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    鱔魚肉新鮮度對加熱過程中蛋白變化規(guī)律的影響

    2019-05-05 06:56:46戴宏杰周鴻媛張宇昊
    食品科學 2019年7期
    關(guān)鍵詞:鱔魚二硫鍵新鮮度

    唐 密,鄭 紅,馬 良,戴宏杰,郭 婷,周鴻媛,余 永,張宇昊*

    (西南大學食品科學學院,重慶 400715)

    鱔魚(Monopterus albus)是一種蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低的典型經(jīng)濟魚類,廣受消費者喜愛[1]。鱔魚除營養(yǎng)豐富外,還具有較高的藥用價值,是整個亞洲最具經(jīng)濟價值的淡水養(yǎng)殖魚之一[2]。據(jù)報道,近年來我國市場每年對鱔魚的需求量達300萬 t[3],很多餐飲企業(yè)直接買入鱔魚肉冷藏待加工,很多超市都在流通售賣冷藏調(diào)制鱔魚肉制品。但魚肉在宰殺后以及冷藏過程中,由于微生物、內(nèi)源性酶、蛋白質(zhì)降解和變性等作用,其品質(zhì)和食用價值均會降低[4-5]。因此,研究不同新鮮度鱔魚肉品質(zhì)變化規(guī)律具有重要意義。

    魚肉在貯藏過程中會發(fā)生劣變,進而影響其熟化后的品質(zhì),而魚肉熟化后的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)是加熱過程中蛋白經(jīng)過一系列變化而形成的。Dima[6]、Verhaeghe[7]等研究證明,魚肉在加熱過程中蛋白質(zhì)的變性聚集是蒸煮損失和品質(zhì)形成的主要原因。曹雷鵬等[8]研究發(fā)現(xiàn)草魚在熱加工過程中,其肉色逐漸變白,蒸煮損失率、收縮面積比和色差ΔE值均隨貯藏時間的延長而緩慢下降??姾氐萚9]研究表明,蛋白質(zhì)的分解主要是由于魚肉中內(nèi)源性酶和微生物的作用,魚肉蛋白結(jié)構(gòu)更易改變,使得冷藏時間越長的魚肉其蛋白在加熱過程中收縮得越強烈,進而造成蒸煮后魚肉的水分含量、硬度、內(nèi)聚性和咀嚼性都呈現(xiàn)顯著下降趨勢,失水率和質(zhì)量損失率呈顯著上升趨勢,從而證實了加熱前金槍魚肉的蛋白存在狀態(tài)(即魚肉新鮮度)會在一定程度上影響熟化后魚肉品質(zhì)。因此,魚肉熟化后的品質(zhì)實際上同其加熱前魚肉蛋白的存在狀態(tài)有關(guān),即與魚肉的新鮮度相關(guān)。

    前期研究表明,鱔魚肉冷藏貨架期為4 d,隨貯藏時間延長,鱔魚肉蛋白間主要內(nèi)部作用力被破壞,蛋白結(jié)構(gòu)逐漸松散,蛋白質(zhì)開始降解,導致鱔魚肉品質(zhì)逐漸劣變;不同新鮮度鱔魚肉熟化后其持水性降低,彈性、咀嚼性和回復性呈不同變化趨勢,主要是由于鱔魚肉熟化后蛋白價鍵發(fā)生變化,蛋白無序化程度增加,蛋白空間結(jié)構(gòu)改變,進而造成不同貯藏時間的熟化鱔魚肉品質(zhì)劣變[10-11]。由此可見,不同新鮮度鱔魚肉中蛋白結(jié)構(gòu)的差異性導致了熟化后鱔魚肉品質(zhì)差異的產(chǎn)生。因此,有必要對不同新鮮度鱔魚肉加熱過程中品質(zhì)產(chǎn)生差異的原因進行系統(tǒng)研究,以明確鱔魚肉品質(zhì)變化和蛋白結(jié)構(gòu)變化在貯藏期間與熟化后之間的關(guān)系。

    本研究主要通過測定貨架期內(nèi)不同新鮮度鱔魚肉加熱過程的品質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)變化,分析不同新鮮度鱔魚肉加熱過程中品質(zhì)形成差異的原因,為明確貨架期內(nèi)不同新鮮度鱔魚肉熟化后品質(zhì)劣變機制及相關(guān)制品研發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    鱔魚購自北碚區(qū)天生菜市場,體長30 cm左右,質(zhì)量60~70 g。

    鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、無水乙醇、尿素成都市科龍化工試劑廠;過硫酸銨、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、β-巰基乙醇、四甲基乙二胺、考馬斯亮藍R-250 美國Bio Basic公司;三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA) 天津市鑫源化工有限公司;質(zhì)量分數(shù)30%的丙烯酰胺工作液 北京索萊寶科技有限公司;標準蛋白(分子質(zhì)量10~200 kDa) 美國賽默飛世爾科技公司。其中Tris、考馬斯亮藍R-250、質(zhì)量分數(shù)30%丙烯酰胺工作液為優(yōu)級純,其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設備

    JA3003B電子天平 上海精天電子儀器有限公司;QL901漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司;8002型溫控水浴鍋 北京永光明醫(yī)療儀器廠;DGG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司;Power PacTM基礎電泳儀 美國Bio-Rad公司;G:BOX EF型凝膠成像系統(tǒng) 英國Syngene公司;5810型臺式高速離心機 德國Eppendorf公司;DXR激光共聚焦顯微拉曼光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司。

    1.3 方法

    1.3.1 魚肉處理

    參照鄭紅等[11]的方法處理新鮮鱔魚。分別取4 ℃條件下貯藏第1、2、3、4、5天的鱔魚肉樣品(揮發(fā)性鹽基氮含量分別為10.47、11.52、12.13、14.08、16.49 mg/100 g[10]),并分別在100 ℃條件下加熱0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 min,自然冷卻后進行指標測定。

    1.3.2 蒸煮失水率的測定

    將加熱(100 ℃、5 min)前后的鱔魚肉分別絞碎,蒸煮失水率的測定參照鄭紅等[11]的方法進行,按下式進行計算。

    1.3.3 化學作用力的測定

    參照鄭紅等[11]的方法測定化學作用力。以蛋白相對含量表示。

    1.3.4 TCA-可溶性氮含量的測定

    樣品處理參考Benjakul等[12]的方法并稍有改動。取鱔魚肉3.0 g,加入27 mL 5% TCA溶液,均質(zhì)2 min后冰浴1 h,5 000×g、4 ℃條件下離心5 min并取上清液。通過Lowry法[13]測定TCA-可溶性氮含量,以每克魚肉中酪氨酸的物質(zhì)的量表示TCA-可溶性氮含量。

    1.3.5 電泳分析

    電泳膠的制備參照楊暉等[14]的方法進行,制備質(zhì)量分數(shù)10%分離膠、質(zhì)量分數(shù)5%濃縮膠,按鄭紅等[11]的方法對樣品進行前處理并電泳。用凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖,再通過Gene Tools分析結(jié)果。

    1.3.6 拉曼光譜分析

    拉曼光譜測量條件與測定步驟參照鄭紅等[11]的方法。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    采用Microsoft Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析,采用SPSS 19.0軟件的Duncan檢驗進行多重比較,并用Origin 9.0軟件作圖。所有實驗均重復3 次,數(shù)據(jù)以表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 鱔魚肉新鮮度對加熱過程中蒸煮失水率的影響

    圖1 冷藏時間和加熱時間對鱔魚肉蒸煮失水率的影響Fig. 1 Effect of refrigeration time and heating time on moisture loss of Monopterus albus

    由圖1可知,鱔魚肉蒸煮失水率隨加熱時間延長而增加。貯藏時間越長的鱔魚肉,加熱過程中失水越嚴重。隨著貯藏時間的延長,鱔魚肉部分蛋白會發(fā)生降解,使鱔魚肉自身持水性變差[10],從而導致加熱過程中鱔魚肉蒸煮失水率增加;此外,隨著貯藏時間的延長,鱔魚肉蛋白結(jié)構(gòu)展開[15],也會導致加熱過程中蛋白收縮更加強烈進而造成失水更加嚴重。Cao Leipeng[16]、Shi Ce[17]等研究表明,隨貯藏時間和加熱時間的延長,魚肉蒸煮失水率呈上升趨勢,與本實驗結(jié)果一致。

    2.2 鱔魚肉新鮮度對加熱過程中化學作用力的影響

    圖2 不同冷藏時間鱔魚肉加熱過程中化學作用力的變化Fig. 2 Changes in chemical forces of Monopterus albus proteins as affected by storage time and cooking time

    新鮮鱔魚蛋白空間結(jié)構(gòu)的主要作用力為離子鍵和氫鍵,其含量在貯藏過程中隨時間的延長逐漸降低,疏水相互作用和二硫鍵含量逐漸增加[10]。由圖2A、B可知,離子鍵和氫鍵隨加熱的進行而逐漸被破壞,熟化鱔魚肉中蛋白間相互作用以疏水相互作用為主。由圖2C可知,隨著加熱時間的延長,新鮮的鱔魚肉(貯藏1~2 d)疏水相互作用含量逐漸增加,但貯藏時間較長的鱔魚肉中疏水相互作用含量則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這可能是因為新鮮鱔魚肉中蛋白展開程度低,加熱過程中蛋白逐漸展開,疏水基團充分暴露,疏水相互作用含量逐漸增加[18-20];而貯藏時間較長的鱔魚肉中蛋白展開程度較高,加熱過程前期,蛋白肽鏈已經(jīng)充分展開,疏水作用達到最大值,后期在熱力作用下部分疏水作用被破壞,導致疏水作用下降[21]。疏水作用的降低說明蛋白間相互作用力下降,這可能會導致魚肉質(zhì)構(gòu)特性下降[11,22-24]。

    由圖2D可知,新鮮的鱔魚肉(貯藏1~3 d),在加熱初始,二硫鍵含量上升,隨著加熱的繼續(xù)進行變化不大,而貯藏時間較長(4~5 d)的鱔魚肉在加熱后期二硫鍵含量降低,這可能是因為蛋白充分展開后二硫鍵被熱力破壞。本課題組前期研究[11]發(fā)現(xiàn),二硫鍵含量同熟化鱔魚肉的口感高度相關(guān),因此,貯藏時間過長的鱔魚肉可能會在加熱過程中因二硫鍵被破壞而口感下降。對于貯藏時間較長的鱔魚肉,在保證微生物安全的前提下,適當?shù)乜s短加熱時間可以改善鱔魚肉的口感。

    2.3 鱔魚肉新鮮度對加熱過程中蛋白質(zhì)降解的影響

    圖3 不同冷藏時間鱔魚肉加熱過程中TCA-可溶性氮含量(A)和全蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(B)的變化Fig. 3 Change in TCA-soluble nitrogen (A) and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of total protein (B) of Monopterus albus as affected by storage time and cooking time

    由圖3A可知,不同新鮮度鱔魚肉TCA-可溶性氮含量在加熱過程中變化不大,說明加熱過程并未明顯造成鱔魚肉中蛋白質(zhì)的降解。貯藏時間越長的生鱔魚肉,TCA-可溶性氮含量越高,說明蛋白降解越嚴重,且這一現(xiàn)象并未隨著加熱的進行而改變。

    由圖3B可知,加熱過程中,鱔魚肉蛋白圖譜沒有明顯的蛋白條帶加深或變淡,進一步說明加熱沒有造成蛋白明顯降解。貯藏2~5 d的樣品中,觀察到一條分子質(zhì)量約30 kDa的蛋白條帶,且隨著貯藏時間延長,其蛋白條帶顏色加深,結(jié)合TCA-可溶性氮含量結(jié)果,說明該組分可能是貯藏過程中的蛋白降解產(chǎn)物。

    2.4 拉曼光譜分析

    2.4.1 蛋白質(zhì)微環(huán)境的變化

    如圖4所示,拉曼光譜中760 cm-1譜峰是關(guān)于色氨酸環(huán)的伸縮振動,當包埋在疏水微環(huán)境中的色氨酸殘基暴露在極性環(huán)境時,760 cm-1處峰強度下降[25]。而被稱為費米共振雙峰的850 cm-1和830 cm-1譜峰與酪氨酸殘基對位取代苯振動有關(guān),采用I850/I830以表征酪氨酸殘基的暴露與包埋情況,當I850/I830的比值為0.9~2.5時表明酪氨酸殘基暴露[26]。由表1可知,在加熱過程中,I760從加熱1 min開始下降(P<0.05),I850/I830的比值隨加熱的進行呈現(xiàn)增加的趨勢(P<0.05),說明加熱會促進色氨酸、酪氨酸殘基暴露[27-28]。加熱初期的鱔魚肉,隨著貯藏時間的延長,I760和I850/I830的比值無顯著變化(P>0.05);而加熱后期,隨著貯藏時間的延長,I760顯著增加(P<0.05),I850/I830的比值呈先增加后下降的趨勢(P<0.05),說明隨著魚肉新鮮度降低,加熱時間過長則會導致暴露的色氨酸、酪氨酸殘基重新被包埋。結(jié)合前期實驗中化學作用力的變化,說明隨著蛋白鏈之間化學相互作用力降低,蛋白構(gòu)象更容易改變;同時,鱔魚肉新鮮度越低,其降解程度越高。因此,貯藏時間較長的鱔魚肉在加熱后期肽鏈的改變向親水基團暴露、疏水基團被包埋的趨勢發(fā)展,這與疏水作用的降低趨勢一致。

    圖4 不同冷藏時間鱔魚肉加熱過程中的拉曼光譜(500~2 000 cm-1)Fig. 4 Raman spectra in 500-2 000 cm-1 region of Monopterus albus proteins as affected by storage time and cooking time

    表1 不同冷藏時間鱔魚熟化過程中I760和I850/I830比值歸一化強度的變化Table 1 Changes in normalized I760 and I850/I830 ratio in Raman spectroscopic analysis of Monopterus albus proteins as affected by storage time and cooking time

    2.4.2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化

    圖5 不同冷藏時間鱔魚加熱過程中蛋白二級結(jié)構(gòu)含量Fig. 5 Changes in contents of secondary structures in Monopterus albus protein as affected by storage time and cooking time

    酰胺I帶(1 640~1 680 cm-1)主要源于肽鍵C=O的面內(nèi)伸縮振動及N—H的面內(nèi)彎曲振動,常常被用來估算蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)信息[29]。酰胺I帶拉曼光譜峰的結(jié)構(gòu)主要由1 645~1 660 cm-1(α-螺旋)、1 660~1 665 cm-1(無規(guī)卷曲)、1 665~1 680 cm-1(β-折疊)和1 680 cm-1附近(β-轉(zhuǎn)角)等重疊的譜帶構(gòu)成[30]。各二級結(jié)構(gòu)含量變化情況通過對酰胺I帶的計算結(jié)果進行去卷積和高斯擬合得到。由圖5可知,貯藏1~5 d內(nèi),隨著加熱時間的延長,肽鏈逐漸解旋,無規(guī)卷曲含量增加,蛋白結(jié)構(gòu)逐漸向無序化轉(zhuǎn)變。貯藏時間越長的鱔魚肉,加熱過程中蛋白展開程度越大,這可能是因為生鮮鱔魚肉中蛋白展開程度較高,加熱過程中魚肉蛋白逐漸展開,蛋白結(jié)構(gòu)緊密程度和構(gòu)象穩(wěn)定性明顯降低,蛋白無序化程度增加,從而導致α-螺旋和β-折疊逐漸轉(zhuǎn)化為β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲[31-32]。加熱5 min時,貯藏5 d的鱔魚肉α-螺旋含量高于貯藏4 d,說明貯藏5 d的鱔魚肉在加熱后期蛋白結(jié)構(gòu)傾向于有序化,這可能是其加熱后期部分肽鏈形成了一定的空間結(jié)構(gòu)。

    3 結(jié) 論

    鱔魚肉蒸煮失水率隨加熱時間延長而增加。貯藏時間越長的鱔魚肉,加熱過程中失水越嚴重;鱔魚肉中離子鍵和氫鍵隨加熱時間延長而逐漸被破壞;新鮮鱔魚肉(1~2 d)在加熱過程中,疏水相互作用含量逐漸增加,二硫鍵含量在加熱初期增加,后期則變化不大;貯藏時間較長的鱔魚肉(3~5 d),在加熱過程中疏水相互作用含量則總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,二硫鍵含量在加熱前期變化不大,加熱后期則降低;不同新鮮度的鱔魚肉在加熱過程中蛋白均未發(fā)生明顯降解,熟化鱔魚肉中蛋白降解程度的差異主要由貯藏過程中蛋白降解造成;新鮮度越低的鱔魚肉,加熱過程中蛋白二級結(jié)構(gòu)展開程度越高,且在加熱后期隨著鱔魚肉新鮮度降低,更多暴露的色氨酸、酪氨酸殘基重新被包埋,導致了疏水作用降低。

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