miRNA-155通過AT1R-VEGFR2通路影響大鼠腦梗死后血管生成的研究

魏欣 納文麗 白向東 胡雯 馬玲

【摘 要】目的：探討miRNA-155通過AT1R/VEGFR2信號通路調(diào)控大鼠腦梗死后血管生成的作用及機制。方法：選擇雌性SD大鼠采用大腦中動脈線栓閉塞的方法建立大鼠腦缺血實驗動物模型。將大鼠分為四組，分別為假手術(shù)組、腦缺血組、腦缺血/ miRNA-155模擬物組、腦缺血/miRNA-155 抑制物組。RT-PCR檢測各組大鼠腦梗死后miRNA-155表達(dá)量;Zea-Longa 5 分制評分法對各組大鼠進行神經(jīng)功能評分;采用2，3，5 -三苯基四唑氯銨染色法評價各組大鼠腦梗死體積;免疫組織化學(xué)染色法檢測各組大鼠缺血腦皮質(zhì)區(qū)CD31蛋白的表達(dá)量;Western blotting 檢測各組大鼠缺血腦皮質(zhì)區(qū)VEGFR2和AT1R的表達(dá)。結(jié)果：腦梗死后腦缺血組織中miRNA-155表達(dá)增加。假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能損害癥狀，而腦缺血組大鼠有明顯的神經(jīng)功能損害。經(jīng)miRNA-155抑制劑治療后，腦缺血大鼠神經(jīng)功能得到改善，腦梗死面積減少。但經(jīng)miRNA-155模擬治療后，神經(jīng)功能進一步惡化，腦梗死面積增加。免疫組化檢測結(jié)果表明，miRNA-155抑制劑可上調(diào)CD31的表達(dá)，而miRNA-155模擬物可下調(diào)CD31的表達(dá)。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)miRNA-155抑制劑處理后，腦缺血大鼠AT1R和VEGFR2蛋白表達(dá)增加;但經(jīng)miRNA-155模擬處理后，AT1R和VEGFR2 蛋白表達(dá)降低。結(jié)論：抑制miRNA-155可以改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能損害，減少腦梗死體積，有效促進缺血區(qū)血管生成，這可能是通過AT1R/VEGFR2信號通路介導(dǎo)的。

【關(guān)鍵詞】miRNA-155;腦梗死;血管生成;血管內(nèi)皮生長因子;血管緊張素II受體1

【中圖分類號】 R733 .7

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A? 【文章編號】 1672-3783（2019）04-03-248-01

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國腦梗死發(fā)病率呈逐年上升趨勢，因其致殘率高、死亡率高而受到廣泛關(guān)注[1]。腦梗死可引起腦神經(jīng)元的不可逆變性和壞死，從而導(dǎo)致一系列神經(jīng)功能障礙。因此尋求早期促進腦梗死區(qū)域局部血管生成的有效手段，恢復(fù)組織灌注對腦梗死患者預(yù)后具有重要意義。

血管生成可以改善腦梗死區(qū)域的灌注，從而促進中樞神經(jīng)的再生，是腦神經(jīng)元恢復(fù)的基礎(chǔ)[2]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）是血管生成過程中最重要的調(diào)節(jié)因子之一。VEGF通過VEGF受體1、2、3三種受體發(fā)揮作用，其中VEGFR2對早期血管生成最為重要[3]。血管緊張素II（Angiotensin II， Ang II）是一種多功能的生物活性肽，能促進血管生成，在血管生成中起著關(guān)鍵作用。血管緊張素II受體1 （AT1R）/VEGFR2信號通路可促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，在生理和病理條件下均可調(diào)控血管生成[4]。因此有必要尋求有效的措施來增強AT1R/VEGFR2通路在這一過程中的作用。

miRNA是一種小的非編碼RNA分子，約有22個核苷酸，廣泛存在于植物、動物和一些病毒中[5]?；诎谢蚺c信使RNA（mRNA）的互補配對，miRNA在RNA沉默和轉(zhuǎn)錄后可以在基因調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。據(jù)報道m(xù)iRNA-155與血管生成有著密切的關(guān)系，其靶基因為AT1R，可以靶向降低AT1R的表達(dá)，抑制Ang II/AT1R信號通路，從而導(dǎo)致血管生成抑]。研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血狀態(tài)下miRNA-155的表達(dá)顯著增加，而抑制miRNA-155可以保護神經(jīng)，從而改善腦缺血的損傷[6]。因此本研究擬建立大鼠腦梗死模型，根據(jù)miRNA-155在體內(nèi)的過表達(dá)及對表達(dá)的抑制作用，觀察miRNA-155對腦梗死大鼠血管生成的影響，進一步探討AT1R/VEGFR2通路在這一過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物

雌性SD大鼠，體重200-250g，購于蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒購于美國Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購于日本Takara公司;miRNA-155模擬物、miRNA-155抑制劑購于美國Life Technologies公司;2，3，5 -三苯基四唑氯銨購于美國Sigma公司;兔抗大鼠CD31、AT1R、VEGFR2、β-actin antibody抗體購于美國Santa Cruz公司;辣根過氧化物沒標(biāo)記的羊抗兔IgG購于中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 設(shè)備

電子分析天平購于瑞士梅特勒托利多公司;臺式離心機購于美國BECKMAN公司;實時熒光定量PCR儀、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、Mini Trans-blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司。

1.4 SD大鼠腦缺血實驗動物模型的構(gòu)建

采用大腦中動脈線栓閉塞（MCAO）的方法建立大鼠腦缺血實驗動物模型：經(jīng)頸外側(cè)切口，從頸總動脈分叉處附近插入線栓，制作大腦中動脈閉塞缺血性腦卒中的大鼠實驗動物模型。

1.5 分組和干預(yù)

將大鼠分為四組，每組10只。第一組為假手術(shù)組，不阻斷右側(cè)大腦中動脈，假手術(shù)5分鐘后經(jīng)側(cè)腦室注射等容量生理鹽水。第二組為大腦中動脈線栓閉塞模型組，本組于腦缺血5分鐘后經(jīng)側(cè)腦室注射等容量生理鹽水。第三組為腦缺血/模擬物組，于腦缺血5分鐘后經(jīng)側(cè)腦室注射miRNA-155模擬物10ug。第四組為腦缺血/miRNA-155 抑制物組，于腦缺血5分鐘后經(jīng)側(cè)腦室注射 miRNA-155 抑制物10ug。

1.6 神經(jīng)功能評分

參照 Zea-Longa 5 分制評分標(biāo)準(zhǔn)，于缺血24小時對各組大鼠進行行為學(xué)評分紀(jì)錄[7]。

1.7 梗死體積測定

過量麻醉處死，迅速斷頭取腦，將鼠腦立即置于-20℃冰箱中20min后取出，行2mm厚的連續(xù)冠狀切片。將切片立即置于2%氯化三苯四氮唑溶液中，37℃恒溫下避光染色30 min，然后置于4℃、4%多聚甲醛溶液中固定24h。正常腦組織染為紅色，梗死組織為白色，測定每張腦片的梗死面積。

1.8 RT-PCR檢測 miRNA-155的表達(dá)

采用RNA提取試劑盒提取總RNA，設(shè)計miR-155上游引物： 50-GTCGTATC CAGTGCAGGGTCCGAGG-30，下游引物：TATTCGCACTGGATACGACCCCCTA，采用RT-PCR試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，統(tǒng)計各組間miRNA-155相對表達(dá)量。

1.9 免疫組織化學(xué)染色法檢測缺血腦皮質(zhì)區(qū)CD31的表達(dá)

取各組大鼠缺血區(qū)的腦組織，4%多聚甲醛固定。洗滌后依次乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋切片、脫蠟水合、修復(fù)抗原，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷。血清封閉后加入抗CD31一抗，4℃孵育過夜。洗滌后加入生物素標(biāo)記的IgG孵育10min。洗滌后加入鏈霉菌素親和素過氧化物酶，室溫孵育10 min。DAB染色3 min，蘇木精染色10 s。1%鹽酸乙醇分化2 s。用中性樹脂固定后，在顯微鏡下觀察。

1.10 Western blotting 檢測VEGF受體2（VEGFR2）和AT1R的表達(dá)

提取腦組織蛋白用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后蛋白轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)移后的膜取出，用50ml的TBS室溫晃動洗滌5分鐘。將膜置于50ml 5%脫脂牛奶的TBS中室溫晃動封閉1小時。25ml的TBS洗滌三次，每次洗滌5分鐘。加入稀釋好的VEGF受體2（VEGFR2）和AT1R的兔抗大鼠一抗，β-actin兔抗人一抗為1：3000倍稀釋，室溫孵育2小時。25ml的TBS洗滌三次，每次洗滌5分鐘。加入稀釋好的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育2小時。25ml的TBS洗滌三次，每次洗滌5分鐘，顯色并分析系統(tǒng)進行分析。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0進行處理。測量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。方差齊性檢驗采用Levene檢驗（參考標(biāo)準(zhǔn)為0.10）。符合方差齊性的采用單向ANOVA和LDS檢驗，不符合方差齊性的采用Kruskal-Wallis H檢驗。采用配對t檢驗對同一組實驗前后進行比較。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和梗死體積比較

假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能損害癥狀，而腦缺血組大鼠神經(jīng)功能損害評分為2.698±0.529。經(jīng)miRNA-155抑制劑治療后，與腦缺血組相比，神經(jīng)功能損害評分降低（P < 0.05），而miRNA-155模擬物治療后，神經(jīng)功能損害評分升高（P < 0.05）。2，3，5 -三苯基四唑氯銨染色結(jié)果顯示，miRNA-155抑制劑治療后腦梗死面積減小（P < 0.05），而miRNA-155模擬物治療后腦梗死面積增大（P < 0.05）。以上結(jié)果表明，抑制miRNA-155可改善腦梗死患者的神經(jīng)功能，減少腦梗死體積宏觀。具體見表1所示。

2.2 各組大鼠miRNA-155表達(dá)的變化

腦梗死后檢測腦缺血組織中miRNA-155的表達(dá)，各組大鼠miRNA-155相對表達(dá)量見表2所示。比較顯示腦缺血組大鼠miRNA-155的表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組。腦缺血/ miRNA-155模擬物組和腦缺血/ miRNA-155抑制劑組與腦缺血組相比較，結(jié)果顯示與腦缺血組相比，腦缺血/ miRNA-155模擬物組miRNA-155表達(dá)顯著增加（P < 0.01），而腦缺血/ miRNA-155抑制劑組miRNA-155表達(dá)顯著降低（P < 0.01）。miRNA-155模擬物可以模擬內(nèi)源性的miRNA-155，從而上調(diào)miRNA-155的表達(dá)增強其功能。miRNA-155抑制劑可以特異性地靶向敲除miRNA-155，從而下調(diào)miRNA-155的表達(dá)。

2.3 miRNA-155對腦梗死后缺血組織CD31表達(dá)的影響

本研究采用免疫組織化學(xué)方法進一步檢測腦梗死后缺血組織中CD31的表達(dá)情況。結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠缺血組織中CD31表達(dá)無明顯變化（P > 0.05）。經(jīng)miRNA-155抑制劑處理后，CD31表達(dá)顯著升高（P < 0.01）;而經(jīng)過miRNA-155模擬物處理后，CD31表達(dá)顯著降低（P < 0.01），說明抑制miRNA-155可促進腦梗死后血管生成。見表3所示。

2.4 miRNA-155對腦梗死后缺血組織中AT1R和VEGFR2蛋白表達(dá)的影響

本研究用Western blotting檢測腦梗死后缺血組織中AT1R和VEGFR2蛋白表達(dá)。miRNA-155抑制劑處理后AT1R和VEGFR2蛋白的表達(dá)明顯增加（P < 0.01），而經(jīng)過miRNA-155模擬物處理后，AT1R的表達(dá)和VEGFR2蛋白顯著減少（P < 0.01）。表明抑制miRNA-155的表達(dá)可以促進腦梗死后血管生成，可能是通過AT1R / VEGFR2通路介導(dǎo)的。見表4所示。

3 討論

腦血管疾病已成為人類死亡的重要原因之一，其中缺血性腦血管疾病占絕大多數(shù)，約占死亡總數(shù)的75%-85%。腦梗死可引起腦神經(jīng)元的不可逆變性和壞死，從而導(dǎo)致一系列神經(jīng)功能障礙，給患者及其家屬和社會帶來巨大的負(fù)擔(dān)[8]。

本研究中腦梗死后腦缺血組之中miRNA-155的表達(dá)量顯著增加，這表明腦缺血后miRNA-155的表達(dá)參與腦組織的損傷。為了明確miRNA-155在腦梗死后腦組織損傷中的作用，我們利用miRNA模擬物上調(diào)了miRNA的表達(dá)，并利用miRNA抑制劑下調(diào)了miRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，miRNA-155抑制劑能改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，減少腦梗死體積;而miRNA-155的模擬會進一步惡化腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，增加腦梗死的體積。

參考文獻(xiàn)

[1]Fan Y， Yang GY. Therapeutic angiogenesis for brain ischemia： a brief review. J Neuroimmune Pharmacol 2007; 2（3）： 284-289.

[2]李銀萍，劉昌齡，涂雙燕，楊蓉.腦卒中病人照顧者需求狀況研究進展[J].護理研究，2019（04）：616-619

[3]Silpanisong J， Pearce WJ. Vasotrophic regulation of age-dependent hypoxic cerebrovascular remodeling. Curr Vasc Pharmacol 2013; 11（5）： 544-563.

[4]張荻，徐鳴曙，張英杰，程愛芳，管華宗.腦缺血后周細(xì)胞及相關(guān)血管生成信號通路的研究進展[J].中國康復(fù)理論與實踐：1-6

[5]Szafranski K， Abraham KJ， Mekhail K. Non-coding RNA in neural function， disease， and aging. Front Genet 2015; 6： 87.

[6]李偉.血管生成素-1對豬慢性缺血心肌中功能性新生血管增生的促進作用[J].復(fù)旦學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2018，45（03）：347-353.

[7]Purvis N， Bahn A， Katare R. The role ofmiRNAs in cardiac stem cells. Stem Cells Int 2015; 2015： 194894.

[8]袁園，張瀟，邵菊，孫芳，李蓉.富血小板血漿對小鼠下肢缺血血管生成的作用研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2019，48（02）：198-201.