低溫超微粉碎對生物酶法制油豆渣蛋白結(jié)構(gòu)影響的拉曼光譜分析

吳長玲，尋崇榮，劉寶華，王中江，滕 飛，江連洲，李 楊*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

生物酶法制油作為一種新興的“綠色、環(huán)?！碧嵊图夹g(shù)，在提取油脂的同時(shí)能高效地回收油料中其他有價(jià)值組分，與傳統(tǒng)工藝相比，其在能耗、環(huán)境保護(hù)和安全衛(wèi)生等方面具有顯著優(yōu)勢，且操作條件溫和、工序簡單[1-4]?，F(xiàn)階段國內(nèi)外學(xué)者針對生物酶法制油技術(shù)的研究主要集中在預(yù)處理、酶解工藝條件、乳狀液破除、油脂釋放機(jī)制及油脂品質(zhì)等方面，對于大豆加工過程副產(chǎn)物的研究主要集中在豆腐、豆?jié){殘?jiān)?，而針對生物酶法制油豆渣的相關(guān)研究不多，對豆渣組分中蛋白結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理及潛在生物活性更是鮮有研究[5-8]。

針對目前豆渣利用率低且浪費(fèi)嚴(yán)重的現(xiàn)狀，許多學(xué)者對大豆加工副產(chǎn)物的深加工技術(shù)進(jìn)行了研究，主要運(yùn)用超微粉碎及螺桿擠壓改性處理技術(shù)研究大豆豆渣粒度和加工性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)超微粉碎處理使豆渣具有一般顆粒所沒有的特殊理化性質(zhì)，如良好的溶解性、分散性、吸附性、化學(xué)反應(yīng)活性等[9-11]。另外，有研究證實(shí)超微粉碎程度會促進(jìn)大豆和原料中蛋白質(zhì)的堿提取[12]。同時(shí)，Le Gall等[13]研究了粒度對豌豆粉蛋白質(zhì)提取率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著粉碎程度的降低，面粉的平均粒度增加，而豌豆粉提取的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)從73.6%下降到37.4%。Russin等[14]研究發(fā)現(xiàn)分別經(jīng)3 種不同研磨篩處理的脫脂豆粉，其蛋白提取率不同，說明粒度對蛋白回收有明顯影響，這與Le Gall等[13]的研究結(jié)果相似。綜上所述，超微粉碎對植物蛋白分離、回收及理化性質(zhì)影響顯著，與其他方法相比超微粉碎具有技術(shù)簡單、成本低和可持續(xù)的優(yōu)勢，但超微粉碎的高速剪切作用使得體系溫度升高，為避免高溫對蛋白構(gòu)象的影響，本研究采用低溫超微粉碎處理生物酶法制油的豆渣。

拉曼光譜是一種基于拉曼散射和瑞利散射效應(yīng)的光譜學(xué)分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究中，它可以通過鑒別蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征峰的變化，得到蛋白質(zhì)分子多肽鏈骨架構(gòu)型改變的信息和分子側(cè)鏈微環(huán)境變化的信息[15]。拉曼光譜在不破壞樣品的情況下可提供豐富的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，故本研究主要采用拉曼光譜深入解析豆渣蛋白結(jié)構(gòu)。

本研究利用低溫超微粉碎處理生物酶法制油豆渣，采用拉曼光譜分析豆渣蛋白經(jīng)不同粉碎程度處理后豆渣蛋白的結(jié)構(gòu)變化，并對其主要的碳鏈與側(cè)鏈構(gòu)象進(jìn)行研究。旨在通過低溫超微粉碎的處理方式高效回收豆渣蛋白，為生物酶法豆渣中蛋白的分離、純化及回收提供理論指導(dǎo)和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆生物酶法制油豆渣由實(shí)驗(yàn)室自制；α-淀粉酶（DA4251，酶活力≥10 000 U/g） 合肥泊美生物科技有限責(zé)任公司；纖維素酶（酶活力≥10 000 U/g） 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

S22-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C雷磁pH計(jì) 上海精科儀器有限公司；SWFJ超微粉碎機(jī) 廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；TDL-408臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-4數(shù)顯攪拌水浴鍋 常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Raman Station 400激光顯微拉曼光譜儀 美國PE公司。

1.3 方法

1.3.1 酶法制油豆渣的制備

對Li Yang等[16]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改，將市售大豆粉碎過60 目篩，取200 g過篩后的粉體，按料液比1∶6加入蒸餾水，待攪拌均勻后放入55 ℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行酶解，酶解條件為：酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間2 h、pH 9.0、堿性蛋白酶Protex6L（8 900 U/mL）添加量0.5%（體積分?jǐn)?shù)），邊攪拌邊酶解，酶解結(jié)束后取出并用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)水溶液pH值至7，之后在100 ℃沸水中滅酶5 min，將滅酶后的溶液于4 500 r/min離心20 min，豆渣在平板鋪平后置于55 ℃鼓風(fēng)烘箱，待恒質(zhì)量后取出研磨即得生物酶法制油豆渣。

1.3.2 低溫超微粉碎處理豆渣的制備

由于豆渣中的脂肪氧化后會產(chǎn)生異味并影響提取率[17]，因此在低溫超微粉碎前按照楊夢曦等[18]的處理方法除去脂肪。然后，采用超微粉碎機(jī)在-4 ℃下超微粉碎酶法制油豆渣（水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤4%），粉碎時(shí)間30 s，出料粒度分別為100、200、300 目，然后烘干至質(zhì)量恒定，即得所需豆渣樣品。

1.3.3 未處理及常溫超微粉碎處理豆渣的制備

未處理組即不經(jīng)超微粉碎處理，其他步驟與1.3.2節(jié)一致。常溫超微粉碎處理組于常溫（25 ℃）下操作，出料粒度為200 目，其他步驟同1.3.2節(jié)。

1.3.4 豆渣蛋白的提取

根據(jù)Petruccelli等[19]的方法提取渣蛋白。取150 g豆粉，用正己烷以料液比1∶6混合脫脂3 次，得到脫脂豆粕，將脫脂豆粕按1∶10的質(zhì)量比與水混合，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5，45 ℃攪拌2 h后，將其懸浮液在4 ℃條件下10 000×g離心20 min，取上清液再用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5。靜置后在4 ℃條件下6 000×g離心20 min，得蛋白沉淀后水洗2 次，最后取沉淀分散于水中并用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。再在4 ℃條件下10 000×g離心30 min，除去少量的不溶物，將此蛋白溶液冷凍干燥后研磨即得粉末狀大豆分離蛋白。

1.3.5 超微粉碎處理前后豆渣蛋白的拉曼光譜分析

采用Raman Station 400激光顯微拉曼光譜儀。激發(fā)光波長為785 nm，激光功率為80 mW，掃描范圍400～2 000 cm-1，每次掃描時(shí)間60 s，積分10 次，4 次掃描進(jìn)行累加。以苯丙氨酸（（1 003±1）cm-1）作為歸一化因子，采用ACD Labs V12軟件進(jìn)行譜圖基線校正、譜峰歸屬查找，最終進(jìn)行豆渣蛋白的拉曼光譜分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有的實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3 次，利用SPSS Statistics 22軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（方差分析），P＜0.05為差異顯著。分別采用Origin 8.5、PeakFit 4.12軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、圖表處理及圖譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣蛋白主鏈結(jié)構(gòu)特征拉曼光譜分析

為了有效分析經(jīng)低溫超微粉碎處理生物酶法制油豆渣中蛋白組分結(jié)構(gòu)特征，本研究采用拉曼光譜進(jìn)行分析研究，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同粉碎條件下豆渣蛋白拉曼光譜Fig. 1 Raman spectra of soybean meal protein ground to different particle sizes

表1 拉曼光譜峰位歸屬Table 1 Attribution of Raman spectral peaks

參考拉曼光譜峰位歸屬（表1），豆渣蛋白酰胺I帶拉曼特征峰位置為：α-螺旋結(jié)構(gòu)歸屬峰位（1 645～1 660 cm-1）；β-折疊結(jié)構(gòu)（1 670～1 680 cm-1）；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（1 680～1 690 cm-1）；無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)（1 660～1 670 cm-1）。本研究中拉曼圖譜二級結(jié)構(gòu)含量的定量計(jì)算由PeakFit 4.12軟件分析完成，圖2所示為豆渣蛋白拉曼譜帶在1 600～1 700 cm-1區(qū)域內(nèi)的擬合圖譜。

圖2 豆渣蛋白拉曼譜帶在1 600～1 700 cm-1區(qū)域內(nèi)的擬合圖譜Fig. 2 Raman fitting curves of soybean meal protein in the range of 1 600-1 700 cm-1

表2 超微粉碎改性處理豆渣蛋白二級結(jié)構(gòu)組分含量Table 2 Percentages of protein secondary structures in soybean meal subjected to different treatments

將豆渣蛋白的酰胺I帶用于研究豆渣蛋白二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如表2所示。經(jīng)低溫超微粉碎后豆渣蛋白中β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量顯著下降（P＜0.05），常溫超微粉碎后豆渣蛋白無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量降至12.54%，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量顯著增加（P＜0.05）。隨著低溫超微粉碎程度的不斷加劇，豆渣蛋白α-螺旋及β-折疊含量分別呈現(xiàn)先增加后下降、先下降后上升的變化趨勢。經(jīng)低溫超微粉碎處理與常溫處理豆渣蛋白二級結(jié)構(gòu)組分均以α-螺旋、β-折疊為主。另外發(fā)現(xiàn)與未處理豆渣蛋白相比，常溫超微粉碎處理后豆渣蛋白無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量較低溫超微粉碎下降趨勢更為明顯。

與未處理?xiàng)l件對比，超微粉碎的高剪切作用使蛋白分子間的相互作用逐漸減弱，其疏水結(jié)合及離子結(jié)合可能因體積的縮小被切斷，蛋白質(zhì)分子伸展，非極性基團(tuán)暴露，分子間疏水作用增強(qiáng)，氫鍵作用逐漸減弱，導(dǎo)致豆渣蛋白α-螺旋與β-折疊結(jié)構(gòu)的加和增加，β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量下降，這與Rahmeh等[20]通過熒光光譜分析分子間偶聯(lián)程度對G蛋白表面疏水作用影響的研究結(jié)果一致。另外，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)隨蛋白質(zhì)聚合程度而變化，較高程度的蛋白質(zhì)聚合與穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)的積聚高度相關(guān)，α-螺旋和β-折疊構(gòu)象比例高，表明超微粉碎處理后，豆渣蛋白分子間有序結(jié)構(gòu)增加，蛋白質(zhì)聚合增強(qiáng)。由于粉碎過程中蛋白粒徑減小，比表面積大幅增加，豆渣蛋白聚合程度增強(qiáng)，從而導(dǎo)致豆渣蛋白這種結(jié)構(gòu)單元變化的發(fā)生，這與Xiong Licheng[21]、Hou[22]和Belton[23]等的研究結(jié)果一致。同時(shí)，Xiong Licheng[21]和Lee[24]等的研究表明，精磨粉碎處理后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)β-折疊結(jié)構(gòu)含量的增加和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量的減少，表明形成了更多的聚合和穩(wěn)定的谷蛋白網(wǎng)絡(luò)，豆渣蛋白二級結(jié)構(gòu)更趨有序化，印證了本研究中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量下降的趨勢。

與低溫超微粉碎條件相比，常溫粉碎在高速剪切作用過程中對豆渣蛋白存在溫度效應(yīng)，處理過程中使部分豆渣蛋白變性，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊，蛋白分子內(nèi)疏水性氨基酸暴露，導(dǎo)致分子間作用力下降，故豆渣蛋白β-折疊含量總體增加不明顯，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增加明顯，說明常溫粉碎處理下，部分無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。這可能是由于超微粉碎處理溫度能先讓蛋白解聚，使蛋白分子充分展開，分子內(nèi)埋游離巰基暴露，而暴露的游離巰基在常溫粉碎溫度下被氧化形成分子間或分子內(nèi)二硫鍵，蛋白分子重新聚合形成新的聚集體造成蛋白三級結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而引起二級結(jié)構(gòu)單元含量發(fā)生相應(yīng)變化[25]。

隨著低溫超微粉碎目數(shù)的增加（100～200 目），超微粉碎的這種高剪切作用不斷加強(qiáng)，導(dǎo)致豆渣蛋白分子間碰撞作用增強(qiáng)，分子間的相互作用逐漸減弱，氫鍵作用逐漸減弱，故豆渣蛋白α-螺旋含量與β-折疊含量比值增加，無規(guī)卷曲含量呈上升趨勢；當(dāng)粉碎程度達(dá)到200 目時(shí)，豆渣蛋白分子間碰撞作用停止，粉碎程度繼續(xù)增加，氫鍵作用反而增大，分子間作用增強(qiáng)，故出現(xiàn)豆渣蛋白α-螺旋含量與β-折疊含量比值下降現(xiàn)象。

2.2 豆渣蛋白側(cè)鏈結(jié)構(gòu)特征拉曼光譜分析

已有研究表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變能夠引起色氨酸殘基的暴露，760 cm-1附近區(qū)域的拉曼峰強(qiáng)度降低與色氨酸殘基由原本“包埋態(tài)”轉(zhuǎn)變?yōu)椤氨┞稇B(tài)”有關(guān)，在拉曼譜圖中表現(xiàn)為色氨酸譜帶強(qiáng)度的降低[26-29]。由表3可以看出，與未經(jīng)超微粉碎處理的豆渣蛋白相比，低溫超微粉碎處理引起760 cm-1附近區(qū)域的拉曼光譜峰強(qiáng)度降低，表明色氨酸殘基趨向于“暴露態(tài)”。而較未處理豆渣蛋白，常溫超微粉碎處理引起760 cm-1附近區(qū)域的拉曼光譜峰強(qiáng)度升高，表明色氨酸殘基趨向于“包埋態(tài)”。色氨酸殘基的暴露是由于超微粉碎處理使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，分子結(jié)構(gòu)展開導(dǎo)致的；而常溫超微粉碎處理下色氨酸殘基的包埋可能與超微粉碎溫度導(dǎo)致豆渣蛋白部分變性有關(guān)[30]。在本研究中，經(jīng)低溫超微粉碎（200 目）處理的豆渣蛋白在760 cm-1附近區(qū)域的色氨酸拉曼光譜峰強(qiáng)度較低，該區(qū)域歸屬于色氨酸殘基的伸縮振動，表明此條件下色氨酸殘基更趨于“暴露態(tài)”，這與上述不同粉碎程度下分子碰撞作用影響有關(guān)。

Herrero等[29]研究指出850 cm-1和830 cm-1是酪氨酸殘基苯環(huán)的呼吸振動和面外彎曲倍頻之間的費(fèi)米共振。如表3所示，I850/I830比值分布于0.99～1.09之間，表明所測豆渣蛋白的酪氨酸殘基暴露于溶液的極性微環(huán)境下作為中性強(qiáng)度氫鍵的供體或受體。與未經(jīng)超微粉碎處理的豆渣蛋白相比，低溫超微粉碎處理時(shí)酪氨酸費(fèi)米共振線（I850/I830）比值較小，表明酪氨酸殘基微環(huán)境在低溫超微粉碎過程中得以保持。然而，在常溫超微粉碎處理?xiàng)l件下，I850/I830比值降低到0.99，較低溫超微粉碎下降更為明顯，這表明超微粉碎處理溫度會導(dǎo)致酪氨酸殘基暴露程度加劇。由此可以推測經(jīng)超微粉碎處理后豆渣蛋白的酪氨酸應(yīng)更趨于“暴露態(tài)”，且粉碎程度過大會導(dǎo)致酪氨酸“暴露”程度降低。這表明超微粉碎破壞了維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的主要作用力，使包埋于豆渣蛋白分子內(nèi)部的酪氨酸殘基暴露于分子表面，并作為氫鍵的供體或受體與水相互作用[31]。但隨著粉碎程度加大，分子間碰撞作用停止，分子間氫鍵作用增強(qiáng)，導(dǎo)致疏水性氨基酸酪氨酸殘基暴露程度降低。

另外，Ngarize[32]和Ferrer[33]等的研究表明1 450 cm-1是脂肪族氨基酸的拉曼歸屬譜線，脂肪族氨基酸的拉曼歸屬峰強(qiáng)度降低與脂肪族氨基酸暴露有關(guān)。在本研究中，經(jīng)超微粉碎作用下的豆渣蛋白在1 450 cm-1處的拉曼歸屬峰強(qiáng)度總體低于未處理方式，這與豆渣蛋白在超微粉碎過程中的結(jié)構(gòu)重排有關(guān)。另發(fā)現(xiàn)常溫超微粉碎較低溫超微粉碎I1450/I1003比值下降更明顯，表明常溫超微粉碎的高剪切作用會導(dǎo)致部分豆渣蛋白變性，從而影響蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，與上述2.1節(jié)分析結(jié)果一致。

表3 不同處理?xiàng)l件下豆渣蛋白側(cè)鏈基團(tuán)譜帶強(qiáng)度Table 3 Band intensities of side chain groups in soybean meal protein subjected to different treatments

2.3 豆渣蛋白二硫鍵拉曼光譜分析

de Vuyst[34]和王中江[35]等的研究表明在拉曼譜圖中500～550 cm-1范圍內(nèi)是二硫鍵的特征譜帶，二硫鍵在不同振動模式下所反映出的拉曼光譜位移有所不同，其中，500～515 cm-1處為gauche-gauche-gauche（g-g-g）模式，515～525 cm-1處為gauche-gauche-trans（g-g-t）模式，525～545 cm-1處為trans-gauche-trans（t-g-t）模式。為了探究超溫粉碎改性對豆渣中豆渣蛋白二硫鍵的影響，本研究運(yùn)用Peak Analyzer軟件進(jìn)行多峰值Guassina擬合處理。

圖3 豆渣蛋白拉曼譜帶在500～550 cm-1區(qū)域內(nèi)的高斯擬合圖Fig. 3 Raman Gaussianves fitting curves of soybean meal protein in the region of 500-550 cm-1

從圖3可以看出，擬合譜線重新合成的譜線與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)貼近，證明擬合結(jié)果是準(zhǔn)確的。對擬合的各個(gè)高斯峰值進(jìn)行歸屬，各處理方式豆渣蛋白的二硫鍵的振動模式歸屬情況如表4所示。本研究運(yùn)用各個(gè)峰的高度計(jì)算各振動模式的百分比，以及二硫鍵的數(shù)量。結(jié)合表4及圖3的分析，經(jīng)超微粉碎處理后g-g-g與g-g-t模式百分比下降顯著，t-g-t模式百分比顯著增加，且隨著物料粉碎程度的加劇，二硫鍵數(shù)量變化較為明顯，這可能是由于超微粉碎處理破壞大的蛋白顆粒的同時(shí)，使得埋藏在內(nèi)部的游離巰基暴露，從而被氧化形成二硫鍵，這與Chan等[36]的研究結(jié)果一致。另外，常溫超微粉碎過程中剪切力產(chǎn)生的溫度效應(yīng)會引起豆渣蛋白結(jié)構(gòu)解折疊現(xiàn)象，分子間作用力下降，導(dǎo)致分子內(nèi)二硫鍵數(shù)量下降，故常溫超微粉碎處理下二硫鍵中g(shù)-g-g模式含量顯著下降。隨著粉碎目數(shù)的增加，豆渣蛋白t-g-t模式含量分別呈現(xiàn)先下降后增加的變化趨勢，說明超微粉碎高速剪切處理將大顆粒蛋白聚集體破壞，形成新的小顆粒的過程中也有部分游離巰基暴露氧化成二硫鍵，造成蛋白三級結(jié)構(gòu)的改變；同時(shí)，t-g-t模式含量的增加表明超微粉碎程度的加深使豆渣蛋白分子間作用力增強(qiáng)?？梢缘玫浇Y(jié)論：超微粉碎作用能夠顯著改變豆渣中豆渣蛋白的二硫鍵構(gòu)型，由g-g-g構(gòu)型向t-g-t構(gòu)型轉(zhuǎn)變，這種變化表現(xiàn)出一種非線性變化趨勢，經(jīng)超微粉碎處理后t-g-t構(gòu)型成為豆渣蛋白二硫鍵的主要構(gòu)型。共價(jià)二硫鍵和非共價(jià)相互作用（如氫鍵、離子鍵和疏水鍵）有助于形成穩(wěn)定豆渣蛋白結(jié)構(gòu)，這與Domenek等[37]的研究結(jié)果相似。

表4 豆渣蛋白在500～550 cm-1區(qū)域擬合結(jié)果Table 4 Fitting results of soybean meal protein in the region of 500-550 cm-1

3 結(jié) 論

生物酶法制油豆渣經(jīng)低溫超微粉碎處理后，豆渣蛋白改性前后二級結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，處理后豆渣蛋白中無序二級結(jié)構(gòu)單元含量明顯降低，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，改性后β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量降低至幾近為零；通過I760/I1003、I850/I830及I1450/I1003拉曼強(qiáng)度比值發(fā)現(xiàn)經(jīng)超微粉碎改性處理的豆渣中，豆渣蛋白的疏水性基團(tuán)暴露程度高于未超微粉碎處理方式；超微粉碎處理改變了豆渣中蛋白的二硫鍵構(gòu)型，經(jīng)超微粉碎處理后t-g-t模式含量顯著增加，呈現(xiàn)出了一種非線性變化趨勢；對比低溫、常溫超微粉碎發(fā)現(xiàn)，在-4 ℃超微粉碎條件下豆渣蛋白二級結(jié)構(gòu)變化更趨明顯。