態(tài)，考慮其屬應(yīng)激性增高狀態(tài)，原因可能為損傷出現(xiàn)后創(chuàng)面局部處于缺血缺氧環(huán)境狀態(tài)，致使VEGF 蛋白應(yīng)激性升高，繼而促進(jìn)血管新生，用以滿足對損傷部位的血供，但是隨著上述創(chuàng)面局部缺血缺氧狀態(tài)的改善，其創(chuàng)面自身修復(fù)的存在，肉芽組織隨之呈逐漸增多趨勢，繼而VEGF 表達(dá)呈下降趨勢。由此可以推斷，當(dāng)壓力性損傷形成后，局部組織能夠形成一種自身對外界的保護(hù)（即其能夠通過促使VEGF 的分泌，使其成為高表達(dá)狀態(tài)）。如若上述保護(hù)機(jī)制能夠通過一種干預(yù)手段得到有效的延伸，換言之，尋求一種治療手段能夠促進(jìn)壓力性損傷創(chuàng)面組織VEGF 的表達(dá)和釋放，就能夠一定程度上緩解缺血-再灌注的進(jìn)展，從而加速新生血管的生成，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合及修復(fù)。本研究結(jié)果恰揭示，艾灸干預(yù)能夠分別從VEGF 表達(dá)水平及其表達(dá)時(shí)限兩個(gè)方面兼具優(yōu)勢，即促進(jìn)創(chuàng)面組織VEGF 表達(dá)水平的同時(shí)又提前其高峰值的表達(dá)時(shí)限，繼而從整體上加速創(chuàng)面修復(fù)進(jìn)程，縮短壓力性損傷修復(fù)的所需時(shí)間，最終達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的目的。壓力性損傷形成后，創(chuàng)面組織中RAS 表達(dá)水平驟降，其在經(jīng)過艾灸干預(yù)后發(fā)生顯著變化而明顯增加。RAS表達(dá)水平呈現(xiàn)的遞增趨勢說明RAS/RAF/ERK 信號(hào)通路可能參與了組織損傷的修復(fù)，艾灸干預(yù)促進(jìn)壓力性損傷創(chuàng)面組織VEGF 的釋放后，呈瀑布式狀態(tài)啟動(dòng)RAS/RAF/ERK 信號(hào)通路，并且對于這一通路中上游蛋白酶的激活需要刺激量的不斷積累，當(dāng)達(dá)到累積刺激閾值后方可激活相關(guān)的信號(hào)分子，因此艾灸干預(yù)可能通過激活RAS 蛋白啟動(dòng)上述信號(hào)通路。當(dāng)壓力性損傷出現(xiàn)后，P-ERK1/2 表達(dá)水平呈先高后低的趨勢，模型組高峰值出現(xiàn)于碘伏處理5 d 后，而艾灸干預(yù)后將其表達(dá)高峰提前為治療3 d 后。另外，艾灸干預(yù)在活性方面（即活化狀態(tài)）促進(jìn)ERK1/2 的磷酸化表達(dá)水平。由此推斷，艾灸干預(yù)促進(jìn)壓力性損傷創(chuàng)面VEGF 的釋放后，可能通過刺激量的累積閾值啟動(dòng)RAS/RAF/ERK 信號(hào)通路中的上游蛋白酶，并能夠磷酸化通路中的下游蛋白ERK1/2，激活這一通路，將信號(hào)由細(xì)胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)調(diào)控細(xì)胞的增殖與遷移。鑒于免疫組化對于目的蛋白的檢測手段在定量分析方面不夠精準(zhǔn)，尚屬半定量分析，本課題組后續(xù)的研究中將著力于通過Western Blot法對靶蛋白進(jìn)行定量分析，旨在最大程度上客觀、精準(zhǔn)地探討艾灸促進(jìn)壓力性損傷組織血管新生的分子調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，艾灸干預(yù)從蛋白層面上調(diào)壓力性損傷創(chuàng)面組織中VEGF 表達(dá)水平，其可能通過激活RAS/RAF/ERK 信號(hào)通路，上調(diào)RAS 蛋白表達(dá)水平、促進(jìn)ERK1/2 蛋白的磷酸化水平，增強(qiáng)RAS/RAF/ERK 信號(hào)通路的活性，發(fā)揮促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。

作者貢獻(xiàn)：于杰進(jìn)行研究設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負(fù)責(zé)；李洪玲進(jìn)行研究實(shí)施、評估、資料收集；于杰、趙惠進(jìn)行論文的修訂、英文的修訂；孫忠人進(jìn)行質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。