殼寡糖對(duì)高脂飲食誘發(fā)肥胖小鼠脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平及炎性因子釋放的影響

楊碩 王斌 夏文水

[摘要] 目的 研究殼寡糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及炎性因子釋放的影響。 方法 30只C57BL/6J小鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分成正常飲食組（Control組）、高脂飲食組（HF組）和高脂飲食+殼寡糖組（HF+COS組），每組10只。喂養(yǎng)16周后進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn);收集血清，檢測(cè)血脂情況;稱取小鼠體重、腎周及皮下脂肪組織，比較各組脂肪累積情況;檢測(cè)脂肪組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（GRP-78）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）mRNA及蛋白表達(dá)，檢測(cè)脂肪組織核因子-κB（NF-κB）炎癥通路變化。 結(jié)果 與Control組比較，HF組小鼠血糖、血脂、體重、腎周及皮下組織脂肪細(xì)胞體積及重量均明顯增加（P < 0.05或P < 0.01），GRP-78、PERK mRNA及蛋白表達(dá)增加（P < 0.05），NF-κB通路激活。與HF組比較，HF+COS組上述指標(biāo)除總膽固醇外均明顯降低（P < 0.05）。 結(jié)論 殼寡糖可以降低高脂飲食喂養(yǎng)肥胖小鼠血脂，減輕脂肪組織過度積累，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并可能通過抑制NF-κB的激活減少炎性因子釋放，從而達(dá)到緩解胰島素抵抗的作用。

[關(guān)鍵詞] 殼寡糖;脂肪組織;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;核因子-κB;胰島素抵抗

[中圖分類號(hào)] R587? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）03（c）-0009-07

[Abstract] Objective To investigate the effect of chitosan oligosaccharide on the level of endoplasmic reticulum stress and inflammatory factors released in adipose tissue of obese mice induced by high-fat diet. Methods Thirty C57BL/6J mice were divided into normal diet group （Control group）， high-fat diet group （HF group） and high-fat diet+chitosan oligosaccharide group （HF+COS group） according to random number table method， with 10 mice in each group. After being fed for 16 weeks， glucose tolerance test and insulin tolerance test were carried out. Serum was collected to detect lipid profiles， mice body weights， perirenal and subcutaneous adipose tissue weights were estimated within groups. In addition， the protein and mRNA expression of endoplasmic reticulum stress markers glucose regulatory protein （GRP-78） and endoplasmic reticulum kinase （PERK） from adipose tissue were assessed. Meanwhile， the changes of nuclear factor-κB （NF-κB） inflammatory pathways in adipose tissue were also detected. Results Compared with the control group， the levels of glucose， lipid， the body weights and the size and weight of perirenal and subcutaneous adipocytes in HF group were significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）， the mRNA and protein expression of GRP-78 and PERK were increased significantly （P < 0.05）. And the activation states of NF-κB pathway was measured accordingly. Compared with HF group， except for total cholesterol， the mentioned indicators in HF+COS group were significantly decreased （P < 0.05）. Conclusion Chitosan oligosaccharide can lower blood lipids， reduce the excessive accumulation of adipose tissue and relieve endoplasmic reticulum stress in mice fed on high-fat diet. Chitosan oligosaccharide inhibits the activation of NF-κB， resulting in the reduced release of inflammatory factors which is likely to contribute to the insulin resistance alleviation.

[Key words] Chitosan oligosaccharide; Adipose tissue; Endoplasmic reticulum stress; Nuclear factor-κB; Insulin resistance

肥胖是21世紀(jì)嚴(yán)峻的健康問題，最新數(shù)據(jù)表明全球超過4億人屬于肥胖[1]。肥胖患者脂肪組織中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）[2]。研究表明肥胖患者往往處于慢性炎癥狀態(tài)，當(dāng)脂肪細(xì)胞發(fā)生ERS時(shí)，炎性因子表達(dá)增加，最終可能導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生[3]。殼寡糖（chitosan oligosaccharides，COS）是一種天然的水溶性低聚糖，主要提取自海洋生物的甲殼[4]，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化及神經(jīng)保護(hù)等功能[5-7]。本研究主要探討殼寡糖對(duì)高脂飲食誘發(fā)肥胖的C57BL/6J小鼠脂肪組織胰島素抵抗的緩解作用，以期為殼寡糖的生物活性應(yīng)用提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? 6周齡C57BL/6J小鼠（18～20 g）30只，健康SPF級(jí)，雄性，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[合格證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005]，12 h明暗光源交替，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度60%飼養(yǎng)環(huán)境。

1.1.2 試劑與儀器? 殼寡糖（脫乙酰度90%，分子量1500 Da，浙江金殼藥業(yè)有限公司）;引物由英俊生物技術(shù)有限公司提供;TRIzol試劑（ThermoFisher scientific，10296010）;RNAiso Plus試劑盒（Takara，9108）;SYBR Green（DBI Bioscience，DBI-2043）;抗GAPDH抗體（Santa Cruz，sc166545），兔抗鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α（ab6671）、白細(xì)胞介素（IL）-6（ab128008）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（GRP）-78（ab21685）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）（ab79483）、磷酸化-核因子-κB抑制蛋白（p-IκB）（ab32518）、核因子-κB（NF-κB）p65（ab16502）、β-actin（ab8227）和Lamin（ab16048）均購(gòu)自Abcam。電泳儀（北京六一儀器廠，DYCZ-25D）;低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，5810R）;熒光定量PCR儀（CFX96 TM Real-Time System）。

1.2 方法

1.2.1 肥胖小鼠造模及分組? 采用隨機(jī)數(shù)字表法將C57BL/6J小鼠分為正常飲食組（Control組）、高脂飲食組（HF組）和高脂飲食+殼寡糖組（HF+COS組），每組10只。喂養(yǎng)16周，遵守江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。HF組給予45%熱量高脂飼料（2.9%大豆油、20.7%豬油、46.1%碳水化合物和23.3%蛋白質(zhì)）[8-9]，HF+COS組高脂飼料中添加5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)殼寡糖[10]，劑量符合毒理安全評(píng)價(jià)[11]。小鼠體重顯著上升被認(rèn)為成功建模。

1.2.2 葡萄糖耐量試驗(yàn)（GTT）和胰島素耐量試驗(yàn)（ITT）? 小鼠禁食5 h后灌胃給予葡萄糖溶液（2 g/kg），分別于0、30、60、90、120 min時(shí)鼠尾采血（5～10 μL）進(jìn)行GTT試驗(yàn);ITT試驗(yàn)前小鼠禁食5 h，腹腔注射胰島素（0.75 U/kg）。分別在注射前（0 min）及注射后30、60、90、120 min鼠尾采血，血糖儀測(cè)量血糖水平，計(jì)算葡萄糖曲線下面積（AUC）。

1.2.3 小鼠標(biāo)本留取? 每周測(cè)量小鼠體重，滿16周禁食過夜，次日麻醉脫頸處死，腹主動(dòng)脈取血，制備血清檢測(cè)總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和游離脂肪酸（FFA）的濃度。鈍性分取腎周及皮下脂肪組織，一部分立即10%甲醛固定，另一部分液氮快速凍存后置于-80℃冰箱中備用。

1.2.4 HE染色形態(tài)學(xué)觀察? 每只小鼠的腎周及皮下脂肪組織均于甲醛固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，光鏡拍照，每個(gè)組織隨機(jī)選取5個(gè)視野（200×），測(cè)定約200個(gè)細(xì)胞的大小。

1.2.5 免疫組化分析? 脂肪組織制片，抗原修復(fù)，3%過氧化氫10 min滅活。山羊血清封閉，分別滴加一抗IL-6（1∶200）和TNF-α（1∶300）4℃孵育過夜。PBS清洗后加二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察并拍照，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用Image-Pro圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析（IOD）。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量? 稱取80 mg皮下脂肪組織，采用Trizol法提取皮下脂肪組織總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄高效試劑盒獲取cDNA，操作按試劑盒說明進(jìn)行。應(yīng)用熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，引物信息見表1。以β-actin的表達(dá)量作為內(nèi)參，每個(gè)標(biāo)本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取復(fù)孔平均Ct，通過計(jì)算2-ΔΔCt得出各組基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.7 Western blot? 分別稱取100 mg小鼠皮下脂肪組織，總蛋白及核蛋白的提取操作參照試劑盒說明書。SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，采用含5%脫脂奶粉TBST溶液封閉1 h，孵育一抗GRP-78（1∶1000）、PERK（1∶1000）和p-IκB（1∶1000）及核蛋白一抗NF-κB p65（1∶500），4℃過夜，次日洗膜，孵育二抗，37℃ 1 h，采用Supersignal孵育后曝光，通過Image lab軟件掃描后對(duì)條帶進(jìn)行分析。目的蛋白條帶的光密度值與內(nèi)參GAPDH條帶的光密度值相比，NF-κB p65條帶光密度值與內(nèi)參Lamin相比，得到目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，三組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD方法;非正態(tài)分布計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 殼寡糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠體重、腎周及皮下脂肪組織的影響

與Control組比較，HF組小鼠體重、腎周脂肪和皮下脂肪組織重量均顯著升高（P < 0.01），HF+COS組小鼠體重明顯升高（P < 0.05）;與HF組比較，HF+COS組小鼠體重、腎周脂肪和皮下脂肪組織重量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 殼寡糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠脂肪細(xì)胞的影響

腎周和皮下脂肪組織HE染色提示，與Control組比較，HF組腎周及皮下脂肪組織中脂肪細(xì)胞體積均明顯增大（P < 0.05或P < 0.01），細(xì)胞大小非均一，出現(xiàn)較多冠狀結(jié)構(gòu);與HF組比較，HF+COS組腎周和皮下脂肪組織中脂肪細(xì)胞明顯變小（P < 0.05），冠狀結(jié)構(gòu)減少。

2.3 殼寡糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠血脂指標(biāo)的影響

與Control組比較，HF組小鼠TC、TG、LDL-C以及FFA顯著升高，HDL-C顯著降低，HF+COS組LDL-C、FFA明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）;與HF組比較，HF+COS組TG、LDL-C、FFA均顯著降低，HDL-C顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;HF+COS組與HF組TC比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.4 殼寡糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠葡萄糖耐受和胰島素抵抗的影響

GTT試驗(yàn)表明HF組小鼠空腹血糖高于Control組和HF+COS組，且達(dá)到峰值后下降速度減慢;HF組血糖AUC顯著高于Control組（P < 0.05），但與HF+COS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。ITT試驗(yàn)結(jié)果表明，HF組AUC高于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），胰島素注射后120 min，HF+COS組小鼠血糖水平較HF組略微上升，AUC下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.5 殼寡糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)的影響

與Control組比較，HF組小鼠的皮下脂肪組織GRP-78和PERK的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P < 0.05或P < 0.01）;HF+COS組小鼠皮下脂肪組織GRP-78和PERK的mRNA及蛋白表達(dá)水平較HF組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.6 殼寡糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠脂肪組織炎性因子釋放的影響

免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示脂肪組織中IL-6及TNF-α主要分布于細(xì)胞質(zhì)中;免疫組織化學(xué)半定量分析結(jié)果及RT-PCR結(jié)果均顯示，與Control組比較，HF組小鼠皮下脂肪組織中IL-6及TNF-α表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）;HF+COS組小鼠皮下脂肪組織中IL-6及TNF-α表達(dá)明顯低于HF組（P < 0.05）。

2.7 殼寡糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠脂肪細(xì)胞p-IκB、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示HF組脂肪組織p-IκB、NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯高于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）;HF+COS組p-IκB及NF-κB p65表達(dá)較HF組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

本研究通過對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠喂養(yǎng)殼寡糖，檢測(cè)肥胖小鼠血糖及血脂代謝水平以及ERS相關(guān)分子的變化，初步探討殼寡糖在緩解ERS、炎性因子釋放及胰島素抵抗中的作用及相關(guān)分子機(jī)制。結(jié)果顯示，高脂飲食喂養(yǎng)16周后，HF組小鼠血糖、血脂和體重均明顯增加，皮下組織脂肪細(xì)胞體積增加并伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);HF+COS組血糖、血清TG、LDL-C和FFA與HF組相比明顯降低，體重、腎周及皮下脂肪組織重量均明顯降低，脂肪細(xì)胞體積減小，這也與以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[12-13]。GTT及ITT結(jié)果顯示殼寡糖未能緩解肥胖誘導(dǎo)的小鼠葡萄糖耐受不良，但對(duì)胰島素敏感性減低卻有改善作用，這都提示殼寡糖具有一定程度的降血脂和改善胰島素抵抗的作用。

殼寡糖具有良好的水溶性，經(jīng)口服途徑攝取后，在小腸上段快速地被上皮細(xì)胞吸收[14]，體外Caco-2單層細(xì)胞吸收模型驗(yàn)證了殼寡糖輕易地穿越小腸上皮細(xì)胞[15]。由此推斷殼寡糖在吸收后經(jīng)血液循環(huán)作用于脂肪組織、肝臟和骨骼肌等各個(gè)組織，影響葡萄糖和脂質(zhì)的體內(nèi)代謝[16]。

肥胖患者不僅血脂代謝紊亂，還長(zhǎng)期處于慢性炎性狀態(tài)[12]。研究發(fā)現(xiàn)肥胖患者脂肪細(xì)胞可以分泌IL-6、TNF-α等促炎因子，影響全身代謝，導(dǎo)致胰島素抵抗[17]。ERS可能是連接肥胖、炎癥和代謝紊亂的核心機(jī)制：肥胖患者往往伴隨血脂代謝異常，而血脂代謝異常是ERS重要原因之一，大量研究發(fā)現(xiàn)肥胖患者內(nèi)臟脂肪中ERS相關(guān)基因表達(dá)顯著高于正常體重人群[18];ERS在機(jī)體的炎性反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用，參與多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[19]。目前研究發(fā)現(xiàn)ERS有3條重要的下游通路：PERK、IRE1和ATF6，這3條通路均可以通過多種途徑影響炎性因子的釋放，而慢性炎性狀態(tài)與胰島素抵抗密不可分[19-20]。因此，尋找改善ERS的干預(yù)措施對(duì)預(yù)防和緩解肥胖患者胰島素抵抗有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠皮下脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP-78、PERK表達(dá)明顯增高，促炎因子IL-6、TNF-α表達(dá)增加，而殼寡糖能有效緩解肥胖狀態(tài)下脂肪組織ERS及炎性因子的釋放，因此飲食添加殼寡糖有望成為改善肥胖患者胰島素抵抗的有效措施。

NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與多種炎癥基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。目前大量研究證實(shí)，ERS的3條下游通路均能激活NF-κB，但機(jī)制各有不同[19-20]。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與IκB形成復(fù)合物，以無活性形式存在于胞質(zhì)中。當(dāng)受到多種刺激時(shí)，IκB發(fā)生磷酸化并與NF-κB分離，無活性的NF-κB蛋白被激活，進(jìn)而轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)炎性因子的分泌和表達(dá)，引起胰島素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn)，HF+COS組IκB磷酸化水平降低、NF-κB p65入核減少，炎性因子IL-6、TNF-α的生成減少。因此，殼寡糖可能通過緩解脂肪組織ERS，減少下游通路對(duì)NF-κB的激活，從而減少炎性因子的釋放，達(dá)到緩解胰島素抵抗的目的，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，殼寡糖能改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠高血脂狀態(tài)，緩解脂肪細(xì)胞ERS，抑制炎性因子的釋放，并能在一定程度上抑制胰島素抵抗的發(fā)生，對(duì)代謝的紊亂具有改善作用，為殼寡糖生物活性研究提供了更全面的認(rèn)知。

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（收稿日期：2018-03-09? 本文編輯：張瑜杰）