原發(fā)性胰腺癌的免疫表型研究

邱春燕 鄭楷煉 張火俊

1海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院放療科，上海 200433；2海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院普外科，上海 200433

胰腺癌具有高度侵襲性，發(fā)病率為4.2/10萬，約60%的患者確診時已遠處轉(zhuǎn)移，5年生存率低, 中位生存時間僅為6～9個月[1-2]。雖然根治性手術(shù)是治愈胰腺癌的唯一機會，多項研究表明，化療和放療相結(jié)合可以最大限度地提高患者的生存率，并顯著緩解腹痛等臨床癥狀[3]。隨著細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4)及程序性死亡受體1及其配體(programmed death 1/programmed death-ligand 1, PD-1/PD-L1)免疫檢查點抑制劑如伊匹單抗、納武單抗、派姆單抗等在黑色素瘤、非小細胞肺癌和腎細胞癌的治療研究中顯示出較好的效果[4-6]，具有潛在治療價值的免疫檢查點分子也被逐步開發(fā)，其中包括13個免疫共刺激分子[7-12]及10個免疫共抑制分子[13-16])，這些分子大多尚處于臨床試驗階段[17]，因此對胰腺癌免疫微環(huán)境的全面分析以及分型可能為未來的免疫治療提供一定的生物學(xué)依據(jù)。enbabaoglu等[18]利用已發(fā)表的特征基因的表達水平來量化腫瘤內(nèi)24種免疫細胞類型的相對浸潤水平，并由MHC-I類基因(HLA-A/B/C、B2M)和參與抗原加工處理的基因(TAP1、TAP2和TAPBP)組成抗原呈遞體系(antigen presenting machinery, APM)評分，以及總體免疫浸潤評分(immune infiltration score, IIS，包括先天性和適應(yīng)性免疫細胞的浸潤評分)、T細胞浸潤評分(T cell infiltration score, TIS，包括CD8+T細胞、Th1、Th2、Th17、Treg、效應(yīng)性記憶T細胞、中樞性記憶T細胞、T輔助細胞和T細胞等9種T細胞的總體評分)。Yu和Wang[19]利用IIS、TIS和APM評分對肺腺癌、肺鱗癌轉(zhuǎn)錄組表達水平進行聚類分析而實現(xiàn)對肺癌的免疫分型。本研究首次利用IIS、TIS和APM評分聚類分析胰腺癌免疫表型，以期為胰腺癌治療提供生物學(xué)依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料與分組

納入癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫中的177例原發(fā)性胰腺癌患者的臨床資料。llumina HiSeq 2000平臺保留的標(biāo)準(zhǔn)化3級RNA測序數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)從https://cancergenome.nih.gov獲得。使用版本3.3.2的R軟件(http://www.r-project.org)合并數(shù)據(jù)，利用edgeR包對RNA表達數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化以用于后續(xù)分析。

二、免疫細胞亞型浸潤分析

基于去卷積的原理，利用算法CIBERSORT對樣品中22種腫瘤浸潤性免疫細胞亞群的相對純度進行計算[21-22]。這22種腫瘤浸潤性免疫細胞亞群包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、活化型肥大細胞、休眠型肥大細胞、活化型樹突狀細胞、休眠型樹突狀細胞、M2型巨噬細胞、M1型巨噬細胞、M0型巨噬細胞、單核細胞、活化型NK細胞、休眠型NK細胞、γδT淋巴細胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Tregs)、輔助性濾泡T淋巴細胞、活化型CD4+記憶T淋巴細胞、休眠型CD4+記憶T淋巴細胞、幼稚型CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、漿細胞、記憶型B淋巴細胞、幼稚型B淋巴細胞。

三、免疫檢查點分子的表達分析

統(tǒng)計TCGA數(shù)據(jù)庫兩組患者共刺激分子CD28、ICOSL、ICOS、CD40L、CD40、CD27L、CD27、4-1BBL、4-1BB、OX40L、OX40、GITRL、GITR及共抑制分子CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD-1、VISTA、LAG-3、TIGIT、Galectin-9、 TIM-3、IDO-1 的log2轉(zhuǎn)化后表達水平，并進行Wilcoxon檢驗。

四、免疫功能的評價

運用Rooney等[23]的方法，使用細胞殺傷活性(cytolytic activity, CYT)對腫瘤中免疫細胞的CYT進行量化，CYT值為穿孔素1和顆粒酶A表達量的幾何平均值。利用12種趨化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL18、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL13表達譜檢測腫瘤內(nèi)部的淋巴細胞聚集狀態(tài)，并作為免疫激活的標(biāo)志物。參考Strom等[24]的方法對12種趨化因子表達值進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，所得的PC1值作為抗腫瘤免疫激活水平的度量。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者的臨床病理特征

TCGA數(shù)據(jù)庫的177例胰腺癌患者中男性97例(54.8%)，女性80例(45.2%)，白人、黑人、亞裔分別為156例(88.1%)、6例(3.4%)、11例(6.2%)，平均年齡(64±11)歲。57.0%患者有飲酒史，72.3%無慢性胰腺炎病史，61.0%無糖尿病史。78.0%患者的腫瘤位于胰頭部，82.5%為導(dǎo)管腺癌，59.3%切緣陰性，93.8%臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期，53.2%病理分級為G2級，腫瘤最大直徑為(3.86±1.65)cm，平均陽性淋巴結(jié)數(shù)為(2.91±3.32)個。76.3%采用Whipple術(shù)式，63.8%行術(shù)后化療，50.3%行靶向治療，18.1%行術(shù)后放療。

二、免疫成分高組及低組患者的免疫細胞亞型浸潤分析

無監(jiān)督聚類分析對177例樣本的IIS、TIS、APM評分的ssGSEA分析值顯示兩個主要簇，一個簇(86例)顯示出更高的IIS、TIS、APM評分，為免疫成分高組(immune high)，另一簇(91例)IIS、TIS、APM評分較低，為免疫成分低組(immune low，圖1A)。放療人群中免疫成分高組生存率略高于免疫成分低組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.11，圖1 B)。

CIBERSORT評估22種免疫細胞的相對浸潤程度結(jié)果顯示，所有177例樣本中休眠型CD4+記憶T淋巴細胞、M2型巨噬細胞、M0型巨噬細胞、幼稚型B淋巴細胞和休眠型肥大細胞的相對浸潤比例均最高(圖1C)。與免疫成分低組比較，免疫成分高組有明顯較多的中性粒細胞(63.4%比36.6%)、嗜酸性粒細胞(75.5%比24.5%)、活化型CD4+記憶T淋巴細胞(80.7%比19.3%)、幼稚型CD4+T淋巴細胞(81.2%比18.8%)以及幼稚型B淋巴細胞(59.5%比40.5%)；而免疫成分低組有明顯較多浸潤的活化型NK細胞(67.3%比32.7%)、調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(68.9%比31.1%)、輔助性濾泡T淋巴細胞(67.7%比32.3%)以及活化型肥大細胞(62.9%比37.1%，圖1D)。其他免疫細胞亞型，包括休眠型肥大細胞、活化型樹突狀細胞、休眠型樹突狀細胞、M2型巨噬細胞、M1型巨噬細胞、M0型巨噬細胞、單核細胞、休眠型NK細胞、γδT淋巴細胞、休眠型CD4+記憶T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、漿細胞、記憶型B淋巴細胞在兩組的相對浸潤程度較為一致。

三、免疫成分高組與低組的免疫檢查點分子表達

與免疫成分高組比較，免疫成分低組的共刺激分子CD28、ICOS、CD40、CD40L、CD27、CD27L、4-1BB、OX40、GITR以及共抑制分子CTLA-4、PD-L2、PD-1、VISTA、LAG-3、TIGIT、Galectin-9、TIM-3、IDO-1顯著高表達，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05，圖2)。而共刺激分子ICOSL、4-1BBL、OX40L、GITRL以及共抑制分子PD-L1在兩組中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

四、免疫成分高組與低組的免疫功能評價

免疫成分高組的12種趨化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL18、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL13的PC1值顯著高于免疫成分低組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001)；免疫成分高組的CYT值也顯著高于免疫成分低組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖3)。

圖1 免疫細胞浸潤分析的IIS、TIS、APM評分的無監(jiān)督聚類分析(圖1A)；放療患者中免疫成分高組與低組患者的生存曲線及l(fā)og-rank檢驗(圖1B)；22種免疫細胞相對浸潤程度的累積條形圖(圖1C)；免疫成分高組與低組的免疫細胞浸潤比較(圖1D)

圖2 免疫成分高組及低組的免疫檢查點共刺激分子(2A)和共抑制分子(2B)的表達

圖3 免疫成分高組及低組的免疫活性趨化因子PCA的PC1值(3A)和CYT(3B)

討 論

有研究闡明，活化型CD4+記憶T淋巴細胞[25]、活化型NK細胞[26]在抗腫瘤免疫中有正向調(diào)節(jié)作用，而調(diào)節(jié)性T淋巴細胞[27]、活化型肥大細胞[28]在抗腫瘤免疫中有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，推測這些不同功能的免疫細胞亞型浸潤程度的差異或多或少引起不同免疫表型的功能差異。事實上，前期研究已發(fā)現(xiàn)具有Th1表型和細胞毒性模式的記憶T細胞的強烈浸潤是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的最強預(yù)測因子，這一現(xiàn)象在腫瘤內(nèi)趨化因子能形成有效免疫反應(yīng)的結(jié)直腸癌中得到驗證[29]。本研究納入的177例TCGA數(shù)據(jù)庫的胰腺癌樣本，按照IIS、TIS和APM評分的ssGSEA分析值進行無監(jiān)督聚類分析，主要區(qū)分出免疫成分高組和免疫成分低組兩簇。這兩組中的休眠型CD4+記憶T淋巴細胞、M2型巨噬細胞、M0型巨噬細胞、幼稚型B淋巴細胞和休眠型肥大細胞的相對浸潤比例均最高。免疫成分高組的中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、活化型CD4+記憶T淋巴細胞、幼稚型CD4+T淋巴細胞以及幼稚型B淋巴細胞的浸潤程度顯著高于免疫成分低組，而免疫成分低組的活化型NK細胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細胞、輔助性濾泡T淋巴細胞以及活化型肥大細胞的浸潤程度顯著高于免疫成分高組。其中的潛在關(guān)聯(lián)尚需更多的體內(nèi)外實驗研究。

目前腫瘤樣本上的免疫組織化學(xué)檢測PD-L1表達水平仍是用于篩選可能對治療有反應(yīng)的患者最常用的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，大部分共刺激分子以及共抑制分子均在免疫成分低組顯著高表達，提示免疫檢查點阻斷劑治療可能對該組人群有效[30]。另外，這種共刺激與共抑制分子的協(xié)同表達驗證了先前報道的多個免疫檢查點分子在T細胞上共表達的結(jié)果，為免疫檢查點抑制劑或激活劑組合策略的運用提供一定生物學(xué)依據(jù)[31]。

Rooney等[23]首次對腫瘤中的免疫細胞CYT進行量化，指出CYT值為穿孔素1和顆粒酶A表達量的幾何平均值。穿孔素1和顆粒酶A由細胞毒性淋巴細胞分泌的毒素并行使效應(yīng)功能，不同于諸如PD-L1等基于腫瘤浸潤性淋巴細胞的浸潤及表達標(biāo)記，因此CYT值是評價腫瘤浸潤免疫細胞功能的指標(biāo)。研究表明CYT在治療反應(yīng)和腫瘤進展的免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。在使用CTLA-4抗體治療的黑素瘤患者的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤的CYT與腫瘤中的CD8+T細胞浸潤程度以及參與MHC I類抗原加工、呈遞途徑的基因表達密切相關(guān)[32]。

12種趨化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL18、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL13基因是從一系列免疫、炎癥相關(guān)的基因中篩選而出[33]，與結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中腫瘤局部異位淋巴結(jié)的存在相關(guān)，并與患者的生存期改善有關(guān)[34]。本研究結(jié)果顯示，免疫成分高組的趨化因子表達水平PCA的PC1值以及CYT值均顯著高于免疫成分低組，反映了免疫成分高組具有更高的免疫激活水平及免疫細胞毒性。這個現(xiàn)象與免疫成分高組具有較高的總體IIS、TIS和APM評分一致，與前述大部分共刺激與共抑制分子在免疫成分低組協(xié)同高表達的結(jié)果相結(jié)合，說明共刺激與共抑制分子雖然協(xié)同表達，但共抑制分子在免疫調(diào)節(jié)中起到?jīng)Q定性作用[35]。

本研究結(jié)果還顯示，放療人群中的免疫成分高組患者的生存率略高于免疫成分低組，雖然無統(tǒng)計學(xué)差異，但反映了免疫成分高組可能與放療具有協(xié)同作用[36]。因此免疫成分高組人群中行放療可能使該人群獲益，但這一結(jié)果尚需要在更大樣本人群中進一步驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突