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    豬MII期卵母細(xì)胞冷凍前后全基因組表達(dá)譜分析

    2019-05-05 01:18:00戴建軍吳彩鳳張樹山孫玲偉陳亞寧張德福
    關(guān)鍵詞:玻璃化卵母細(xì)胞新鮮

    戴建軍,吳彩鳳,張樹山,孫玲偉,陳亞寧,張德福*

    (1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;2上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室,上海 201106;3上海種豬工程技術(shù)研究中心,上海 201302)

    繼1972年Whittingham等[1]首次報(bào)道冷凍小鼠胚胎并獲得存活后代以來(lái),冷凍保存技術(shù)已經(jīng)在超過(guò)20個(gè)物種中得到了廣泛的應(yīng)用。然而不同的物種之間,其胚胎或卵母細(xì)胞的抗凍能力不一致。在牛、羊上,其玻璃化冷凍保存已經(jīng)獲得了較大范圍的推廣應(yīng)用,然而豬卵母細(xì)胞和胚胎的冷凍效率至今仍較低[2],冷凍損傷機(jī)理研究十分迫切。

    玻璃化冷凍可對(duì)卵母細(xì)胞或胚胎造成超微結(jié)構(gòu)[3]、細(xì)胞器功能[4]和相關(guān)功能基因表達(dá)[5-6]的影響,目前常用電子顯微鏡、共聚焦顯微鏡和RT-PCR等方法進(jìn)行檢測(cè)。然而細(xì)胞的生命活動(dòng)是一個(gè)非常復(fù)雜的生理生化過(guò)程,很難通過(guò)這類常規(guī)檢測(cè)對(duì)整個(gè)生理生化過(guò)程進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估?;蚪M表達(dá)譜芯片具有靈敏、高效、平行化、高通量等優(yōu)點(diǎn),通過(guò)篩選特異性表達(dá)基因,可在基因水平上揭示胚胎發(fā)育過(guò)程的本質(zhì),并在胚胎工程研究中被廣泛應(yīng)用。目前將芯片技術(shù)應(yīng)用在胚胎方面的研究物種包括人、鼠、牛、豬和山羊等[7]。

    目前,已見(jiàn)小鼠[8]、兔[9]和牛[10]的冷凍胚胎的全基因組表達(dá)譜分析的相關(guān)報(bào)道,但未見(jiàn)豬卵母細(xì)胞冷凍前后全基因組表達(dá)譜分析的相關(guān)研究。本研究擬利用Affymetrix豬的全基因組表達(dá)譜芯片,對(duì)玻璃化冷凍前后的豬MII期卵母細(xì)胞進(jìn)行全基因組表達(dá)譜分析,為深入探究其冷凍損傷機(jī)理奠定基礎(chǔ),豐富其低溫生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容。

    1 材料與方法

    除特別說(shuō)明外,本研究所用試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

    1.1 卵母細(xì)胞的采集和體外成熟

    于上海五豐公司屠宰場(chǎng)采集初情期前的豬卵巢,置于含500 IUmL雙抗的37 ℃生理鹽水中,2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用18號(hào)針頭注射器收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs),沉淀30 min后取沉淀物,在顯微鏡下挑選有3層以上顆粒細(xì)胞且胞質(zhì)均勻的COCs,經(jīng)臺(tái)氏液和TCM-199(Gibco,美國(guó))洗滌后置于預(yù)溫平衡的體外成熟培養(yǎng)液(IVM)中培養(yǎng)。體外成熟培養(yǎng)液配方為:TCM-199中分別添加10%(vv)胎牛血清(Gibco,美國(guó))、10%(vv)豬卵泡液(實(shí)驗(yàn)室自制)、10 IUmL孕馬血清促性腺激素(寧波市第三激素制品有限公司,中國(guó))、10 IUmL人絨毛膜促性腺激素(寧波市第三激素制品有限公司,中國(guó))、100 IUmL雙抗、0.1 mgmL的L-半胱氨酸和10 ngmL表皮生長(zhǎng)因子。培養(yǎng)條件為:38.5 ℃,5% CO2濃度,飽和濕度。培養(yǎng)44 h后的COCs用0.1%的透明質(zhì)酸酶反復(fù)吹打和消化,在顯微鏡下挑出排出第一極體的卵母細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。同一批次卵母細(xì)胞均隨機(jī)分為新鮮組和OPS玻璃化冷凍組進(jìn)行試驗(yàn)。

    1.2 OPS玻璃化冷凍與解凍

    在39℃的恒溫操作臺(tái)上,MII期卵母細(xì)胞在冷凍保護(hù)劑Ⅰ(TCM199中含7.5%的乙二醇,7.5%二甲基亞砜和10%胎牛血清)中處理5 min,然后轉(zhuǎn)入冷凍保護(hù)劑Ⅱ(TCM199中含17%乙二醇,17%二甲基亞砜,10%胎牛血清和0.4 molL蔗糖)中處理15 s,裝入OPS管,30 s內(nèi)投入液氮保存。解凍時(shí),分別在0.5 mmolL和0.25 mmolL的蔗糖中平衡5 min,然后移入TCM199中洗2遍,備用。冷凍卵母細(xì)胞在含10% FBS的TCM199中孵育2 h后進(jìn)行收集,每150枚卵母細(xì)胞為一個(gè)重復(fù)樣本,單獨(dú)保存于-80℃冰箱中用于RNA提取。新鮮組則挑取同一批次150枚新鮮成熟卵母細(xì)胞,于-80℃保存后用于RNA提取。

    1.3 凍后卵母細(xì)胞存活和孤雌激活發(fā)育能力檢測(cè)

    1.4 卵母細(xì)胞總RNA的提取

    -80℃保存的新鮮和冷凍卵母細(xì)胞用于總RNA提取,采用 RNApreo Pure微量樣品總RNA提取試劑盒(TIANGEN)進(jìn)行RNA提取,用微孔板分光光度計(jì)進(jìn)行RNA濃度檢測(cè),選取A260A280 在1.9—2.1,質(zhì)量濃度大于5 ngμL的RNA溶液用于總RNA的整體擴(kuò)增。整體擴(kuò)增使用TargetAmpTM2-Round aRNA Amplification Kit 2.0試劑盒進(jìn)行。

    1.5 芯片雜交、掃描和數(shù)據(jù)分析

    新鮮組和OPS玻璃化冷凍組分別取3個(gè)重復(fù),每個(gè)樣本分別取100 ng的上述總RNA,利用RNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen)純化得到mRNA。目的RNA的準(zhǔn)備和芯片雜交、掃描和初步分析處理參照GeneChip?3’ IVT Expres Kits的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。GeneChip?Porcine Genome Array來(lái)源于Affymetrix公司。

    采用Affymetrix 公司提供的Expression Console軟件進(jìn)行Robust Multichip Analysis(RMA)分析,根據(jù)樣品分組,進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)ANOVA比對(duì)分析,得到組間大于2倍差異表達(dá)的基因,篩選出新鮮組和OPS玻璃化冷凍組差異表達(dá)基因。

    對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行顯著性富集分析(Gene ontology,GO)和KEGG Pathway分析。

    1.6 部分差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

    冷凍和新鮮卵母細(xì)胞經(jīng)RNA提取和反轉(zhuǎn)錄,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)在代表性基因中隨機(jī)選擇3個(gè)上調(diào)和3個(gè)下調(diào)表達(dá)基因(激酶和轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)基因MAP3K7,細(xì)胞骨架相關(guān)基因ARPC2和MYL6,脂多糖結(jié)合蛋白相關(guān)基因LBP和線粒體功能相關(guān)基因COX6C、POLG)進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。引物信息如表1所示。反應(yīng)體系:cDNA 模板2.0 μL、SYBR Premix Ex Taq II 10 μL、Forward Primer 0.8 μL、Reverse Primer 0.8 μL、ROX II 0.4 μL、加RNase-Free ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 30 s,變性95℃ 5 s,退火34 s(Tm均為55℃),72℃延伸30 s,循環(huán)35次,退火處收集熒光。在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上運(yùn)行。冷凍和新鮮卵母細(xì)胞各選擇3個(gè)樣本,每個(gè)樣品重復(fù)3次。

    表1 RT-PCR 引物信息

    1.7 生物統(tǒng)計(jì)

    qRT-PCR以GAPDH為內(nèi)參基因,新鮮組和冷凍組各基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算比較。卵母細(xì)胞發(fā)育能力采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05表示差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 冷凍對(duì)豬MII期卵母細(xì)胞存活和體外發(fā)育能力的影響

    玻璃化冷凍對(duì)豬MII期卵母細(xì)胞存活率和孤雌發(fā)育能力的影響見(jiàn)表2。OPS玻璃化冷凍后其FDA染色存活率(72.50%)顯著低于新鮮組(98.00%)(P<0.05)。OPS冷凍卵母細(xì)胞解凍后經(jīng)孤雌激活,取得了14.56%的卵裂率和4.85%的囊胚率,顯著低于新鮮組的80.91%和35.45%(P<0.05)。

    表2 冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞存活和孤雌激活發(fā)育的影響

    同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)

    2.2 冷凍卵母細(xì)胞全基因組表達(dá)譜芯片研究

    將OPS玻璃化冷凍組數(shù)據(jù)與新鮮卵母細(xì)胞組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,篩選出171個(gè)2倍以上差異表達(dá)基因,其中上調(diào)表達(dá)基因103個(gè),下調(diào)表達(dá)基因68個(gè)。部分代表性差異表達(dá)基因見(jiàn)表3。

    2.3 部分差異基因的qRT-PCR表達(dá)驗(yàn)證

    如圖1所示,與新鮮卵母細(xì)胞相比,MAP3K7 、ARPC2和LBP基因的表達(dá)水平在冷凍卵母細(xì)胞中分別上調(diào)2.98倍、1.92倍和2.65倍,COX6C、POLG和MYL6基因的表達(dá)水平分別下調(diào)5.64倍、3.26倍和4.85倍,所得結(jié)果與基因芯片基本一致。

    圖1 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.1 qRT-PCR validation of differentially expressed genes

    2.4 芯片結(jié)果的系統(tǒng)聚類分析和主成分分析

    如圖2所示,3個(gè)新鮮組樣品和3個(gè)玻璃化冷凍組樣品組內(nèi)相似性較好,而組間的基因表達(dá)具有一定的差異性。

    圖2 系統(tǒng)聚類分析和主成分分析Fig.2 Hierarchical clustering analysis and principle component analysis

    2.5 冷凍后上調(diào)差異表達(dá)基因的GO分析

    卵母細(xì)胞冷凍后上調(diào)差異表達(dá)基因的生物過(guò)程(Biological process,BP)、細(xì)胞組成(Cellular component,CC)和分子功能(Molecular function,MF)的GO分析結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示,上調(diào)表達(dá)基因涉及損傷應(yīng)答、有機(jī)物反應(yīng)、蛋白激酶調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死調(diào)節(jié)等生物過(guò)程。同時(shí)還涉及胞外區(qū)、基底質(zhì)膜、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等細(xì)胞組成調(diào)控和類固醇結(jié)合、酶抑制劑的活性、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合、激素結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能調(diào)控。

    圖3 上調(diào)差異表達(dá)基因的GO注釋Fig.3 GO annotation of up-regulated differentially expressed genes

    2.6 冷凍后下調(diào)差異表達(dá)基因的GO分析

    卵母細(xì)胞冷凍后下調(diào)差異表達(dá)基因的生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能的GO分析結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示,下調(diào)表達(dá)基因涉及RNA拼接,核mRNA拼接,mRNA 代謝,轉(zhuǎn)運(yùn)正向調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖等生物過(guò)程。同時(shí)還涉及線粒體脊、線粒體、細(xì)胞器膜、線粒體包膜和剪接體等細(xì)胞組成調(diào)控和核苷酸結(jié)合、FAD結(jié)合、輔酶結(jié)合、固醇轉(zhuǎn)運(yùn)活性、核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性和ATP酶活性等分子功能調(diào)控。

    圖4 下調(diào)差異表達(dá)基因的GO注釋Fig.4 GO annotation of down-regulated differentially expressed genes

    2.7 冷凍后差異表達(dá)基因的KEGG Pathway分析

    豬MII期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后有顯著性差異的KEGG Pathway分析結(jié)果見(jiàn)圖5。差異表達(dá)基因涉及Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、黏著連接和MAPK信號(hào)通路等。

    圖5 差異表達(dá)基因KEGG Pathway—(-LgP)柱狀圖Fig.5 Histogram of KEGG Pathway—(-LgP)for differentially expressed genes

    3 討論

    卵母細(xì)胞和胚胎的發(fā)育過(guò)程是由基因控制的復(fù)雜過(guò)程,然冷凍可造成其基因表達(dá)水平的異常變化[5,8]。本研究利用Affymetrix豬商業(yè)化表達(dá)譜芯片對(duì)冷凍前后的豬卵母細(xì)胞的全基因組表達(dá)譜進(jìn)行了研究,獲得了已獲注解的2倍以上差異表達(dá)基因171個(gè),這為今后篩選得到更多的冷凍相關(guān)基因提供了豐富的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    在這些差異表達(dá)基因中,凍后下調(diào)倍數(shù)最高的是SLC25A3基因,達(dá)38.583倍,該基因是編碼Pic基因的重要組成部分,而Pic則是線粒體內(nèi)膜上的一個(gè)重要功能蛋白,在線粒體膜通道孔打開中發(fā)揮重要作用[11]。在文中所列的其他差異表達(dá)基因中,ATP2A2、VDAC2、COX6C、POLG、PPARGC-1等均與線粒體功能密切相關(guān)。研究表明,冷凍可造成豬MII期卵母細(xì)胞線粒體功能的系統(tǒng)性損傷,包括超微結(jié)構(gòu)異常、膜電位下降、ATP水平降低和抗氧化能力減弱等[4]與本研究結(jié)果一致。本研究中上調(diào)倍數(shù)最高的基因?yàn)镹PPC,上調(diào)倍數(shù)為3.64317。該基因在抑制卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂中發(fā)揮重要作用[12],驗(yàn)證了本研究中凍后發(fā)育能力顯著下降這一結(jié)果。

    在上調(diào)差異表達(dá)基因的生物學(xué)過(guò)程GO分析中,排名第一的為損傷應(yīng)答(Responese to wounding)。冷凍作為一種強(qiáng)刺激源,使細(xì)胞受到嚴(yán)重的破壞和損傷,從而使細(xì)胞對(duì)損傷做出迅速的反應(yīng),這為日后冷凍損傷的機(jī)理研究提供了新的方向。本研究中凋亡、細(xì)胞程序性死亡和細(xì)胞壞死調(diào)節(jié)也是參與基因上調(diào)表達(dá)的重要生物學(xué)過(guò)程。研究表明,在卵母細(xì)胞和胚胎冷凍中,細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是發(fā)育能力下降的主要因素之一[13-14],且死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑共同導(dǎo)致了凋亡的發(fā)生[15]。此外,有機(jī)物反應(yīng)和蛋白激酶調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程也參與了凍后卵母細(xì)胞的基因調(diào)控,相關(guān)研究值得后續(xù)進(jìn)一步深入。

    在上調(diào)基因的細(xì)胞組分分析中,胞外區(qū)、基底質(zhì)膜、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等參與了其冷凍后上調(diào)基因表達(dá)調(diào)控。冷凍作為一種外源性刺激因子,其首先對(duì)細(xì)胞外區(qū)域產(chǎn)生重大影響,因此胞外區(qū)分離和細(xì)胞外間隙的細(xì)胞組分影響排在細(xì)胞組分分析的前列。冷凍能對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜產(chǎn)生嚴(yán)重破壞,這一點(diǎn)已經(jīng)在眾多的研究中得到了證實(shí)[16]。冷凍還對(duì)卵母細(xì)胞的細(xì)胞骨架產(chǎn)生影響[17],本試驗(yàn)中上調(diào)基因的細(xì)胞組分分析中,有6個(gè)上調(diào)表達(dá)基因參與了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控。

    卵母細(xì)胞冷凍后下調(diào)差異表達(dá)基因的生物過(guò)程分析中,RNA拼接、核mRNA拼接和mRNA 代謝等參與了冷凍后下調(diào)基因表達(dá)的生物過(guò)程調(diào)控。MII期卵母細(xì)只能通過(guò)其自身儲(chǔ)備的RNA和mRNA來(lái)合成相關(guān)蛋白,其本身并不能轉(zhuǎn)錄RNA,故其RNA豐度對(duì)隨后的胚胎發(fā)育有重要作用[18]。本研究芯片結(jié)果表明,卵母細(xì)胞玻璃化冷凍一方面通過(guò)影響卵母細(xì)胞內(nèi)RNA和mRNA的剪接而影響其生物學(xué)過(guò)程,另一方面通過(guò)干擾其mRNA代謝,降低其自身RNA儲(chǔ)備影響基因表達(dá)。在本研究的下調(diào)基因細(xì)胞組分分析中,與線粒體功能密切的組分占了最主要部分,包括線粒體脊、線粒體、細(xì)胞器膜和線粒體包膜等,說(shuō)明冷凍對(duì)線粒體功能產(chǎn)生了巨大影響。已有研究表明,冷凍會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞的線粒體功能產(chǎn)生破壞[19],玻璃化冷凍會(huì)對(duì)豬卵母細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)、分布和膜電位產(chǎn)生負(fù)面影響[4],這些結(jié)果與本研究中下調(diào)功能基因的細(xì)胞組分分析結(jié)果相一致。

    在凍后差異表達(dá)基因的KEGG Pathway分析中,Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、黏著連接和MAPK信號(hào)通路參與了差異表達(dá)基因的調(diào)控通路。Toll樣受體信號(hào)通路和NOD樣受體信號(hào)通路在機(jī)體免疫系統(tǒng)[20]和抗感染[21]中發(fā)揮重要作用,冷凍對(duì)細(xì)胞的損傷和刺激可能誘導(dǎo)了該信號(hào)通路的發(fā)生,相關(guān)研究需進(jìn)一步深入。黏著連接是細(xì)胞中的一個(gè)重要連接方式,是一種有細(xì)胞骨架參與的緊密連接方式,與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)[22]。冷凍中黏著連接上調(diào)信號(hào)通路的參與可能與細(xì)胞骨架相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)相關(guān)。MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究證實(shí),MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi),在將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)的過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用[23]。冷凍后,MAPK信號(hào)通路調(diào)控參與其中,表明冷凍對(duì)卵母細(xì)胞隨后的存活率和發(fā)育能力將產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。

    4 結(jié)論

    本研究利用豬全基因組表達(dá)譜芯片分析了豬MII期卵母細(xì)胞冷凍前后的基因表達(dá)差異,篩選出了171個(gè)差異表達(dá)基因。聚類分析和KEGG Pathway分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞損傷應(yīng)答、凋亡、細(xì)胞壞死、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞骨架、mRNA拼接和線粒體功能等多種生物學(xué)過(guò)程參與了凍后卵母細(xì)胞的發(fā)育異常。本研究為進(jìn)一步探究豬卵母細(xì)胞冷凍損傷機(jī)理提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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