MiR-148a-3p通過靶向SRPK2抑制結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移

王小東，馬博昭，戚峰

（天津醫(yī)科大學總醫(yī)院普通外科，天津300052）

隨著生活水平的提高和生活方式的改變，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發(fā)病率每年都在增加[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移是CRC患者喪失手術機會的最重要原因之一。大約20%～25%的患者在初次診斷CRC時出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，40%～50%的患者在切除原發(fā)性CRC后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移[2]。盡管目前CRC的診斷和治療方法取得了顯著進展，腫瘤轉(zhuǎn)移仍是影響結(jié)腸癌患者生存的重要因素[3]。目前，術后化療是Ⅲ期結(jié)腸癌患者的標準治療[4]。因此，尋找和開發(fā)結(jié)腸癌中的靶向治療劑具有重要的意義。

MicroRNA （miRNA/miR）代表一組獨特的非編碼RNA分子，其通過與信使RNA（message RNA，mRNA）的3′-UTR區(qū)結(jié)合而轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達，導致翻譯抑制或mRNA降解[5]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA失調(diào)與許多人類疾病有關，并且與各種腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關，包括CRC[6]、乳腺癌[7]、肺癌[8]和胃癌[9]。很多研究已經(jīng)證明，CRC中有很多miRNA 的變化。例如，miR-135a、miR-137、miR-143、miR-148a-3p和 miR-31[10-12]。MiR-135a可以通過影響p21和周期蛋白D2影響結(jié)腸癌細胞的增殖[13]。MiR-143過表達可以抑制結(jié)腸癌增殖，促進結(jié)腸癌細胞凋亡[14]。已經(jīng)有研究顯示，miR-148a-3p在早期復發(fā)II期和Ⅲ期結(jié)直腸癌根治術后具有重要的臨床意義。MiR-148a-3p的失調(diào)發(fā)生在多種腫瘤中，如胰腺癌[15]、胃癌[16-18]、非小細胞肺癌[19]、乳腺癌[20]和鼻咽癌[21]等。MiR-148a-3p通過抑制DNA甲基化酶Ⅰ的表達抑制胃癌的轉(zhuǎn)移和侵襲[18]。MiR-148a-3p可以通過引導DNA甲基化從而調(diào)節(jié)乳腺癌表面雌激素受體的表達[20]。但是目前，miR-148a-3p對結(jié)腸癌的作用研究還很少，發(fā)揮作用的機制也不完全清楚。

富含絲氨酸/精氨酸蛋白特異性激酶（Serine/Arginine-rich protein specific kinases，SRPK），如SRPK1和SRPK2，可以磷酸化可變剪接因子/剪接因子2并調(diào)節(jié)細胞周期[22]。對于SRPK2，其發(fā)揮的主要作用是促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[23]。但是目前SRPK2在結(jié)腸癌中的表達的調(diào)控機制還不完全清楚。

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)相對于正常結(jié)直腸粘膜上皮細胞，miR-148a-3p在結(jié)腸癌細胞中表達降低，SRPK2在結(jié)腸癌細胞中表達增高。在結(jié)腸癌細胞中過表達miR-148a-3p可以抑制結(jié)腸癌細胞的遷移及侵襲能力。相反的，miR-148a-3p inhibitor可以增強結(jié)腸癌細胞的遷移及侵襲能力。同時，miR-148a-3p可以影響結(jié)腸癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，SRPK2是miR-148a-3p的直接作用靶點。MiR-148a-3p過表達可以抑制SRPK2 mRNA和蛋白的表達，而miR-148a-3p敲低時，SRPK2 mRNA及蛋白表達增高。MiR-148a-3p通過調(diào)控SRPK2表達可能是影響結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移的機制之一。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細胞系（SW480，S

W620，LOVO和HCT-116）和人正常結(jié)直腸上皮細胞系FHC從中國科學院（中國上海）購買或本實驗室凍存。用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)基每2 d更換1次。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前，將2.5×104個細胞接種到6孔板的每個孔中并孵育24 h，然后棄去培養(yǎng)基。用100 nmol/L miR-148a mimic（Ribobio，廣州，中國）或200 nmol/L miR-148a inhibitor（Ribobio，廣州，中國）及對應的陰性對照（negtive control，NC）轉(zhuǎn)染細胞。使用Lipofectamine 2000試劑促進轉(zhuǎn)染（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。

1.3 劃痕和transwell侵襲實驗 通過劃痕和帶有Matrigel（BD Bioscience，USA）基質(zhì)膠的transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力。對于劃痕實驗，將轉(zhuǎn)染后的細胞接種于6孔板中，當細胞達到90%匯合時，吸出培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗兩遍。在含有1%FBS的培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)過夜后吸出培養(yǎng)基。用200 μL移液管尖端在單層細胞表面劃出三條平行的劃痕，用PBS洗滌細胞以除去碎片，并培養(yǎng)24 h觀察劃痕距離。對于transwell侵襲實驗，將200 μL含有1×105個細胞的無血清培養(yǎng)基加入上室中，并將600 μL含有10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基加入到下室中。在37℃培養(yǎng)24 h后，除去基質(zhì)膠，將穿透基質(zhì)膠并到達基底膜的細胞在4%多聚甲醛中固定，用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，并在倒置顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)。

1.4 熒光素酶報告系統(tǒng) 將結(jié)合miR-148a-3p的野生型（Wt）或突變型（Mut）SRPK2序列克隆到pGL3 Basic載體（Promega）中。將293T細胞接種在24孔板中48 h后，將10 μg pLUC-Wt-SRPK2或pLUC-Mut-SRPK2與miR-148a-3p mimic或inhibitor（Ribobio，廣州，中國）共轉(zhuǎn)染到 293T 細胞中。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，裂解細胞并檢測熒光素酶活性（Promega，USA）。

1.5 RNA提取和定量實時PCR（qRT-PCR） 通過RNA提取試劑盒（QIAGEN，上海，中國）提取總RNA，并將1 μg總RNA添加至20 μL的反應系統(tǒng)中。GoScript Reverse Transcription試劑盒（Promega，USA）用于HOTAIR的逆轉(zhuǎn)錄，miR-148a-5p通過莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄（QIAGEN，Shanghai，China）。 GAPDH和U6作為內(nèi)參。引物序列如下：

miR-148a-3p，上游，5′-GCTAGCCTCCGAAGCAAACAATGAAA-3′，下游，5′-AAGCTTCGTCTACAAGGACTAACCGAAA-3′；

SRPK2，上游，5′-AGCTGGGATTATAGGCGCAT-3′，下游，5′-TTGTTAGGGGAGGGAGCTTG-3′；

Vimentin， 上 游 ，5′-CATTGAGATTGCCACCTAC-3′，下游，5′-CGTTGATAACCTGTCCATC-3′；

E-cadherin，上游，5′-AGAACGCATTGCCACATACA-3′，下游，5′-GAGGATGGTGTAAGCGATGG-3′；

N-cadherin，上游，5′-ATGAAAGACCCATCCAC G-3′,下游,5′-CCTGCTCACCACCACTA-3′；

GAPDH：上游，5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′；

U6：上游，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR 反應進行40個循環(huán)，并使用2-ΔΔCt方法計算RNA相對表達。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析（Western blot） 使用RIPA裂解液裂解CRC細胞以獲得總蛋白。每個樣本40μg總蛋白分別加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）的樣本孔中進行凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，Millipore，USA）上。用0.5%牛血清白蛋白封閉具有印跡蛋白的膜2h，然后用抗E-cadherin抗體（1∶1500，Cell Signaling Technology（CST），USA），抗 N-cadherin 抗體（1：1 500，CST，USA），抗 Vimentin 抗體（1∶1 500，CST，USA），抗 SRPK2 抗體 （1∶1 500，R&D Systems，USA） 或抗-β-actin 抗體（1∶3 000，CST，USA），4℃過夜孵育。洗滌膜3次并在室溫下用稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶2 500，CST，USA）孵育2 h。使用化學發(fā)光檢測試劑盒（Millipore，USA）檢測免疫反應性蛋白質(zhì)條帶。通過G-Box系統(tǒng)（Syngene，USA）獲得圖像并通過Image J軟件（美國國立心理健康研究所，USA）進行分析。

1.7 統(tǒng)計學分析 使用t檢驗或單因素方差分析（ANOVA）分析連續(xù)數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均使用Statistic Package for Social Science軟件（SPSS 19.0，USA）和GrapPad Prism（GraphPad Software，Version 5.0，USA）進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。每個實驗均進行了3次獨立實驗。

2 結(jié)果

2.1 miR-148a-3p結(jié)腸癌細胞系中低表達，SRPK2在結(jié)腸癌細胞系中高表達 首先檢測了人結(jié)腸癌細胞中與人正常結(jié)直腸粘膜細胞FHC中miR-148a-3p及SRPK2的表達情況。結(jié)果顯示，相對于FHC，結(jié)腸癌細胞系 HCT-116，SW480，LOVO和 SW620中 miR-148a-3p 表達降低（P＜0.05）（圖 1a）。相反的，SRPK2 mRNA及蛋白在結(jié)腸癌細胞系中高表達（P＜0.05）（圖 1b，1c）。在接下來的實驗中，筆者選擇HCT-116和SW480兩種細胞進行實驗。

圖1 MiR-148a-3p及SRPK2在結(jié)腸癌細胞系中的表達Fig 1 The expression of miR-148a-3p and SRPK2 in colon cancer cell lines

2.2 miR-148a-3p抑制結(jié)腸癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移 為了檢測miR-148a-3p對結(jié)腸癌細胞遷移及侵襲能力的影響，筆者進行了劃痕試驗和transwell試驗。使用 miR-148a-3p mimic，miR-148a-3p inhibitor及對應NC轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞。如圖2a所示，miR-148a-3p mimic，miR-148a-3p inhibitor可以明顯增加和降低結(jié)腸癌細胞中miR-148a-3p的水平（P＜0.05）。劃痕實驗結(jié)果顯示，過表達miR-148a-3p的結(jié)腸癌細胞相對遷移距離明顯下降 （P＜0.05），而敲低miR-148a-3p的結(jié)腸癌細胞相對遷移距離明顯增加（P＜0.05）（圖 2b）。此外，過表達 miR-148a-3p的結(jié)腸癌細胞穿透基質(zhì)膠的細胞數(shù)目減少（P＜0.05），而敲低miR-148a-3p的結(jié)腸癌細胞穿透基底膜的細胞數(shù)目增加（P＜0.05）（圖2c）。這些結(jié)果提示我們，miR-148a-3p可以影響結(jié)腸癌細胞遷移及侵襲能力。

圖2 MiR-148a-3p對HCT-116及SW480遷移及侵襲能力的影響Fig 2 The effect of miR-148a-3p on migration and invasion of HCT-116 and SW480

2.3 MiR-148a抑制結(jié)腸癌細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要生物學過程之一。為了檢測miR-148a-3p對結(jié)腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，筆者檢測了上皮標志E-cadherin，間質(zhì)標志N-cadherin及Vimentin的表達。結(jié)果如圖3a，3b顯示，過表達miR-148a-3p的結(jié)腸癌細胞E-cadherin 表達增加 （P＜0.05），N-cadherin 及 Vimentin表達降低 （P＜0.05）。而在miR-148a-3p敲低的結(jié)腸癌細胞中，E-cadherin表達明顯降低 （P＜0.05），N-cadherin 和 Vimentin 表達明顯增加（P＜ 0.05）。這些結(jié)果提示，miR-148a-3p可以抑制結(jié)腸癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

圖3 MiR-148a-3p對HCT-116及SW480上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響Fig 3The effect of miR-148a-3p on epithelial-mesenchymal transition of HCT-116 and SW480

2.4 SRPK2是miR-148a-3p的直接靶點 為了闡明miR-148a-3p抑制CRC細胞遷移的潛在機制，筆者使用TargetScan 7.2和miRPathDB數(shù)據(jù)庫預測了miR-148a-3p的可能靶點。預測結(jié)果顯示SRPK2是miR-148a-3p的潛在靶點。為了證明SRPK2是miR-148a-3p的直接靶點，筆者進行了熒光素酶報告實驗。將結(jié)合miR-148a-3p的野生型（Wt）或突變型（Mut）SRPK2序列克隆到 pGL3 Basic載體中（圖 4a），并與miR-148a-3p mimic或miR-148a-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染293T細胞后檢測熒光素酶活性。實驗結(jié)果顯示，miR-148a-3p mimic和Wt-SRPK2共轉(zhuǎn)染的293T細胞中熒光素酶活性明顯下降（P＜0.05）（圖 4b）。相反，當 Wt-SRPK2和 miR-148a-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染到293T細胞中時，熒光素酶活性增加（P＜0.05）（圖 4b）。這個結(jié)果提示，SRPK2 可能是miR-148a-3p的直接作用靶點。

圖4 熒光素酶報告實驗驗證SRPK2是miR-148a-3p的直接作用靶點Fig 4 Verification of SRPK2 as a direct target of miR-148a-3p using the luciferase reporter assay

2.5 MiR-148a-3p抑制結(jié)腸癌細胞系中SRPK2的表達 為了證實miR-148a-3p對CRC細胞中SRPK2表達的影響，筆者進一步檢測了miR-148a-3p mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染的CRC細胞中SRPK2的mRNA和蛋白質(zhì)表達。結(jié)果顯示，用miR-148a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞后，SRPK2的mRNA及蛋白水平明顯增加（P＜0.05）（圖 5a，5b）。相反的，用 miR-148a-3p mimic轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞后，SRPK2的mRNA及蛋白表達明顯降低（P＜0.05）（圖 5a，5b）。這些結(jié)果提示，miR-148a-3p可以直接影響SRPK2表達。

圖5 MiR-148a-3p對HCT-116及SW480中SRPK2表達的影響Fig 5 The effect of miR-148a-3p on the expression of SRPK2 in HCT-116 and SW480

3 討論

MiRNA的失調(diào)與幾乎所有類型的疾病相關，包括腫瘤[24]。許多研究已經(jīng)證明miRNA失調(diào)在CRC發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[25]。目前，miRNA的預后價值和潛在的作用機制仍有待進一步研究[26]。MiR-148a-3p在結(jié)腸癌的低表達可能與結(jié)腸癌的發(fā)生與不良預后有關[27-28]。但是目前miR-148a-3p在結(jié)腸癌中的調(diào)控作用還不完全明確。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p在結(jié)腸癌細胞系中低表達。過表達miR-148a-3p可以抑制結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲能力，同時抑制結(jié)腸癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。熒光素報告實驗結(jié)果顯示SRPK2是miR-148a-3p的直接作用靶點。在結(jié)腸癌細胞中過表達miR-148a-3p可以抑制SRPK2的表達。MiR-148a-3p可能通過SRPK2來影響結(jié)腸癌的進展。

MiRNA的失調(diào)與CRC的發(fā)生發(fā)展及耐藥性的產(chǎn)生關系密切。例如，miR-34c-5p高表達腫瘤患者預后差，可以抑制結(jié)腸癌細胞的凋亡[29]。MiR-92b-3p可以促進結(jié)腸癌細胞增殖，轉(zhuǎn)移及侵襲[30]。然而，并不是所有的miRNA均表現(xiàn)出腫瘤促進作用，很多研究已經(jīng)顯示有些miRNA在抑制腫瘤過程中起到重要的作用。例如，miR-233可以抑制結(jié)腸癌的增殖及促進凋亡[31]。MiR-206可以調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的抗性[32]。MiR-153可以抑制IDO1表達從而增強CART的治療效果。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p在結(jié)腸癌細胞中低表達，過表達miR-148a-3p可以明顯抑制結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移及侵襲能力。同時，miR-148a-3p過表達可以抑制結(jié)腸癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

許多研究已經(jīng)證明，miRNA主要通過調(diào)控其靶基因的表達發(fā)揮調(diào)控作用。例如，miR-218可以通過靶向cFLIP誘導結(jié)腸癌細胞凋亡[33]。本研究中，筆者通過TargetScan 7.2和miRPathDB數(shù)據(jù)庫預測了miR-148a-3p的潛在靶點，結(jié)果提示SRPK2是miR-148a-3p的潛在靶點。熒光素酶活性實驗提示，SRPK2是miR-148a-3p的直接靶點。但是，由于miRNA可能具有多個靶點，通過作用于不同的靶點可發(fā)揮不同的生物學作用。因此miR-148a-3p在結(jié)腸癌中的作用還需要進一步的探究。

SRPK2主要參與介導哺乳動物細胞中前體mRNA剪接因子的相互作用和定位[34]。近期的研究顯示，SRPK2與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移相關[23,35]。但是，SRPK2在腫瘤細胞中的表達調(diào)控機制還不完全清楚。腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要過程之一。為了進一步探究miR-148a-3p調(diào)控SRPK2的表達是否影響結(jié)腸癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，分別上調(diào)或者下調(diào)結(jié)腸癌細胞中miR-148a-3p的表達水平。在結(jié)腸癌細胞中過表達miR-148a-3p時，SRPK2 mRNA及蛋白表達降低，腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲能力受抑制。相反的，結(jié)腸癌中miR-148a-3p敲低時，SRPK2 mRNA及蛋白表達增加，結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移及侵襲能力增強。因此筆者推測，miR-148a-3p可能通過影響SRPK2的表達，影響結(jié)腸癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此，進一步通過Western blot檢測了結(jié)腸癌細胞中上皮標志E-cadherin及間質(zhì)標志N-cadherin和Vimentin的表達。結(jié)果顯示，miR-148a-3p過表達，SRPK2表達降低的同時，E-cadherin表達增加，而N-cadherin和Vimentin表達降低。相反的，miR-148a-3p敲低時，SRPK2表達增加，上皮標志E-cadherin表達降低，間質(zhì)標志N-cadherin和Vimentin表達增加。這些結(jié)果提示，miR-148a-3p可能通過調(diào)節(jié)SRPK2的表達，影響結(jié)腸癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，改變結(jié)腸癌細胞的遷移及侵襲能力。

綜上所述，筆者發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p在抑制結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移及侵襲過程中起到了重要的作用，發(fā)現(xiàn)了miR-148a-3p調(diào)控結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移及侵襲的新機制。結(jié)果顯示miR-148a-3p過表達可以通過降低SRPF2表達抑制結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲。miR-148a-3p/SRPK2可能參與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控，可能成為治療結(jié)腸癌的新靶點。