毛脈蓼蒽醌類(lèi)有效成分乙醇提取工藝篩選及優(yōu)化

胡玲玲

(安康學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院， 陜西 安康 725000)

毛脈蓼為蓼科植物，其莖高大，塊根粗糙，質(zhì)地堅(jiān)硬，主要生長(zhǎng)于山川溝壑之中，多地有分布。毛脈蓼的干燥塊根味苦具藥效，被人們稱(chēng)做朱砂七或朱砂蓮，屬于“太白七藥”之一，為陜西地道的名貴藥材[1-5]。毛脈蓼在秦嶺山脈的儲(chǔ)量十分豐富，為人們的常用藥材。中醫(yī)常用其治療勞累過(guò)度引起的勞傷、損傷，塊莖能治療黃疸性肝炎，中暑所致的腹痛腹瀉、燙傷、蚊蟲(chóng)引起的腫毒、菌痢和風(fēng)濕腰疼等癥。研究發(fā)現(xiàn)，朱砂七中的蒽醌類(lèi)化合物可以保護(hù)人體中的正常細(xì)胞免受病毒細(xì)胞侵害，也可以抑制流感病毒；此外，其粗多糖還具有抗氧化、抗腫瘤的作用[6-11]。另有研究[12-17]證明，毛脈蓼還具有抗菌、鎮(zhèn)痛及抗炎作用。陳吉炎等[12]采用紅外光譜和紫外光譜核磁共振的方法確認(rèn)，朱砂七中蒽醌類(lèi)化合物主要是大黃素和大黃素甲醚。韓公羽等[14-15]從朱砂七中分離出朱砂蓮甲素和朱砂蓮乙素。張秀琴等[18]用極譜法測(cè)得朱砂七中有效成分主要為游離蒽醌和結(jié)合蒽醌，分別為3.15%和10.20%；其可進(jìn)一步細(xì)分為0.05%的大黃素、0.40%的葡萄糖甙、3.10%大黃素甲醚和9.80%葡萄糖甙等。目前，提取毛脈蓼蒽醌類(lèi)有效成分的方法很多，包括微波法提取、超聲波提取、醇提法和水提法等?？加衿嫉萚19]研究證明，乙醇法提取朱砂七中蒽醌的提取率高于水提法。王曉梅等[20]研究證實(shí)，采用超聲波輔助法提取朱砂七中蒽醌化合物有很多優(yōu)點(diǎn)，但成本較大，提取的蒽醌類(lèi)成分純度不高。鑒于此，采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)與紫外分光光度計(jì)掃描相結(jié)合的方法對(duì)乙醇法提取毛脈蓼蒽醌類(lèi)有效成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為提高名貴藥材毛脈蓼的利用率提供參考。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1毛脈蓼毛脈蓼塊根，采自陜西安康。

1.1.2試劑大黃素標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自于中國(guó)藥品生物鑒定所；甲醇，乙醇及其他試劑等均為分析純，市購(gòu)。

1.1.3儀器FW177中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)，101-1AB電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，HJF-300電子天平(深圳市恒之達(dá)儀器有限公司)，RE52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))，KH-2500DE超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，L-5S紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制精確稱(chēng)量大黃素標(biāo)準(zhǔn)品0.005 0 g，用2 mL甲醇將其溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，再用蒸餾水定容，搖勻得濃度0.0001 g/mL的貯備液備用。從大黃素標(biāo)準(zhǔn)貯備液中分別移取0.5 mL、1.5 mL、3.5 mL、5.5 mL和7.5 mL的貯備液至5支10 mL的容量瓶中并標(biāo)記為1～5號(hào)，分別加入甲醇溶液搖勻并對(duì)其定容。用紫外分光光度計(jì)分別掃描1～5號(hào)瓶，通過(guò)觀察峰值確定最大吸收波長(zhǎng)為253 nm。在最大吸收波長(zhǎng)253 nm處測(cè)定溶液的吸光度，以測(cè)得吸光度為縱坐標(biāo)，大黃標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1) 乙醇濃度對(duì)提取率的影響。設(shè)5個(gè)處理，考察20%、40%、60%、80%及100%乙醇濃度對(duì)毛脈蓼塊根總蒽醌類(lèi)物質(zhì)的提取率的影響。其他提取條件依次為溫度60℃，料液比1∶15，提取時(shí)間2.5 h。

2) 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。設(shè)定提取溫度60℃，料液比1∶15，乙醇濃度60%，在此條件下探討不同提取時(shí)間(0.5 h、1.0 h、1.5 h、2 h和2.5 h)對(duì)蒽醌類(lèi)化合物提取率的影響。

3) 提取溫度對(duì)提取率的影響。設(shè)定料液比1∶15，乙醇濃度60%，提取時(shí)間1.5 h，在此條件下探討不同提取溫度(50℃、60℃、70℃、80℃和90℃)對(duì)蒽醌類(lèi)化合物提取率的影響。

4) 料液比對(duì)提取率的影響。設(shè)定提取時(shí)間1.5 h，提取溫度60℃，乙醇濃度60%，在此條件下探討料液比(g∶mL)分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20及1∶25對(duì)毛脈蓼蔥醌類(lèi)化合物提取率的影響。

5) 最佳提取工藝篩選。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取料液比、提取時(shí)間、提取溫度及乙醇濃度4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，利用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選乙醇法提取毛脈蓼中蒽醌類(lèi)物質(zhì)的最優(yōu)工藝。

1.2.3毛脈蓼中蒽醌類(lèi)化合物的提取與含量測(cè)定 將毛脈蓼塊根用清水清洗干凈，切成片，然后將所得藥片放入白瓷盤(pán)中置于50℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱恒溫干燥24 h，冷卻，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，除去大顆粒。準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g的毛脈蓼塊根粉末，用乙醇溶液進(jìn)行提取，提取液用真空泵進(jìn)行抽濾，將所得的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，濃縮到較粘稠時(shí)再轉(zhuǎn)移到25 mL帶有刻度的比色管中，用甲醇溶解并定容，并用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定提取液的吸光度，根據(jù)大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得出提取液中蒽醌類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量濃度，再按下面的公式計(jì)算得到蒽醌類(lèi)物質(zhì)的提取率。

提取率=C×V/M×100%

式中，C為由樣品液的吸光度計(jì)算所得樣品液的質(zhì)量濃度(mg)，V為樣品體積(mL)，M為毛脈蓼塊根粉的質(zhì)量(g)。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

從圖1可見(jiàn)，大黃標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與其在253 nm處的吸光度(OD值)之間存在線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性回歸方程為y=0.500 2x+0.100 3，R2=0.998 8，說(shuō)明，二者間線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖1大黃標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2不同因素對(duì)毛脈蓼塊根總蒽醌類(lèi)物質(zhì)提取率的影響

由圖2可知，不同因素對(duì)毛脈蓼塊根總蒽醌類(lèi)物質(zhì)提取率的影響存在差異。

2.2.1乙醇濃度隨著乙醇濃度增高蒽醌類(lèi)化合物的提取率呈先升后降趨勢(shì)。其中，乙醇濃度增至80%時(shí)，毛脈蓼塊根中總蔥醌類(lèi)提取率達(dá)最高，為0.079 1%；之后隨著乙醇濃度繼續(xù)增大，提取率開(kāi)始下降。原因在于隨著乙醇濃度的增加，溶劑極性存在較大的差別，能溶于乙醇的物質(zhì)相互競(jìng)爭(zhēng)消融，使蒽醌類(lèi)化合物不能充分消融，從而使提取率呈下降趨勢(shì)。因此，提取毛脈蓼中蒽醌類(lèi)有效成分的最佳乙醇濃度為80%。

2.2.2提取時(shí)間隨著提取時(shí)間增加蒽醌類(lèi)化合物的提取率呈先升后降趨勢(shì)。其中，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，蒽醌類(lèi)化合物提取率達(dá)最大，為0.081 3%；之后蒽醌類(lèi)化合物的提取率呈逐漸下降趨勢(shì)。因此，毛脈蓼中蒽醌類(lèi)有效成分的最佳提取時(shí)間為1.5 h。

2.2.3提取溫度隨著溫度的不斷增加蒽醌類(lèi)化合物的提取率呈先升后降趨勢(shì)。其中，溫度低于70℃時(shí)，隨溫度增加蒽醌類(lèi)化合物的提取率不斷增加，70℃時(shí)蒽醌類(lèi)化合物的提取率達(dá)最大，為0.080 2%；之后隨著溫度升高，蒽醌類(lèi)化合物的提取率呈下降趨勢(shì)。原因?yàn)檩祯?lèi)化合物具有熱不穩(wěn)定性，隨著溫度的升高蒽醌類(lèi)化合物發(fā)生消融或氧化，致使提取率呈下降趨勢(shì)。因此，提取毛脈蓼中蒽醌類(lèi)有效成分的最佳提取溫度為70℃。

圖2不同因素處理毛脈蓼塊根總蒽醌類(lèi)物質(zhì)的提取率

2.2.4料液比隨著料液比的增加蒽醌類(lèi)化合物的提取率呈先升后降趨勢(shì)。其中，料液比為1∶15時(shí)提取率達(dá)最大，為0.081 1%；之后隨著料液比的增加蒽醌類(lèi)化合物的提取率呈下降趨勢(shì)。因此，提取毛脈蓼中蒽醌類(lèi)有效成分的最佳料液比為1∶15。

2.3毛脈蓼中蔥醌類(lèi)化合物最佳提取工藝的篩選

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取料液比、提取時(shí)間、提取溫度和乙醇濃度進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。從表2和表3可知，方案2和方案6的提取率較高，分別為0.083 1%和0.082 2%，其次是方案4和方案1，提取率分別為0.075 6%和0.072 5%。各因素對(duì)毛脈蓼中蔥醌類(lèi)化合物的提取率影響大小依次為料液比>乙醇濃度>提取時(shí)間>提取溫度。通過(guò)對(duì)各因素k值的比較，確定最佳工藝條件為料液比1∶15，提取時(shí)間1.5 h，提取溫度60℃，乙醇濃度60%。由于選出的最佳條件不在試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中，因此對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。3次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果表明，在此條件下毛脈蓼中蒽醌類(lèi)化合物的提取率為0.083 3%～0.083 8%，平均為0.083 5%。與試驗(yàn)方案2和方案6的提取率接近，說(shuō)明，最佳工藝條件為料液比1∶15，提取時(shí)間1.5 h，提取溫度60℃，乙醇濃度60%。

表1毛脈蓼蒽醌類(lèi)有效成分乙醇提取工藝優(yōu)化的L9 (34)正交試驗(yàn)因素與水平

表2毛脈蓼蒽醌類(lèi)有效成分乙醇提取工藝優(yōu)化的L9 (34)正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

表3毛脈蓼蒽醌類(lèi)有效成分乙醇提取工藝優(yōu)化L9 (34)正交試驗(yàn)的均值與極差

注：k1、k2、k3分別為因素在1、2、3水平時(shí)的提取率；R為極差。

Note:k1，k2andk3are the extraction rates with factors at 1，2 and 3 levels，respectively;Ris the range.

3小結(jié)

研究結(jié)果表明，影響毛脈蓼中蒽醌類(lèi)化合物提取率的因素依次為料液比>乙醇濃度>提取時(shí)間>提取溫度；毛脈蓼中蒽醌類(lèi)化合物的最佳提取工藝為料液比1∶15，溫度60℃，乙醇濃度60%，提取時(shí)間1.5 h，在此條件下提取率最高，為0.083 5%。