DDX6突變體的構(gòu)建

周焱琳 唐翠蘭 于秀芝

RNA解旋酶在多條RNA代謝通路中起到調(diào)控作用。在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中，它們可與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路、蛋白相互作用，參與調(diào)控致癌基因或抑癌基因的表達(dá)，參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。人類(lèi)細(xì)胞表達(dá)約70種RNA解旋酶，大多數(shù)屬于超家族2（superfamily 2，SF2）[1-2]。SF2 包括了 DEAD-box RNA 解旋酶（DEAD-box RNA Helicase，DDX RNA Helicase，DDX）蛋白家族，DDX蛋白是一類(lèi)在進(jìn)化中高度保守的ATP依賴(lài)的RNA解旋酶，廣泛分布于人體的各個(gè)組織和器官中，包括肝、腎、心臟、結(jié)腸、闌尾、皮膚、唾液腺等等（數(shù)據(jù)來(lái)自 GioGPS，ID：1656）。它參與調(diào)節(jié) RNA的多個(gè)過(guò)程，包括mRNA前體加工、RNA降解、翻譯啟動(dòng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[3]。其家族蛋白的結(jié)構(gòu)分為N端區(qū)、C端區(qū)和核心區(qū)。核心區(qū)位于N端區(qū)和C端區(qū)之間，包含9個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，包括該家族特征性氨基酸序列，即天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸（D-E-AD）。由于家族成員在N端區(qū)和C端區(qū)結(jié)構(gòu)域存在差異，導(dǎo)致其功能也出現(xiàn)了差別。有研究表明，家族中的DDX6在許多惡性細(xì)胞系中高度表達(dá)，其表達(dá)與癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化密切相關(guān)。DDX6可在大腸癌、肝癌、胃癌中高度表達(dá)。它可以通過(guò)增加胃癌細(xì)胞中c-Myc表達(dá)來(lái)促進(jìn)胃癌進(jìn)展[4]。此外，它對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞瘤也有促進(jìn)作用[5]。沉默DDX6，可以抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞體外和體內(nèi)的增殖[6]。人源DDX6又名RCK/p54，可從B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系RC-K8中克隆而來(lái)，其蛋白分子量為54kDa[7]。為了進(jìn)一步明確DDX6在癌癥進(jìn)展過(guò)程中的作用，我們構(gòu)建了DDX6突變體，使其失去解旋酶活性，或同時(shí)失去解旋酶和ATP酶活性，以期在后期實(shí)驗(yàn)中深入研究其生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材 料 質(zhì)粒載體和菌株：DDX6-WT和pENTER購(gòu)自維真生物科技公司（批號(hào)CH867745、PD88001）。細(xì)胞株：人肝癌Huh7細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試 劑 DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Simgen（8301010/8301020）；QIAGEN Plasmid Midi Kit 和QIAquick Gel Extraction Kit購(gòu)自QIAGEN公司（批號(hào)12145、28704），PCR引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。Pro Ligation-Free Cloning Kit購(gòu)自 abm 公司（批號(hào) E086）。PrimeSTAR Max DNA Polymerase，DL15，000 DNA Marker和 DL5000 DNA Marker購(gòu)自 Takara公司（批號(hào) R045Q、3582Q、3428Q）。瓊脂糖購(gòu)自 BIOWEST（批號(hào) 111860）。LB 肉湯培養(yǎng)基、LB肉湯瓊脂購(gòu)自生工生物（批號(hào)A507002-0250、A507003-0250）。Pierce BCA Protein Assay Kit、AsiSI和 MLμL 購(gòu)自 Thermo Fisher Scientific （批 號(hào) 23225、FD2094、FD0564）。Lipofectine 3000和P3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen（批號(hào)L3000015）。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司（批號(hào)SH30022.01）。胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自 Gibco（批號(hào)10099141、31985062）。0.25%胰酶+0.02%EDTA 溶液購(gòu)自吉諾生物（批號(hào)GNM25200）。SDS-PAGE凝膠配置試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)（批號(hào)P0012A）。Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse、Dimethyl sμLfoxide （DMSO） 購(gòu) 自 sigma-Aldrich（批號(hào) F1804、V900090）。GAPDH（D16H11）XP Rabbit mAb購(gòu)自Cell Signaling Technology（批號(hào)2118S）。Goat Anti-Mouse IgG （H+L）HRP 和 Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP購(gòu)自聯(lián)科生物（批號(hào)70-GAM007、70-GAR007）。

1.3 方 法

1.3.1 突變質(zhì)粒的構(gòu)建 DDX6-EQ突變質(zhì)粒的構(gòu)建：以DDX6-WT為模板，使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase和突變引物擴(kuò)增整個(gè)模板。DDX6-EQ 突變上游引物（5’-3’）：TCCAGATGATAGTATTGGATCAGGCAGATAAGTTGCTGTCACAGGA；下游引物（5’-3’）TGACAGCAACTTATCTGCCTGATCCAATACTATCATCTGGACATGA。擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，回收產(chǎn)物使用Pro Ligation-Free Cloning Kit試劑盒進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物命名為DDX6-EQ。DDX6-△C突變質(zhì)粒的構(gòu)建：以DDX6-WT為模板，使用AsiSI/MLμL進(jìn)行雙酶切，獲取約1.4kb的目的片段和約7.5kb的載體片段。使用突變引物擴(kuò)增目的片段，DDX6-△C突變上游引物（5’-3’）：TCCGGTACCGAGGAGATCTGCCGCCGCGATCGCCATGAGCACGGCCAGAACAGAGAAC；下游引物（5’-3’）：CCTTATAATCCTCGAGCGGCCGCGTACGCGTCAGGTTAATCTCATAGGG。擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收約0.9kb的片段，回收產(chǎn)物和載體片段使用Pro Ligation-Free Cloning Kit試劑盒進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物命名為DDX6-△C。

1.3.2 突變體的篩選與序列分析 將突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡納抗性的LB平板上涂板，37℃過(guò)夜后，挑取單菌落于37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒。將克隆子送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果使用NCBI網(wǎng)站的BLAST平臺(tái)進(jìn)行核實(shí)。

1.3.3 突變體酶切鑒定 用AsiSI和MLμL對(duì)突變后的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。起反應(yīng)體系為：質(zhì)粒DNA 1000ng，AsiSI 0.8μL，MLμL 0.8μL，10 ×Fastdigest buffer 2μL，ddH2O 補(bǔ)足 30μL。

1.3.4 細(xì)胞復(fù)蘇 溶液氮罐中取出Huh7細(xì)胞，37℃水浴，迅速融化細(xì)胞懸液。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、含5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。每1天換一次液，每?jī)商煊煤?.25%胰酶+0.02%EDTA溶液的消化液進(jìn)行傳代。

1.3.6 細(xì)胞凍存 待細(xì)胞生長(zhǎng)到一定密度后，消化重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL無(wú)菌離心管后，以800rpm的速度室溫離心3min。離心后去上清，加入 700μL DMEM，200μL 胎牛血清，100μL DMSO，吹打數(shù)次重懸后，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌細(xì)胞凍存管中，于液氮中保存。

1.3.7 轉(zhuǎn) 染 將Huh7細(xì)胞在6孔板中以0.5×106個(gè)/孔的密度鋪板，24h后，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)50%～80%時(shí)，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，將舊培養(yǎng)基棄去，加入新的血清培養(yǎng)基。將所需要的轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒按照實(shí)驗(yàn)量分別加入相應(yīng)的Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕柔吹打混勻，室溫孵育5min。將轉(zhuǎn)染混合物均勻逐滴加入細(xì)胞中，孵育48h。

1.3.8 蛋白質(zhì)提取與蛋白印跡（Western Blot）分析使用RIRP裂解液提取蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，加入5×SDS Loading dye沸水浴10min變性。使用SDS-PAGE凝膠配置試劑盒配膠。將制備好的蛋白樣本加入膠中，恒壓電泳90V，當(dāng)溴酚藍(lán)前緣達(dá)到分離膠時(shí)，調(diào)節(jié)恒壓電泳至120V，電泳直至溴酚藍(lán)達(dá)到膠底部。電泳結(jié)束后立即轉(zhuǎn)膜，恒壓電流330V，1h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后配5%BSA封閉液，室溫封閉2h，可適當(dāng)延長(zhǎng)。根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)和目的蛋白信號(hào)強(qiáng)弱，用5%BSA稀釋一抗，一抗4℃孵育過(guò)夜。次日回收一抗稀釋液，TBST洗膜三次，每次10min后，根據(jù)二抗說(shuō)明書(shū)和目的蛋白信號(hào)強(qiáng)弱，以合適比例稀釋二抗，二抗室溫孵育1h。再用TBST洗膜三次，每次10min后，采用ECL發(fā)光。觀察目的蛋白條帶強(qiáng)弱趨勢(shì)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 突變質(zhì)粒的構(gòu)建與酶切鑒定 DDX6-WT由483個(gè)氨基酸組成,其C端帶有Flag和His標(biāo)簽蛋白。根據(jù)突變位置，分別命名無(wú)解旋酶活性的突變體和同時(shí)無(wú)ATP酶、解旋酶活性的突變體為DDX6-EQ（堿基序列第739位堿基由G突變?yōu)镃，導(dǎo)致蛋白質(zhì)序列第247位的谷氨酸（Glu）突變?yōu)楣劝滨０罚℅ln）），和DDX6-△C（C端截去編碼氨基酸的549個(gè)堿基，導(dǎo)致C端截去183個(gè)氨基酸）。突變體模式見(jiàn)插頁(yè)圖1。在表達(dá)載體pENTER的多克隆酶切位點(diǎn)上，DDX6-WT片段兩端對(duì)應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)為AsiSI和MLμL。使用AsiSl/MLμL雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到一條約7.5kb的載體pENTER片段和目的片段。目的片段分別約為1.4kb，1.4kb 和 0.9kb，見(jiàn)插頁(yè)圖 2。

2.2 序列分析 將突變體送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，將突變序列在BLAST中進(jìn)行比較，在Chromas中核實(shí)，達(dá)到預(yù)期設(shè)計(jì)，見(jiàn)插頁(yè)圖3。

2.3 細(xì)胞水平蛋白驗(yàn)證 在蛋白質(zhì)水平使用Western Blot檢測(cè)。將DDX6-WT和突變體分別轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞后，孵育48h，收獲細(xì)胞蛋白。Western Blot檢測(cè)可見(jiàn) DDX6-WT、DDX6-EQ、DDX6-△C 蛋白。DDX-WT和DDX6-EQ蛋白分子量為54kD，DDX6-△C蛋白分子量為34kD。符合預(yù)期，提示能正常表達(dá)相對(duì)應(yīng)的蛋白，再次證實(shí)DDX6突變體構(gòu)建成功，見(jiàn)插頁(yè)圖4。

3 討論

RNA在許多細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括mRNA的剪切，核糖體生物合成和翻譯。RNA分子擁有特異性二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，盡管這些結(jié)構(gòu)在調(diào)節(jié)RNA功能上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用并引導(dǎo)著基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，mRNA仍需要具有恰當(dāng)結(jié)構(gòu)的輔助分子來(lái)發(fā)揮其功能。特別是復(fù)雜的mRNA結(jié)構(gòu)的解旋，這對(duì)于mRNA與核糖體結(jié)合進(jìn)而翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)非常重要。

RNA解旋酶被認(rèn)為具有展開(kāi)雙鏈RNA（doublestranded RNA，dsDNA）的能力，或通過(guò)ATP水解釋放能量來(lái)修飾RNA-RNA之間的相互作用[8-9]。DDX家族蛋白表現(xiàn)出典型的SF2的特征。在SF2中，與解旋功能相關(guān)的核心氨基酸殘基構(gòu)成共價(jià)連接的球狀結(jié)構(gòu)域，分別命名為區(qū)域1（domino 1，D1）和區(qū)域2（domino 2，D2），表現(xiàn)為 RecA-ATP 酶折疊。D1位于N端，包含基序Q、基序Ⅰ、基序Ⅰa、基序Ⅰb、基序Ⅱ和基序Ⅲ。D2位于C端，包含基序Ⅳ、基序Ⅴ、基序Ⅵ?；颌窈突颌蚰芘c三磷酸腺苷（nucleoside triphosphate，NTP）和鎂離子結(jié)合，調(diào)節(jié)NTP水解的功能。在這兩基序中間的基序Ia和基序Ib則能調(diào)節(jié)核酸的結(jié)合?；颌笈cNTP的水解活動(dòng)相關(guān)。基序Ⅳ、和基序Ⅴ與RNA的結(jié)合相關(guān)?；颌鰟t涉及了與NTP水解有關(guān)的構(gòu)象變化[3]。

有臨床試驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，28例直腸癌患者中，54%的患者表現(xiàn)出DDX解旋酶過(guò)度表達(dá)。DEAD box蛋白MrDb是c-Myc基因的一個(gè)靶蛋白，可以顯著地促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究證實(shí)，RCK/p54參與了癌基因如c-Myc、E1A或其他生長(zhǎng)相關(guān)基因的mRNA翻譯，這可能是因?yàn)镽CK/p54本身與癌基因c-Myc、E1A或其他生長(zhǎng)相關(guān)基因等相關(guān)聯(lián)[10]。MicroRNA（miRNA）在蛋白質(zhì)合成的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，在miRNAs誘導(dǎo)的的沉默復(fù)合體（miRNA-induced silencing complex，miRISC） 的影響下，miRNA可靶向mRNA的翻譯，加快mRNA的凋亡。mRNA的降解起始于脫腺苷酶復(fù)合物CCR4-NOT縮短多聚A尾，隨后5’帽結(jié)構(gòu)被移除，mRNA被核酸外切而降解。CCR4-NOT的組分CNOT1與DDX6可直接結(jié)合。如果打斷DDX-CNOT1之間的結(jié)合，可損傷miRISC介導(dǎo)的人類(lèi)基因沉默[11]。在結(jié)腸癌中，miR NA124能直接靶向DDX6，抑制DDX6的翻譯，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡[12]。DDX家族蛋白eIF4A存在于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起始因子4F（eukaryotic translationinitiation factor 4F，eIF4F）復(fù)合體中，能聯(lián)合p220和帽結(jié)合蛋白eIF4E在翻譯起始中發(fā)揮重要作用。因此，DDX6能夠促進(jìn)基因細(xì)胞mRNA的翻譯、增殖和惡性轉(zhuǎn)移。另外，miR-143和miR-145作為腫瘤抑制因子，被宿主基因NCR143/145調(diào)控，DDX6可以通過(guò)下調(diào)NCR143/145的表達(dá)來(lái)促進(jìn)胃癌的進(jìn)展，在人胃癌樣本中，DDX6表達(dá)量遠(yuǎn)高于正常胃組織[13]。但對(duì)于其功能域具體怎樣發(fā)揮作用尚不清楚。

在本研究中，我們利用引物引入突變，截去DDX6的D2區(qū)域，使其失去ATP酶和解旋酶活性，將該突變體命名為DDX6-△C，或使DEAD區(qū)域上的堿基發(fā)生點(diǎn)突變，使其由編碼谷氨酸變?yōu)榫幋a谷氨酰胺，失去解旋酶活性，將該突變體命名為DDX6-EQ并用Western Blot檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平，這為進(jìn)一步研究DDX6在癌癥進(jìn)展過(guò)程中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1 突變體模式圖

圖 2DDX6-WT、DDX6-EQ、DDX6-△C 雙酶切鑒定

圖 3DDX6-WT、DDX6-EQ、DDX6-△C 序列比較

圖 4 DDX6-WT、DDX6-EQ、DDX6-△C Western Blot鑒定