HvSAPK3基因在‘鳳大麥7號(hào)’抗白粉病中的功能研究

李慶偉，宗英杰，郭 嬌，劉成洪，陸瑞菊，許建華，黃劍華*

(1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，上海201106；3光明種業(yè)有限公司，上海 202171)

為了應(yīng)對(duì)洪澇、干旱、冷、鹽和病蟲害等各種環(huán)境脅迫，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了復(fù)雜的抗逆機(jī)制。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化是細(xì)胞中極其重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后調(diào)控方式，與植物應(yīng)答環(huán)境脅迫信號(hào)機(jī)制有關(guān)[1]。SnRK蛋白是一種高度保守的SerThr蛋白激酶，在植物中廣泛存在。SnRK蛋白激酶可以通過(guò)磷酸化修飾靶蛋白來(lái)調(diào)控植物應(yīng)答脅迫中的多種信號(hào)途徑，在植物脅迫應(yīng)答過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[2]。研究表明，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)差異，SnRK家族的38個(gè)成員可劃分為SnRK123三個(gè)亞家族；其中SnRK1蛋白與酵母SNF1蛋白以及哺乳動(dòng)物AMPK蛋白存在著較高的序列相似性，而SnRK2和SnRK3蛋白是植物所特有的一類蛋白激酶[3]。

研究表明，SnRK2蛋白在植物脫落酸(ABA)脅迫中調(diào)節(jié)參與植物滲透脅迫信號(hào)通路[4]。當(dāng)ABA存在時(shí)，SnRK2蛋白的抑制因子PP2C的活性被抑制，SnRK2蛋白的功能開始作用[5]。活化后的SnRK2蛋白可以通過(guò)磷酸化ABA響應(yīng)元件ABFs來(lái)調(diào)節(jié)ABA響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，還可以作用于下游的一些元件，如離子通道、bZIP轉(zhuǎn)錄因子、NADPH氧化酶[6]，這些蛋白與植物抗逆性關(guān)系密切。在SnRK2蛋白參與的抗逆研究中，關(guān)于非生物脅迫的報(bào)道最為常見，如將玉米的SnRK2蛋白激酶基因轉(zhuǎn)到擬南芥中，明顯增強(qiáng)了擬南芥的耐鹽能力；過(guò)表達(dá)蘋果的MpSnRK2.10基因明顯增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性[7-8]。也有一些SnRK2蛋白相關(guān)的植物抗病報(bào)道，如胡丹丹等[9]研究表明，沉默水稻中的SnRK2類基因OsSAPK2，轉(zhuǎn)基因水稻感白葉枯病比對(duì)照顯著提高。SnRK2基因是否參與大麥對(duì)白粉菌的抗性反應(yīng)還未有報(bào)道。

白粉病是我國(guó)大麥生產(chǎn)中的重要病害，大麥感病后一般可造成20%以上的產(chǎn)量損失，嚴(yán)重時(shí)損失達(dá)30%[10-11]。培育抗白粉病大麥品種不但能減少產(chǎn)量損失，還能減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，是控制白粉病害最有效的手段。大麥抗白粉病相關(guān)基因的克隆和抗病機(jī)理研究是抗病育種的重要基礎(chǔ)。‘鳳大麥7號(hào)’是一個(gè)高抗白粉病的大麥品種[12]，本試驗(yàn)前期對(duì)‘鳳大麥7號(hào)’進(jìn)行白粉菌侵染后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)一個(gè)SnRK2家族基因HORVU1Hr1G055340在受白粉菌侵染的‘鳳大麥7號(hào)’葉片中上調(diào)表達(dá)。本試驗(yàn)擬對(duì)該基因進(jìn)行克隆，并初步分析其在大麥抗白粉病中的功能，以期對(duì)‘鳳大麥7號(hào)’抗白粉病機(jī)理進(jìn)行更深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

‘鳳大麥7號(hào)’為大理白族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)推廣研究院引進(jìn)的大麥品種，抗白粉?。弧?0’為本實(shí)驗(yàn)室育成的大麥品種，感白粉病。大麥白粉菌取于上海本地大麥試驗(yàn)田。

1.2 白粉菌處理大麥幼苗

‘鳳大麥7號(hào)’和‘花30’幼苗生長(zhǎng)至二葉一心期時(shí)，在葉片上均勻抖落新鮮白粉菌孢子，取處理后0 h、6 h、12 h、24 h的大麥葉片，用于總RNA 的提取。

1.3 大麥總 RNA 的提取和cDNA第I鏈的合成

參照李穎波等[13]方法提取大麥總RNA。所提取的RNA采用1%甲醛變性膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性，同時(shí)測(cè)定OD230、OD260、OD280吸收值以檢測(cè)純度。cDNA第Ⅰ鏈合成具體步驟按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Life)說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 HvSAPK3基因序列分析、開發(fā)閱讀框(ORF)全長(zhǎng)克隆

1.5 生物信息學(xué)分析

HvSAPK3蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)采用Expasy的ProtParam在線分析軟件(http：web.expasy.orgprotparam)分析并預(yù)測(cè)。HvSAPK3蛋白的同源蛋白、結(jié)構(gòu)域利用NCBI的BlastP在線分析軟件(https：blast.ncbi.nlm.nih.gov)查找。

多重序列比對(duì)通過(guò)Clustal X 1.83軟件進(jìn)行，采用 MEGA 4.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(neighbor-joining 方法)，其中bootstrap設(shè)為1 000 replicates。

1.6 熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

qRT-PCR分析使用ABI 7500 fast 定量PCR儀進(jìn)行。反應(yīng)體系20 μL，包括2×SYBR Mix(Life)，上、下游引物各0.4 μmolL，每個(gè)反應(yīng)含大約 30 ng cDNA，3 個(gè)重復(fù)，陰性對(duì)照不加模板體系。qRT-PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，45個(gè)循環(huán)。通過(guò)產(chǎn)物溶解曲線分析 qRT-PCR 引物擴(kuò)增的特異性。利用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR引物根據(jù)HvSAPK3基因序列設(shè)計(jì)：上游引物5’-CAAGGAACTTCCGGAAAACA-3’，下游引物5’-CTCAGGCTCCTTGAAGTTGG-3’；采用大麥的Actin基因作為內(nèi)參基因(Actin-F：5’-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3’，Actin-R：5’-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3’)。

1.7 大麥條紋花葉病毒誘導(dǎo)的基因沉默(BSMV Virus induced gene silencing，VIGS)

VIGS試驗(yàn)過(guò)程參照Wang等[14]方法。特異性引物VIGS-F：5’-CTAGCTAGCTACGAGGCGTTGAAG-GAGTTGG-3’，VIGS-R：5’-CTAGCTAGCTTCGAAGAGTTCTCCGCCAGCA-3’，序列長(zhǎng)度為252 bp。在接種大麥條紋花葉病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)病毒10 d后觀察‘鳳大麥7號(hào)’的葉片病毒癥狀。以沉默八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)植株為參照，分別對(duì)Mock(接種緩沖液)和接種BSMV：HvSAPK3植株取樣，進(jìn)行qRT-PCR分析，檢測(cè)目的基因的沉默效率。取出現(xiàn)病毒表型的植株葉片，整齊地?cái)[放于已滅菌的6-BA保鮮培養(yǎng)基上，用抖落法接種新鮮白粉菌孢子，接種6—8d后觀察葉片發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 HvSAPK3基因的克隆和序列分析

根據(jù)HORVU1Hr1G055340設(shè)計(jì)跨ORF引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該P(yáng)CR產(chǎn)物含有編碼長(zhǎng)度為1 026 bp的完整ORF核苷酸序列。該基因編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為38.54 ku，理論等電點(diǎn)為6.03。將該蛋白氨基酸序列進(jìn)行BLASTp同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白在5—243位氨基酸與SnRK2蛋白激酶家族典型的結(jié)構(gòu)域Cdd：cd14662相似度很高(圖1)，表明該基因?qū)儆赟nRK2基因家族，故將該基因命名為HvSAPK3。

“”表示序列一致，“：”表示保守性突變，“.”表示弱半保守性突變圖1 HvSAPK3蛋白與SNRK2保守結(jié)構(gòu)域Cdd：cd14662序列比對(duì) Fig.1 Sequence alignment of HvSAPK3 protein with the conserved domain Cdd：cd14662 of SNRK2

GenBank序列號(hào)：AgSAPK3(XP_020185663.1)，BdSAPK3(XP_003574349.1)，OsSAPK3(XP_015614267.1)，ZmSnRK2.3 (NP_001136496.1)，SbSAPK3(XP_021306693.1)，SiSAPK3(XP_004983620.1)，BdSAPK2(NP_001304800.1)， SiSAPK2(XP_004958353.1)，OsSAPK2(Q0D4J7.1)，OsSAPK1(Q75LR7.1)圖2 部分禾本科植物SAPK同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of SAPK homologous proteins in some Gramineae plants

2.2 HvSAPK3同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將HvSAPK3蛋白與粗山羊草、谷子、二穗短柄草、玉米、高粱、水稻的SnRK2 類蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析表明：HvSAPK3蛋白和其他禾本科植物的SAPK3蛋白形成一個(gè)群(圖2)，其中HvSAPK3蛋白和粗山羊草SnRK2 類蛋白AgSAPK3親緣關(guān)系最近，表明SAPK3蛋白在禾本科中進(jìn)化比較保守。

2.3 白粉菌侵染后HvSAPK3基因的表達(dá)特征分析

在白粉菌侵染的‘鳳大麥7號(hào)’葉片中，HvSAPK3基因在12h時(shí)開始上調(diào)表達(dá)，隨后表達(dá)量逐漸恢復(fù)到侵染前水平(圖3A)；而在感白粉病品種‘花30’ 葉片中，HvSAPK3基因在白粉菌侵染后下調(diào)表達(dá)(圖3B)，表明HvSAPK3基因可能參與‘鳳大麥7號(hào)’的抗病反應(yīng)。

*表示P<0.05圖3 HvSAPK3基因在受白粉菌侵染的抗感大麥材料中的表達(dá)特征Fig.3 Expression characteristics of HvSAPK3 gene in resistant and susceptible barley infected by powdery mildew

A：在‘鳳大麥7號(hào)’葉片上接種BSMV病毒載體10 d后葉片的癥狀；B：利用qRT-PCR檢測(cè)HvSAPK3基因的沉默效率，*表示P<0.05；C：沉默HvSAPK3基因植株葉片離體接種大麥白粉菌后的表型，以BSMV：PDS為對(duì)照，‘花30’為感病對(duì)照；D：接種BSMV：PDS和BSMV：HvSAPK3病毒重組載體的‘鳳大麥7號(hào)’葉片接種白粉菌后白粉菌侵染比較，紅色箭頭表示形成的分生孢子，標(biāo)尺=100 μm圖4 利用VIGS分析HvSAPK3基因在‘鳳大麥7號(hào)’中的功能Fig.4 Analysis of the function of HvSAPK3 gene in ‘Fengdamai 7’ by VIGS

2.4 VIGS沉默‘鳳大麥7號(hào)’的HvSAPK3基因

將BSMV病毒α鏈、β鏈體外轉(zhuǎn)錄物分別與BSMV：PDS、BSMV：HvSAPK3體外轉(zhuǎn)錄物混合，接種二葉一心期‘鳳大麥7號(hào)’植株的第二張葉片，10d后觀察葉片上的病毒侵染癥狀。結(jié)果顯示，在參照植株(接種BSMV：PDS)的葉片上產(chǎn)生明顯的長(zhǎng)條狀光漂白表型，表明植株內(nèi)PDS基因已被成功沉默，病毒已成功侵染(圖4A)；而在接種BSMV：HvSAPK3的葉片上，也出現(xiàn)明顯褪綠的病毒花斑癥狀。

病毒載體接種10 d后，利用qRT-PCR分析沉默植株中HvSAPK3基因的表達(dá)情況，同時(shí)離體接種鑒定其白粉病抗性。結(jié)果顯示，沉默植株中的HvSAPK3基因表達(dá)量和對(duì)照植株相比顯著降低，說(shuō)明接種病毒葉片中HvSAPK3基因已被沉默(圖4B)。接種白粉菌孢子后，BSMV：PDS、BSMV：HvSAPK3和Mock的植株葉片上未觀察到明顯的白粉菌孢子堆生成(圖4C)。進(jìn)一步通過(guò)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，接種BSMV：PDS植株的葉片上白粉菌盡管能夠侵染，但無(wú)法形成分生孢子梗；而接種BSMV：HvSAPK3的植株葉片上，部分白粉菌能正常繁殖并形成次生菌絲(圖4D)。以上結(jié)果表明，在‘鳳大麥7號(hào)’中沉默HvSAPK3基因可降低其抗病性，證明該基因在抗白粉病中發(fā)揮作用。

3 討論

SnRK2是脅迫相關(guān)蛋白激酶，通過(guò)傳遞的信號(hào)誘發(fā)植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)[2]。本研究以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，在高抗白粉病大麥品種中克隆了一個(gè)響應(yīng)白粉菌侵染的SnRK2類基因HvSAPK3，進(jìn)化分析顯示：HvSAPK3蛋白和其他禾本科作物中同類蛋白聚類到同一個(gè)群，表明HvSAPK3基因在禾本科作物中進(jìn)化較保守，推測(cè)HvSAPK3基因在禾本科作物中的功能也是保守的。

Xu等[15]研究認(rèn)為，在沒(méi)有抗病基因存在的條件下，水稻OsSAPKs家族基因不會(huì)被脅迫所誘導(dǎo)。在本研究中，HvSAPK3基因在‘鳳大麥7號(hào)’中受白粉菌侵染后表達(dá)上調(diào)，而在感白粉病品種‘花30’中受白粉菌侵染后表達(dá)下調(diào)，表明HvSAPK3基因可能參與‘鳳大麥7號(hào)’對(duì)白粉病的抗病反應(yīng)。

胡丹丹等[9]沉默水稻中的OsSAPK2基因，轉(zhuǎn)基因水稻感白葉枯病顯著提高，顯示OsSAPK2基因的正向調(diào)控作用。在本研究中，VIGS試驗(yàn)顯示，沉默HvSAPK3基因后，白粉菌能在‘鳳大麥7號(hào)’葉片上能形成次生菌絲，表明HvSAPK3基因在‘鳳大麥7號(hào)’抗病反應(yīng)中起正向調(diào)控作用。目前，大麥對(duì)白粉菌專化抗性的研究較多，已報(bào)道的大麥主效抗白粉病基因位點(diǎn)有22個(gè)[16]，HvSAPK3基因究竟參與哪個(gè)基因的調(diào)控，還需要對(duì)‘鳳大麥7號(hào)’進(jìn)行更加深入的研究。

致謝：

感謝大理白族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)推廣研究院李國(guó)強(qiáng)研究員提供‘鳳大麥7號(hào)’材料。