雙氫楊梅樹皮素與4種抗生素聯(lián)合對多重耐藥金黃色葡萄球菌體外抗菌作用研究

黃郁梅 洪正善 陳海鵬 楊柯 曾春暉

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530001)

抗菌藥物的濫用導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生，在某些條件下易使致病菌毒力增強(qiáng)而破壞宿主的正常菌群，其不合理使用則易引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)、二重感染等問題[1]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)是引起多種感染的重要致病菌，由于在臨床及獸醫(yī)用藥上抗生素的亂用及濫用，導(dǎo)致SA出現(xiàn)耐藥，甚至呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，使臨床治療及獸醫(yī)用藥治療難度加大，現(xiàn)已成為治療的重大難題之一。藤茶[Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang]系葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄的嫩莖葉，為瑤族民間藥用的草藥之一[2]，性涼味甘、淡，具有清熱解毒、消腫止痛、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨等功效，主治感冒風(fēng)熱、咽喉腫痛、黃疸型肝炎、急性結(jié)膜炎等[3]。其主要化學(xué)成分是黃酮類化合物，其中以雙氫楊梅樹皮素(ampelopsis,APS)含量最高，高達(dá)38%[4]。又被稱之為雙氫楊梅素、白蘞素、蛇葡萄素等。體外抗菌研究結(jié)果表明：APS對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)、標(biāo)準(zhǔn)SA等臨床常見致病菌均有極高的抗菌活性，且優(yōu)于鹽酸黃連素，表明APS有較強(qiáng)的抑制或殺滅細(xì)菌作用[5]。然而，APS對多重耐藥SA的體外抗菌及抗菌機(jī)制研究相對較少，為能尋找一種對細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥且能恢復(fù)耐藥菌株對抗生素敏感性的抗菌藥物，本實(shí)驗(yàn)采用多步誘導(dǎo)法和瓊脂平皿二倍稀釋法，以青霉素為對照，通過測定誘導(dǎo)前后的MIC值，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)SA是否容易對APS產(chǎn)生耐藥；采用棋盤稀釋法測定單用APS、青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、氯霉素對多重耐藥SA的MIC、MBC、及APS分別與這4種抗生素聯(lián)用對多重耐藥SA的FICI，評(píng)價(jià)APS與這4種抗生素聯(lián)用效果，考察APS分別與4種抗生素聯(lián)用對多重耐藥SA的抗菌作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌(ATCC25923)由廣西中醫(yī)大學(xué)食品教研室提供；1株臨床分離多重耐藥金黃色葡萄球菌由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，并鑒定其對青霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氯霉素均耐藥。

1.2 主要藥物和試劑

APS：由廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室提供，系從廣西藤茶[Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang]莖葉中分離、純化，為灰白色粉末，純度≥98%，結(jié)構(gòu)式如圖1。

圖1 APS化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structural formula of APS

實(shí)驗(yàn)用APS配制：APS加50μL/mL DMSO助溶后，用無菌生理鹽水稀釋到所需濃度，再用0.22μmol/L針式過濾器過濾備用。

注射用青霉素鈉(桂林南藥股份有限公司 151107)；硫酸慶大霉素注射液(河南潤弘制藥股份有限公司，批號(hào)：1707101)；四環(huán)素片(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：170201)；氯霉素注射液(國藥集團(tuán)容生制藥有限公司，批號(hào)：1708313)；氯化三苯四氮唑(TTC)(中國華東師范大學(xué)化工廠，批號(hào)：20101026)；水解酪蛋白胨(MH)肉湯(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號(hào)：3105299)；二甲基亞砜(DMSO)(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20150105)；營養(yǎng)瓊脂(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：1001079)；MHB培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：1608231)；瓊脂(Beijing Solarbio，批號(hào)：1295D0330)。

1.3 主要儀器

SW-CJ-1F型潔凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；HVE-50型高壓滅菌鍋(廣州市深華生物技術(shù)有限公司)；CD-UPT型純水儀(成都越純科技有限公司)；SQP型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；Mini-15K型高速離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌液配制

挑取培養(yǎng)好的菌落1～2個(gè)接種到3mL MH肉湯中，37℃振搖過夜。

2.2 APS誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)SA耐藥實(shí)驗(yàn)

2.2.1 誘導(dǎo)濃度確定

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)研究，可知APS對標(biāo)準(zhǔn)SA的MIC為125μg/mL，青霉素對標(biāo)準(zhǔn)SA的MIC為0.0244μg/mL，故選擇對標(biāo)準(zhǔn)SA有一定抗菌效果而又不完全抑制細(xì)菌生長的1/2MIC濃度作為初始誘導(dǎo)濃度。

2.2.2 藥物配置

稱取一定量APS，注射用青霉素鈉，用無菌生理水配制成一定濃度的溶液，過濾除菌即分別為藥液初濃度，根據(jù)倍比稀釋，將藥液用無菌生理鹽水稀釋成所需濃度。

2.2.3 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)[6]

吸取培養(yǎng)過夜菌液，加入藥液，混勻，使其藥物終濃度為1/2MIC，37℃振搖培養(yǎng)24h后，1500r/min，離心5min，棄上清液，調(diào)菌液濃度至106CFU/mL，再分別吸取100μL稀釋菌液接種于不含藥MHB瓊脂、1/2MIC濃度的含藥MHB瓊脂及MIC濃度的含藥MHB瓊脂平皿中，37℃培養(yǎng)24h觀察有無細(xì)菌生長；并設(shè)立空白對照，不加誘導(dǎo)藥液，進(jìn)行相同操作；根據(jù)MHB瓊脂培養(yǎng)皿中細(xì)菌是否有細(xì)菌生長情況，調(diào)整誘導(dǎo)藥物濃度及含藥瓊脂濃度，若不含藥和含藥MHB瓊脂培養(yǎng)皿均有細(xì)菌生長，則挑取含藥瓊脂培養(yǎng)皿中單菌落接種至 MH肉湯中振搖培養(yǎng)過夜后， 倍比增加誘導(dǎo)藥物濃度繼續(xù)誘導(dǎo)；若不含藥MHB瓊脂培養(yǎng)皿有細(xì)菌生長，而含藥MHB瓊脂培養(yǎng)皿中無細(xì)菌生長，則藥物濃度不變繼續(xù)誘導(dǎo)；若不含藥和含藥MHB瓊脂培養(yǎng)皿均無細(xì)菌生長，則實(shí)驗(yàn)結(jié)束，說明藥物不會(huì)誘導(dǎo)耐藥產(chǎn)生。

2.3 APS分別與4種抗生素聯(lián)用對多重耐藥SA體外抗菌效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 APS及4種抗生素單用對多重耐藥SA的MIC、MBC測定[7]

藥物配制同“2.2.2”項(xiàng)，按棋盤稀釋法將藥物稀釋成9個(gè)濃度。藥物終濃度見表1。將培養(yǎng)過夜菌液用無菌MH肉湯調(diào)菌濃度至106CFU/mL。每孔加入100μL菌液、100μL藥液，并設(shè)立對照孔，37℃孵育18～24h后。每孔加入10mg/mL(1%)氯化三苯四氮唑(TTC)5μL，37℃孵育4h后觀察，有細(xì)菌生長孔呈紅色，不顯紅色的最低藥物濃度為藥物對待測菌的MIC。分別取藥物MIC以上未見細(xì)菌生長的各孔菌液50μL接種到不含藥物的營養(yǎng)瓊脂平皿上，置于37℃培養(yǎng)過夜，觀察有無細(xì)菌生長。平皿培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落者作為該藥的最低殺菌濃度(MBC)。

表1 各藥物濃度Tab.1 Drug concentration

2.3.2 APS聯(lián)用抗生素對受試菌的FICI測定

藥物配制同“2.2.2”項(xiàng)，按棋盤稀釋法將藥物配成6個(gè)濃度。各藥物終濃度見表2。將培養(yǎng)過夜菌液用無菌MH肉湯調(diào)濃度至106CFU/mL。每孔加入100μL菌液、100μL藥液，并設(shè)立對照空，37℃孵育18～24h后。每孔加入10mg/mL(1%)氯化三苯四氮唑(TTC)5μL，37℃孵育4h后觀察，有細(xì)菌生長孔呈紅色。藥物體外的相互作用方式以協(xié)同抗菌指數(shù)(FICI)來判定。FICI為每一種藥物聯(lián)合抑菌時(shí)所需最低抑菌濃度(MIC)與單用時(shí)MIC的比值，F(xiàn)ICI為兩種藥物部分抑菌濃度之和。FICI的計(jì)算與判段標(biāo)準(zhǔn)分別讀取兩點(diǎn)：一為A藥聯(lián)用的最低MIC；二為B藥聯(lián)用的最低MIC，分別記為MICA及MICB。兩藥單用時(shí)的MIC分別記為A、B。計(jì)算公式為：

FICI=MICA/A+MICB/B。當(dāng)FICI≤0.5為協(xié)同作用；FICI=0.5～1.0為相加作用；FICI=1.0～2.0為無關(guān)作用；FICI>2.0為拮抗作用。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 APS誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)SA耐藥實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APS與青霉素分別誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)SA 288h后，誘導(dǎo)菌株對32×MIC濃度下的青霉素產(chǎn)生耐藥，對APS未產(chǎn)生耐藥。青霉素在1/2MIC初濃度下誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)SA24h后，菌株出現(xiàn)MIC濃度耐藥；誘導(dǎo)濃度增加至MIC濃度繼續(xù)誘導(dǎo)48h后，出現(xiàn)2×MIC濃度耐藥；誘導(dǎo)濃度增加至4×MIC濃度誘導(dǎo)120h后，出現(xiàn)4×MIC濃度耐藥；誘導(dǎo)濃度增加至8×MIC濃度繼續(xù)誘導(dǎo)72h后，出現(xiàn)8×MIC濃度耐藥；誘導(dǎo)濃度增加至16×MIC濃度繼續(xù)誘導(dǎo)24h后，出現(xiàn)32×MIC濃度耐藥。而APS在1/2MIC初濃度下誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)SA 288h，未見耐藥菌株產(chǎn)生(表3和圖1)。

表2 各藥物單用及聯(lián)用終濃度Tab.2 The final concentration of each drug and its combination

表3 APS及青霉素誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌耐藥/(μg/mL)Tab.3 APS and Penicillin induced resistance to standard Staphylococcus aureus/(μg/mL)

圖1 APS及青霉素誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌耐藥Fig.1 APS and penicillin induced resistance to standard Staphylococcus aureus

3.2 APS分別與4種抗生素聯(lián)用對多重耐藥SA抗菌效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 APS及4種抗生素單用對多重耐藥SA的MIC、MBC測定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單用APS、青霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氯霉素對多重耐藥SA的MIC分別為125、29.25、40、40和78.125μg/mL，MBC分別為125、117、320、160和>1250μg/mL。提示APS對多重耐藥SA具有殺菌作用，青霉素、四環(huán)素、慶大霉素對多重耐藥SA高濃度殺菌，低濃度抑菌，氯霉素對多重耐藥SA具有抑菌作用(表4)。

3.2.2 APS分別與4種抗生素聯(lián)用對多重耐藥SA的FICI測定結(jié)果

表4 APS及抗生素單用對多重耐藥SA的MIC、MBC結(jié)果Tab.4 The MIC and MBC results of APS and antibiotics alone against multidrug resistant SA

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APS在單用MIC濃度下，分別與青霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氯霉素聯(lián)用對多重耐藥SA的作用，隨著APS聯(lián)用濃度不同而表現(xiàn)出不同的抗菌效果。APS與青霉素聯(lián)用表現(xiàn)出協(xié)同或相加作用，以15.625μg/mL APS聯(lián)用青霉素對多重耐藥SA作用效果最佳，表現(xiàn)出協(xié)同抗菌作用，青霉素合用劑量降低為單用1/4；APS與四環(huán)素聯(lián)用表現(xiàn)出協(xié)同或協(xié)同作用，以31.25μg/mL APS聯(lián)用四環(huán)素對多重耐藥SA作用效果最佳，表現(xiàn)出協(xié)同抗菌作用，四環(huán)素合用劑量降低為單用1/8；APS與慶大霉素聯(lián)用表現(xiàn)出無關(guān)或相加作用，以62.5μg/mL APS聯(lián)用慶大霉素效果最佳，表現(xiàn)出相加抗菌作用，慶大霉素合用劑量降低為單用1/32；APS與氯霉素聯(lián)用表現(xiàn)出無關(guān)或相加作用，以62.5μg/mL APS聯(lián)用氯霉素效果最佳，表現(xiàn)出相加抗菌作用，氯霉素合用劑量降低為單用1/16。結(jié)果提示APS與4種抗生素聯(lián)用可恢復(fù)多重耐藥SA對抗生素的敏感性(表5)。

表5 APS聯(lián)用抗生素對多重耐藥SA的FICI結(jié)果Tab.5 The FICI results of multidrug resistant SA by APS in combination with antibiotics

3 討論

金黃色葡萄球菌在臨床及畜牧業(yè)造成的感染日益加重，是臨床常見的重要致病菌。近年，其耐藥率呈逐年上升趨勢，使得SA感染的治療難度大大加深?？股乜捎糜谥委熑撕蛣?dòng)物因細(xì)菌感染而引發(fā)的疾病。但是，隨著其使用量不斷增多，細(xì)菌耐藥性問題也不斷凸顯，在臨床及畜牧業(yè)中被廣泛關(guān)注[8-9]。抗生素不僅能夠預(yù)防和治療細(xì)菌、真菌感染所引發(fā)的疾病，也能夠殺滅相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞，應(yīng)用價(jià)值較高[10]。其中以青霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氯霉素分別為β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類抗生素的典型代表，具有其衍生物共性。細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生使抗生素的使用劑量大大增加，而其不良反應(yīng)跟抗生素的使用量成正相關(guān)， 隨劑量增加不良反應(yīng)加大，從而降低了抗生素的使用效率及療效，也限制了抗生素的使用范圍。而聯(lián)合用藥不但可以減少抗生素的使用量，降低藥物的不良反應(yīng)、提高療效，還可以治療細(xì)菌引起的混合感染、重癥感染，并且能延緩甚至避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。故研究并開發(fā)一種不易誘發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性又能恢復(fù)耐藥菌株對抗生素敏感性，或又能對細(xì)菌有殺死或抑制作用的抗菌藥物迫在眉睫。

許多研究發(fā)現(xiàn)[11-14]，中藥成分毒副作用少，且具有較強(qiáng)的抗菌作用，又不易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥耐藥，在我國資源豐富，與抗生素聯(lián)用能夠減少其使用劑量，提高抗生素療效的作用。又有研究[15-16]表明：標(biāo)準(zhǔn)SA對青霉素極為敏感，但又易誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)SA產(chǎn)生耐藥，故本實(shí)驗(yàn)以青霉素誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)SA作為對照，觀察APS誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)SA是否易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥，在誘導(dǎo)相同時(shí)間內(nèi)，誘導(dǎo)菌出現(xiàn)32×MIC青霉素耐藥，而APS耐藥情況與原菌株一致，表明與青霉素誘導(dǎo)耐藥相比，APS不易誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)SA產(chǎn)生耐藥性。并通過研究APS分別聯(lián)合青霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氯霉素4種抗生素對多重耐藥SA進(jìn)行體外抗菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)APS在單用MIC以下濃度與這4種抗生素聯(lián)用能恢復(fù)抗生素對多重耐藥SA的敏感性，從而降低抗生素的使用劑量。由此根據(jù)這4種抗生素與APS的聯(lián)用效果推及其衍生物聯(lián)用作用效果，由此及彼，為提高抗生素的使用效率提供有效依據(jù)，為研究出不易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥且對細(xì)菌具有較強(qiáng)抗菌活性或能恢復(fù)抗生素敏感性的中藥抗菌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為提高抗生素在臨床及畜牧業(yè)的使用效率奠定基礎(chǔ)。