新生抗原在腫瘤免疫治療中的應用進展

李建民 李常穎

天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院，天津市泌尿外科基礎醫(yī)學重點實驗室（天津300211）

腫瘤細胞在基因變異的基礎上產生的帶有特異性氨基酸序列蛋白被稱為“新生抗原（neoantigen）”。只有發(fā)生突變進而導致氨基酸序列的改變，才會使這些蛋白產生抗原性。如果發(fā)生序列改變，這些蛋白會引起自身免疫系統(tǒng)的警惕，進而引起一系列免疫應答。因此，這些可作用于免疫系統(tǒng)，由腫瘤細胞基因突變產生的異常蛋白，即稱為新生抗原。針對腫瘤治療而言，從手術切除、化療、放療到如今的靶向治療，治療手段層出不窮。近年來，腫瘤免疫治療在個體化腫瘤治療中的潛在優(yōu)勢引起廣泛的關注。有研究者預測，所有的腫瘤都有一定數(shù)量的新生抗原，這一數(shù)量與基因突變的數(shù)量呈正相關。新生抗原在腫瘤免疫治療領域中所具有的價值正受到越來越多的關注。本文即對新生抗原及其在腫瘤免疫治療中的作用進行綜述。

1 新生抗原——開啟腫瘤免疫治療的新篇章

人體免疫系統(tǒng)具有免疫檢測功能，能夠有效識別體內產生的腫瘤細胞并將其清除。同時，通過激活機體特異性的免疫應答，抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。部分腫瘤細胞往往能夠通過多種機制逃避免疫系統(tǒng)的識別和清除，幸存下來并在機體內繼續(xù)增殖，最終導致腫瘤的發(fā)生。

腫瘤免疫治療即通過重啟機體自身的免疫識別功能，增強機體正常的抗腫瘤免疫應答，從而有效控制腫瘤生長，進而清除腫瘤的一種治療方法。一般來說，腫瘤免疫治療分為被動免疫療法和主動免疫療法，主要包括基于單克隆抗體藥物的治療性抗體，特異性單克隆抗體類免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor）、小分子抑制劑、免疫系統(tǒng)調節(jié)劑、癌癥疫苗和免疫細胞療法等。迄今為止，F(xiàn)DA 已經批準多個腫瘤免疫治療的藥物應用于肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等病癥的治療研究，臨床效果表現(xiàn)良好。隨著基于治療性單克隆抗體藥物的被動免疫療法在臨床中的大量開展，一些耐藥性、過敏反應以及預后的癌癥高復發(fā)率引起的副作用逐漸被研究者發(fā)現(xiàn)，使得科學家們不得不進一步尋求新的治療手段。因此，基于腫瘤疫苗的主動免疫療法被認為是一個有潛力的替代療法而被人們所熟知。腫瘤疫苗的設計原理是將腫瘤抗原以多種形式如：腫瘤細胞、腫瘤相關蛋白或多肽、表達腫瘤抗原的基因等，導入患者體內，抵抗腫瘤引起的免疫抑制狀態(tài)，增強免疫原性，激活患者自身的免疫系統(tǒng)，誘導機體細胞免疫和體液免疫應答，從而達到控制或清除腫瘤的目的。

設計腫瘤疫苗的最關鍵步驟是要找到正確的抗原。腫瘤抗原在傳統(tǒng)上分為兩大類。一類是“腫瘤相關抗原”（tumor associated antigen）；一類是“腫瘤特異性抗原”（tumor specific antigen，TSA）［1］?！澳[瘤相關抗原”是一類同時表達在腫瘤細胞和正常細胞表面的抗原。由于生長的需要，腫瘤細胞可能會在其表面過度表達某些抗原，這種表達水平的差異就給了患者一定的“治療空間”。因此通過識別并攻擊這類抗原也可以達到“多殺敵，少傷己”的效果。而“腫瘤特異性抗原”顧名思義是正常細胞不存在的，腫瘤細胞特有的一些抗原，通過免疫應答可以準確地殺傷腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細胞而不會產生誤傷正常細胞的副作用。因此，這類抗原應該是腫瘤免疫治療最理想的靶點。

癌細胞在快速生長和增殖過程中，往往因為來不及修復DNA 在復制過程中出現(xiàn)的錯誤而出現(xiàn)新的突變蛋白，這種帶有特異性氨基酸序列變異的多肽序列被稱為“新生抗原”。新生抗原，是一種位于惡性腫瘤細胞表面主要組織相容性復合物的抗原表位肽。不同于人類正常細胞表面的主要組織相容性抗原（human leukocyte antigen，HLA），這些新生抗原是癌細胞特有的，具有腫瘤特異性，可以被T 細胞識別并引發(fā)免疫應答?；诖蠖鄶?shù)腫瘤患者的臨床數(shù)據(jù)分析顯示，內源性T 細胞能夠有效識別惡性腫瘤細胞表面的特異性抗原。依據(jù)腫瘤特異性抗原的產生來源，可以將其分為兩類。第一類是由非變異氨基酸組成的蛋白質或多肽序列，這些蛋白質或者多肽往往是T細胞不耐受的，第二類是在基因突變的基礎上產生的帶有特異性氨基酸序列變異的蛋白或多肽序列，它對于正常組織的基因組來說是不存在的，因而會引起自身免疫細胞的識別，并引起一系列的免疫應答反應。所以，在大部分腫瘤患者中，這些新生抗原表位主要是由DNA 突變形成新的蛋白質或多肽序列所導致。因此，基于“新生抗原”的腫瘤疫苗是一種真正意義上的個體化疫苗，也是目前最有可能治愈癌癥的療法，是腫瘤精準免疫治療研究的一個重要方向。

2 腫瘤新生抗原的精準預測與篩選

新生抗原在腫瘤治療領域具有巨大價值，因此，其精準預測及篩選則顯得尤為重要。由于新生抗原主要源于腫瘤細胞自身的基因突變，鑒于基因突變的隨機性及特異性以及不同患者的腫瘤細胞突變情況的差異，由此產生的新生抗原也不一樣，主要由患者自身的DNA 決定的。為了篩選得到由DNA 突變誘導產生的特定性新生抗原，需要了解不同腫瘤患者的個體基因組。常用方法是采用DNA 深度測序技術，通過對患者腫瘤基因組編碼的蛋白序列識別從而找到相應的突變位點，進一步預測潛在的新生抗原。隨著新一代測序（next-generation sequencing，NGS）和生物信息學的發(fā)展，常用的新抗原鑒定篩選方法可分為三種不同的方法。

（1）通過WES（whole-exome sequencing）來識別腫瘤的特異性突變，并通過RNA 測序加以確認，然后基于預測的HLA 的親和力強度高低對其進行分類，最后基于優(yōu)先突變的等位基因合成新生多肽，然后離體進行T 細胞反應性分析以確認其的免疫原性。具體來說，設計成熟的基于新生多肽抗原疫苗的個性化免疫療法的第一步是識別腫瘤的特異性突變。與免疫識別相關的突變主要包括具有外顯子、插入和缺失非同義單核苷酸變體nsSNV（non-synonymous single nucleotide variants）和融合基因［2］。匹配的腫瘤細胞和正常細胞DNA的全外顯子組測序WES 代表了識別體細胞基因突變的最常用方法［3］。通過RNA 測序對所鑒定的突變等位基因的表達水平進行正交驗證和分析［4］。然后根據(jù)預測的與HLAⅠ型和Ⅱ型的高親和能力對突變進行分級。免疫表位數(shù)據(jù)庫和分析資源IEDB（immune epitope database and analysis resource）是一個在線綜合數(shù)據(jù)庫，由T 細胞表位和可用于預測MHC 結合親和力的工具組成。IEDB提供的預測工具包括ANN（人工神經網絡）∕NetMHC［5］、NetMHCpan［6］、SMM［7］、SMMPMBEC［8］、ARB和Consensus。最終還要使用T 細胞反應性分析來驗證合成的新生多肽的免疫原性，即通過產生抗原負載的抗原呈遞細胞來刺激T 細胞。然后必須檢測CD4+和CD8+T 細胞的活化標記物，包括離體的OX-40、4-1BB、CD170a和IFN-γ［9］。OTT等［10］利用這種策略得到了由四組合成的長肽構建的個體化疫苗，基于RNA 的多表位在高風險黑素瘤患者中誘導強烈的多功能CD4+和CD8+T 細胞應答。

（2）基于WES 識別的腫瘤特異性突變，合成TMG 構建體作為產生IVT RNA 的模板，然后離體進行T 細胞反應性分析以確認其免疫原性。具體的步驟如下所示：對第一種方法進行簡化，在nsSNV 的挖掘之后，串聯(lián)合成多個編碼突變的小基因以產生TMG（串聯(lián)小基因）構建體。TMG 構建體由可變數(shù)量的遺傳融合在一起的小基因組成，每個小基因編碼側翼為來自內源蛋白質序列的12 個氨基酸殘基的突變。編碼TMG 構建體的質粒用作模板以產生IVT（體外轉錄的）RNA。TRAN 等［11-12］從轉移性膽管癌患者中鑒定出ERBB2IP（erbb2 相互作用蛋白）突變。在過繼轉移含有約25%突變特異性T 細胞的TIL（腫瘤浸潤淋巴細胞）后，患者腫瘤消退。隨后研究中，相繼證明來自10 個轉移性胃腸癌患者中的9 個的新表位可被自體TIL 識別。

（3）在沒有樣本采集的情況下基于數(shù)據(jù)庫和文獻識別新表位。這一戰(zhàn)略的關鍵是存在于實體瘤中發(fā)現(xiàn)的高頻突變位點?；谶@種模式，SCHUMACHER 等［13］確定了彌漫性Ⅱ級和Ⅲ級膠質瘤患者中最常見的突變IDH1（R132H）。然后這些作者合成了一種靶向突變體IDH1 的肽疫苗，其功能是在小鼠中誘導抗腫瘤反應。同樣，OCHS 等［14］發(fā)現(xiàn)K27M-突變體組蛋白-3 作為產生神經膠質瘤疫苗的最佳靶標，證明靶向K27M-突變體組蛋白-3 的肽疫苗在MHC-人源化小鼠模型中引發(fā)突變特異性免疫應答。

除采用DNA 深度測序技術之外，目前還有一些其他方法也被用來篩選腫瘤新生抗原，如基于外周血單核細胞或腫瘤過濾淋巴細胞功能分析的新生抗原反應性T 細胞鑒定。它在識別已有的新生抗原反應性T 細胞的分析可能無法檢測到休眠的新生抗原，盡管這些新生抗原不會引發(fā)自然發(fā)生的免疫反應，但可能是重要的治療靶點。許多方法已被用于不同的癌癥疫苗的制備，如整個腫瘤細胞裂解液、核苷酸（mRNA∕DNA）、蛋白質或肽基疫苗、樹突狀細胞（DC）疫苗、病毒載體以及生物材料輔助疫苗。在以新抗原為基礎的癌癥疫苗中，通常使用mRNA∕DNA 或合成長肽。

3 新生抗原在腫瘤免疫治療中的應用價值

3.1 新生抗原疫苗具有抗腫瘤效果新生抗原由于其在免疫中扮演得角色，使其在腫瘤治療領域可能發(fā)揮巨大的作用。MANDELBOI 等［15-16］純化了一種衍生自與Lewis 肺癌細胞表面上的小鼠HLA 分子結合的突變跨膜蛋白（Connexin 37）的多肽序列。該研究表明，用代表突變的Connexin 37的合成肽進行免疫可誘導抗腫瘤CTLs 應答并保護小鼠免受自發(fā)性腫瘤轉移并減少轉移負荷。一系列開創(chuàng)性的小鼠和人類研究表明，具有錯義突變的多種其他基因產物可編碼同源細胞毒性T 淋巴細胞CTLs 識別的肽［17-22］。

LENNERZ 等［23］發(fā)現(xiàn)抗突變抗原的CTL 可以控制轉移性黑色素瘤。多個時間點的T 細胞反應的臨床分析表明，最主要和持久的反應靶向具有錯義突變新抗原的蛋白，并且針對過表達和選擇性表達的自身抗原的反應性較弱。通過框外插入或缺失，可以在某些腫瘤中產生長而全新的氨基酸序列，并且可以被T 細胞識別［24-25］。與此同時，HUANG 等［26］發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細胞中的移碼突變是過繼轉移的腫瘤浸潤性T 細胞克隆的主要靶標。這些研究表明，由移碼突變產生的新穎的開放閱讀框架（neoORF：novel open reading frames）可以誘導高度特異性的抗腫瘤免疫，因此作為疫苗抗原非常有價值。

CARRENO 等［27］率先開始使用新抗原疫苗進行臨床試驗。該研究對3 例患有晚期黑色素瘤的患者預先使用了ipilimumab 單克隆抗體藥物，靜脈接種了了MHC I 類限制的含有8～10 個氨基酸殘基的新生抗原肽疫苗和樹突狀細胞DCs 的混合物。臨床試驗結果表明，癌癥疫苗新表位的作用是增加腫瘤特異性T 細胞反應的廣度和多樣性。

強免疫原性突變表位在癌癥免疫控制中具有重要價值。研究［28-29］顯示，在荷瘤小鼠體內被CD8+T 細胞識別的顯性表位是在單個高表達基因中的錯義的新抗原以及在轉基因誘導型腫瘤中的高免疫原性neoORF，有力地支持了新抗原作為免疫系統(tǒng)的天然靶標的應用。CASTLE 等［30］使用從頭測序來鑒定小鼠黑色素瘤B16F10 中的腫瘤特異性突變，并應用生物信息學算法來預測由這些突變產生的潛在免疫原性表位，通過對腫瘤基因組進行測序系統(tǒng)地鑒定新抗原免疫可以預防和治療疾病。目前已有基于neoantigen 的個性化腫瘤疫苗治療惡性黑色素瘤的成功案例［10，31］。

個性化的癌癥新抗原疫苗方法是可行的，并且多個臨床試驗試驗結果也有力的支持了這項研究的開展。因此，筆者相信隨著研究的進一步開展，基于新抗原的個性化疫苗必將成為一種成熟而成功的針對實體瘤的治療方案，也將大大推動腫瘤精準免疫療法的研究進展。

3.2 新生抗原疫苗可與其他治療手段協(xié)同應用目前的的臨床研究進展而言，使基于新抗原的個性化疫苗成為一種成熟而成功的針對實體瘤的治療方案仍然是一項艱巨的任務。因此，以下建議可能會有所幫助。

3.2.1 多表位疫苗接種產生含有MHCⅠ類限制肽和MHCⅡ類限制肽的多表位疫苗，增加新抗原特異性T 細胞的廣度和多樣性，是克服表位缺失的良好解決方案［27］。在臨床試驗中使用的大多數(shù)新抗原疫苗，包括多肽疫苗（NCT00683670、NCT01970358和NCT02427581），編碼多表位的RNA或基于DNA 的疫苗（NCT02316457、NCT02348320和NCT03122106），含有盡可能多的突變信息?？赡芷鸬揭l(fā)強大的抗腫瘤作用并且會誘發(fā)免疫逃逸的出現(xiàn)。LI 等［32］設計一種基于鹽水的多表位肽疫苗，癌癥患者給藥后的臨床結果表明肺部多個肺腫瘤結節(jié)迅速腫瘤縮小。然而，在開始接種疫苗后8 周，患者死于癌轉移至肝部引起的并發(fā)癥。癌轉移是疫苗治療難以治愈的，可能是由于腫瘤異質性以及為了鑒定新抗原而獲得的樣品僅含有主要部位的原因。改變肽構型成為一個新研究方向，SIMANOVICH 等［33］合成了一個表位EMMPRIN，作為八分支多抗原肽，用該肽疫苗接種證明可抑制小鼠的腫瘤生長和轉移。

3.2.2 免疫佐劑和遞送系統(tǒng)在沒有炎癥和∕或微生物刺激時，處于穩(wěn)定狀態(tài)的樹突狀細胞DCs 捕獲并處理抗原，會由于免疫耐受而無法誘導強的免疫應答。因此，需要開發(fā)有效的免疫佐劑和疫苗遞送系統(tǒng)［34］。經典佐劑包括TLRs 受體激動劑和將抗原靶向DCs 的單克隆抗體。TLRs 受體激動劑通過模擬微生物刺激和增強肽疫苗免疫原性，進而誘導免疫應答。將抗原靶向DCs 的單克隆抗體，包括抗DEC205 和CD40 激動劑，可以起到將新抗原導向最強抗原呈遞細胞的作用，這可以通過增加抗原呈遞效率來和改善疫苗接種的抗腫瘤活性來實現(xiàn)。目前，最理想的疫苗遞送載體是納米顆粒。納米粒子模仿病原相關分子模式并被抗原遞呈細胞上的TLR 受體識別，起到增強基于納米粒子的疫苗攝取的作用［35］。實驗結果顯示，在納米顆粒上裝載新生抗原制備成納米疫苗，最終會誘導更強烈的針對新生抗原特異性的CD8+T 細胞免疫應答，并且顯示出顯著抑制小鼠中的腫瘤進展。

3.2.3 與其他種類的免疫療法結合使用由于PD-1信號傳導途徑對CTL 抗腫瘤反應發(fā)揮強烈的免疫抑制作用，因此新抗原疫苗與免疫檢查點抑制劑的偶聯(lián)能夠產生更廣譜的T 細胞抗腫瘤反應。OTT 等［10］證明新生抗原疫苗誘導持續(xù)的免疫應答，擴大新生抗原特異性T 細胞組成部分。SAHIN等［31］報道了患者對PD-1 阻滯療法和新抗原疫苗接種的聯(lián)合用藥療法產生了完全反應。由此可見，利用聯(lián)合免疫療法可以提高新生抗原的個體化疫苗的臨床應用前景。

3.2.4 與傳統(tǒng)療法相結合分子靶向藥物可以在大多數(shù)具有靶向突變的患者中引起顯著的反應。但是，應答的持續(xù)時間有限［36］。研究顯示具有較高應答效率的基因組靶向療法誘導腫瘤細胞死亡，導致腫瘤相關抗原和新抗原的釋放。從作用機制來講，靶向治療與新抗原疫苗療法具有協(xié)同作用。最近，人們越來越關注放射療法對抗腫瘤免疫應答激活的影響，而且研究證實放射療法與新抗原疫苗療法也可以產生協(xié)同抗腫瘤作用［37］。因此，將新生抗原疫苗的個體化免疫療法與傳統(tǒng)療法相結合，是未來非常有潛力的抗腫瘤免疫替代療法。

4 潛在問題

盡管取得了很大的進展，但新生抗原疫苗的開發(fā)仍存在許多挑戰(zhàn)。首先，必須降低制造新抗原疫苗的成本和時間。盡管DNA∕RNA 測序的成本顯著降低，但鑒定和驗證候選新抗原仍然是昂貴且耗時的［38］。在良好生產實踐條件下制備新抗原疫苗也非常昂貴。目前，從組織采集到疫苗遞送的時間范圍為3 至5 個月［10，31］。其次，新抗原預測算法需要進一步優(yōu)化，包括更好地預測MHCⅠ類和Ⅱ類新抗原的策略，以及由錯義突變以外的遺傳改變引起的潛在新抗原，例如基因融合和插入缺失。最近發(fā)現(xiàn)CD4+T 細胞對新抗原疫苗的反應比CD8+T 細胞反應更常見，即使當基于預測的MHCⅠ類結合對疫苗中包含的新抗原進行優(yōu)先排序時，依然可以改善新抗原預測算法。另外，與對小分子藥物療法相比，癌癥免疫療法的臨床反應具有不同的動力學。通常使用免疫相關反應標準（irRC）評估癌癥免疫療法［39-40］。新生抗原疫苗也將利用這些免疫相關的反應標準，但是，在達到臨床終點之前，還將依靠有效的免疫監(jiān)測來評估疫苗誘導的免疫反應。不幸的是，仍然缺乏可靠的免疫反應生物標記物。需要進一步研究以使用系統(tǒng)方法鑒定相關的免疫應答生物標記物。JANETZKI 等［41］研究發(fā)現(xiàn)ELISPOT 的實驗室間變異可高達50%。但是從標本庫，分析驗證到結果報告的標準化和統(tǒng)一程序對于成功的臨床開發(fā)是必要的。因此，從長遠來看，基于新生抗原的個體化疫苗是未來免疫療法的重要研究方向，但是就當前的技術手段來看，依然還有許多不穩(wěn)定因素需要去克服。

5 展望

免疫療法的最終目標是刺激針對腫瘤的免疫應答。作為腫瘤細胞基因突變的產物，新生抗原在免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤細胞時將起到重要的靶向作用，為個性化的癌癥免疫療法提供了高度特異性和安全性。已證明新生抗原對破壞腫瘤細胞至關重要。新生抗原的篩選和應用方面的創(chuàng)新，開創(chuàng)了個性化疫苗療法的新時代。