連艾煎的體外抗氧化活性研究

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1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院/廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006； 2.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632；3.廣州暨南生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地有限公司，廣東 廣州 510632

連艾煎方出《松峰說疫》卷二，其配方為黃連與艾葉，具有調(diào)中下氣，清腸開噤之功效，主治瘟疫噤口下痢者[1]。黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連CoptisdeltoideaC. Y. Cheng et Hsiao或云連CoptisteetaWall.的干燥根莖。以上三種分別習(xí)稱“味連”、“雅連”、“云連”。秋季采挖，除去須根和泥沙，干燥，撞去殘留須根。味苦，寒。歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)[2]。艾葉為菊科植物艾ArtemisiaargyiLevLet Vant.的干燥葉。夏季花未開時采摘，除去雜質(zhì)，曬干。艾葉氣清香，味苦，艾葉味辛、苦，溫；有小毒。歸肝、脾、腎經(jīng)[2]。黃連與艾葉皆為常用中藥，針對黃連或艾葉單方已有大量現(xiàn)代研究[3-9]。近年來，有關(guān)中藥復(fù)方的抗氧化研究備受廣泛關(guān)注，然而連艾煎作為一種傳統(tǒng)中藥復(fù)方，但在維普、CNKI或Pubmed等中內(nèi)外各文獻(xiàn)庫皆沒檢索出對連艾煎有任何現(xiàn)代研究，也沒有對其抗氧化能力或藥理作用的研究，本實驗開展連艾煎的體外抗氧化活性研究，為連艾煎的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；紫外分光光度計(島津公司)；熒光顯微鏡(尼康公司)；電熱爐(廣州粵城電器廠)；循環(huán)真空泵(河南省予華儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(海道夫公司)，移液槍(艾本德公司)。

1.2 材料 黃連(產(chǎn)地：四川，批號：180801)、艾葉(產(chǎn)地：汕頭，批號：20180901)，均購于大參林廣州心誼路店，經(jīng)廣東藥科大學(xué)王治平副研究員鑒定確定為毛茛科、黃連屬黃連CoptischinensisFranch.及菊科植物艾ArtemisiaargyiLevLet Vant.；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(規(guī)格1 g，純度96%，批號：W26F7E10072，源葉生物公司)；2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABT，批號E1506006，規(guī)格1 g，純度98%，美國Aladdin公司)；維生素C(規(guī)格100 g，純度99.7%，批號20130315，%國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；過硫酸鉀(規(guī)格500 g，純度99.5%，批號P112191，美國Aladdin公司)；NAC(規(guī)格25 g，純度99%，批號A105420，美國Aladdin公司)；95%乙醇購自廣州化學(xué)試劑廠；ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2方法

2.1 連艾煎的制備 連艾煎由黃連6 g，熟艾3 g組成。按處方取藥材，溫水浸泡30 min，加水100 mL，煎煮提取3次，每次60 min，過濾，合并濾液，濃縮至每1 mL藥液含生藥66 mg，即得。

2.2 溶液 配制61.8 μg/mL DPPH工作液：稱取6.18 mg DPPH粉末，用無水乙醇溶解并定容至100 mL。ABTS+自由基儲備液：稱取9.67 mg ABTS 和64.26mg過硫酸鉀于10 mL 的棕色瓶中，加蒸餾水定容至刻度線，避光靜置過夜。

其中，A0為空白吸光度，A1為樣品自身對照吸光度，A2為樣品吸光度。

2.4 連艾煎對ABTS自由基的清除能力 根據(jù)文獻(xiàn)方法進(jìn)行ABTS自由基清除能力測定[14-15]。ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS·+，在抗氧化物存在時ABTS·+的產(chǎn)生會被抑制，在734 nm或405 nm測定ABTS的吸光度即可測定并計算出樣品的總抗氧化能力。實驗時，用80%乙醇將ABTS+儲備液稀釋成所需工作液，使其在室溫下于734 nm 處測得的吸光度在0.700 ± 0.020。取3.00 mL 新配制的濃度為ABTS+工作液置于10 mL具塞比色管中，使用移液槍分別加入6.06、12.12、18.18、24.24、30.30及36.36 μL的樣品溶液，蒸餾水補(bǔ)充至4.00 mL，混勻后室溫下避光反應(yīng)30 min，在734 nm處測定其吸光度A2。另外再取3.00 mL 95%乙醇置于10 mL具塞比色管中，然后分別加入與樣品管加入量相同體積的樣品溶液，蒸餾水補(bǔ)充至4.00 mL，混勻后室溫下避光反應(yīng)30 min，在734 nm 處測定其吸光度A1，重復(fù)實驗3次。清除率計算公式：

其中，A0為空白吸光度，A1為樣品自身對照吸光度，A2為樣品吸光度。

2.5 連艾煎對細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇(ROS)水平的影響 ROS水平檢測實驗根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]，使用ROS檢測試劑盒進(jìn)行。DCFH-DA探針法是一種利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行ROS檢測的方法，DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。取處于對數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞(2×107個)接種于6孔板，分為空白組、ROS陽性對照組(Rosup，ROS檢測試劑盒提供，50 mg/L)、LPS組(100 μg/L)、LPS+ROS抑制劑(NAC，1.0 g/L)組、LPS+連艾煎組(1.5 g/L)、連艾煎自身對照組(1.5 g/L)。除ROS陽性對照組外，分別以相應(yīng)藥物刺激細(xì)胞24 h，ROS陽性對照組刺激2 h。在超凈工作臺中避光下，DCFH-DA探針(ROS檢測試劑盒提供)用無血清培養(yǎng)基稀釋，使DCFH-DA終濃度為4.9 mg/L，每孔加入1 mL的DCFH-DA探針，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育細(xì)胞1 h，使用無血清培養(yǎng)基在超凈工作臺中避光清洗3次，以充分去除未結(jié)合的游離的DCFH-DA探針；在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度的變化，激發(fā)波長488 nm，檢測波長525 nm，并對其進(jìn)行拍照(200×)記錄(激發(fā)時間10 s，曝光時間1 s)。同時，使用ImageJ圖像處理軟件對ROS熒光強(qiáng)度進(jìn)行灰度分析，隨機(jī)選取十個視野，獲取平均光密度，根據(jù)光密度對各組ROS進(jìn)行相對定量。

3 結(jié)果

3.1 連艾煎清除DPPH自由基試驗 如表1所示，在一定的濃度范圍內(nèi)，連艾煎對DPPH自由基具有一定的清除能力，隨著濃度的增加，對DPPH自由基的清除率也逐步增加。連艾煎清除DPPH自由基的IC50為(2391.21±41.85)mg/L，陽性藥物維生素C清除DPPH自由基的IC50為(0.73±0.02)mg/L，兩者之間的差異非常顯著(P< 0.01)。

表1 連艾煎的DPPH自由基清除活性

3.2 連艾煎清除ABTS自由基試驗 在一定的濃度范圍內(nèi)，連艾煎對ABTS自由基具有一定的清除能力，隨著濃度的增加，對ABTS自由基的清除率也逐步增加。連艾煎清除ABTS自由基的IC50為(240.96±4.66)mg/L，陽性藥物維生素C清除ABTS自由基的IC50為(1.14±0.04)mg/L，兩者之間的差異非常顯著(P<0.01)，結(jié)果見表2。

表2 連艾煎的ABTS自由基清除活性

3.3 連艾煎對RAW264.7細(xì)胞ROS水平的影響試驗 如圖1所示，空白組的細(xì)胞沒有檢測出ROS熒光，LPS組和ROS陽性組都檢測出明顯的ROS亮斑，而ROS抑制劑NAC則抑制了LPS引起的ROS升高。從圖1.e可以看出，連艾煎沒有抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的ROS產(chǎn)生，反而增加了其生成，在LPS+連艾煎(1.5 g/L)的ROS熒光比之前4組都要高。從圖1.f可以看出，單用連艾煎刺激RAW264.7細(xì)胞也產(chǎn)生了類似的結(jié)果。使用ImageJ軟件對ROS熒光進(jìn)行灰度分析(圖2)，可知Rosup組和LPS組的ROS熒光都比空白組高，且差異非常顯著(P< 0.01)，LPS+連艾煎組ROS熒光比LPS組高，且差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)，而連艾煎自身對照組ROS熒光則比空白組和LPS組都要高，且差異顯著(P< 0.05)，說明連艾煎自身可以引起細(xì)胞ROS升高。

4 討論

4.1 連艾煎方 出《松峰說疫》卷二，其處方包括黃連及艾葉，具有調(diào)中下氣，清腸開噤之功效，主治噤口痢，下痢赤白，腹中疼痛，里急后重，得食則吐者[1,17]。推測其解腸胃熱毒功能可能與其抗氧化能力有關(guān)，故對其抗氧化能力作初步測試[18]。連艾煎體外抗氧化實驗研究表明，連艾煎對DPPH及ABTS自由基具有一定的清除作用，雖然清除活性不如維生素C，但在一定范圍內(nèi)其抗氧化作用與濃度也能呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。為了進(jìn)一步探究連艾煎的抗氧化能力，我們使用了RAW264.7細(xì)胞模型檢測連艾煎對細(xì)胞ROS的影響。在細(xì)胞ROS實驗中，可以明顯看出ROS陽性對照(Rosup)、LPS都對細(xì)胞ROS熒光有顯著升高作用(P< 0.01)，同時，ROS抑制劑NAC顯著抑制了LPS引起的ROS升高(P< 0.01)，說明細(xì)胞ROS模型成功建立。LPS+連艾煎組顯示出比LPS組更強(qiáng)的熒光(P< 0.01)，說明連艾煎并不會抑制LPS引起的ROS升高，而相比空白組，連艾煎自身對照組顯著地增強(qiáng)了細(xì)胞ROS熒光(P< 0.01)，說明連艾煎自身會對細(xì)胞ROS產(chǎn)生有促進(jìn)作用。與普通的抗氧化劑不同的是連艾煎在理化實驗中顯示出較強(qiáng)抗氧化活性，而在細(xì)胞實驗中則可以升高ROS水平，這個現(xiàn)象是值得深入研究的。

研究表明ROS與很多病理過程具有密切聯(lián)系，尤其是腫瘤[19-20]。Gorrini等發(fā)現(xiàn)胰島素升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，后者進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[21]。Helfinger等研究顯示，高濃度的ROS可導(dǎo)致DNA損傷和突變，引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，ROS介導(dǎo)的PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過度激活利于腫瘤細(xì)胞存活以及促進(jìn)化療耐藥[23-24]。因此，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為體內(nèi)ROS升高可促進(jìn)腫瘤形成、侵襲和轉(zhuǎn)移，并基于此尋找具有強(qiáng)抗氧化活性的天然產(chǎn)物作為開發(fā)抗腫瘤藥物的新方向[25]。

然而，ROS在癌癥中的作用仍存在爭議，最新的觀點認(rèn)為機(jī)體低水平的ROS能夠增加癌癥風(fēng)險，升高ROS反而利于癌癥治療。哥德堡大學(xué)的一項研究指出抗氧化劑NAC和維生素E分別使肺癌小鼠的最大存活率降低了60%和50%[26-29]。此外，Lee等發(fā)現(xiàn)放射治療使機(jī)體產(chǎn)生ROS能引起DNA損傷，從而破壞癌細(xì)胞[30]。Zhen和Hu等研究顯示，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，ROS水平升高會導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞對電離輻射的抗性降低，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞對放射治療的敏感性[31-32]。普通抗氧化劑有效地減少ROS的生成，從而使癌細(xì)胞的生長不受干擾，詹姆斯沃森(James Dewey Watson)甚至認(rèn)為，抗氧化劑不但無助于預(yù)防癌癥，還可能引發(fā)癌癥[33-34]。

綜上所述，關(guān)于ROS在癌癥中的作用的研究日益增多，但學(xué)術(shù)界對ROS是致癌還是抗癌目前尚未有統(tǒng)一的觀點，ROS作為腫瘤促進(jìn)劑或抑制劑的作用都有大量證據(jù)支持，這種悖論被解釋為適應(yīng)性穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞內(nèi)存在一種平衡，可能引起細(xì)胞損傷的活性物質(zhì)也能激活保護(hù)細(xì)胞的生物途徑，這種平衡取決于活性物質(zhì)的濃度[35-36]。

氧化應(yīng)激促進(jìn)癌癥發(fā)展和殺傷癌細(xì)胞的作用為兩種相反的癌癥治療策略提供了不同的理論基礎(chǔ)。一種方法是使用抗氧化劑提高ROS清除能力，從而消除ROS信號并抑制腫瘤生長，另一種相反的方法是用具有促氧化劑殺傷癌細(xì)胞，促氧化劑可增加ROS生成或消除癌細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)[37]。連艾煎的抗氧化活性實驗顯示出連艾煎具有較強(qiáng)的抗氧化活性，同時可以升高細(xì)胞ROS水平。通過對連艾煎抗氧化活性的研究，在一定程度上預(yù)示連艾煎可能因為升高ROS帶來健康風(fēng)險，也可能成為一種避免細(xì)胞ROS減少而導(dǎo)致癌癥風(fēng)險增加，甚至可以通過引起ROS升高而增加癌細(xì)胞對放射治療敏感度的抗氧化劑。連艾煎對腫瘤到底起到何種作用值得進(jìn)一步研究。