毛脈蓼蒽醌類有效成分乙醇提取工藝篩選及優(yōu)化

胡玲玲

(安康學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院， 陜西 安康 725000)

毛脈蓼為蓼科植物，其莖高大，塊根粗糙，質(zhì)地堅(jiān)硬，主要生長(zhǎng)于山川溝壑之中，多地有分布。毛脈蓼的干燥塊根味苦具藥效，被人們稱做朱砂七或朱砂蓮，屬于“太白七藥”之一，為陜西地道的名貴藥材[1-5]。毛脈蓼在秦嶺山脈的儲(chǔ)量十分豐富，為人們的常用藥材。中醫(yī)常用其治療勞累過(guò)度引起的勞傷、損傷，塊莖能治療黃疸性肝炎，中暑所致的腹痛腹瀉、燙傷、蚊蟲引起的腫毒、菌痢和風(fēng)濕腰疼等癥。研究發(fā)現(xiàn)，朱砂七中的蒽醌類化合物可以保護(hù)人體中的正常細(xì)胞免受病毒細(xì)胞侵害，也可以抑制流感病毒；此外，其粗多糖還具有抗氧化、抗腫瘤的作用[6-11]。另有研究[12-17]證明，毛脈蓼還具有抗菌、鎮(zhèn)痛及抗炎作用。陳吉炎等[12]采用紅外光譜和紫外光譜核磁共振的方法確認(rèn)，朱砂七中蒽醌類化合物主要是大黃素和大黃素甲醚。韓公羽等[14-15]從朱砂七中分離出朱砂蓮甲素和朱砂蓮乙素。張秀琴等[18]用極譜法測(cè)得朱砂七中有效成分主要為游離蒽醌和結(jié)合蒽醌，分別為3.15%和10.20%；其可進(jìn)一步細(xì)分為0.05%的大黃素、0.40%的葡萄糖甙、3.10%大黃素甲醚和9.80%葡萄糖甙等。目前，提取毛脈蓼蒽醌類有效成分的方法很多，包括微波法提取、超聲波提取、醇提法和水提法等?？加衿嫉萚19]研究證明，乙醇法提取朱砂七中蒽醌的提取率高于水提法。王曉梅等[20]研究證實(shí)，采用超聲波輔助法提取朱砂七中蒽醌化合物有很多優(yōu)點(diǎn)，但成本較大，提取的蒽醌類成分純度不高。鑒于此，采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)與紫外分光光度計(jì)掃描相結(jié)合的方法對(duì)乙醇法提取毛脈蓼蒽醌類有效成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為提高名貴藥材毛脈蓼的利用率提供參考。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1毛脈蓼毛脈蓼塊根，采自陜西安康。

1.1.2試劑大黃素標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自于中國(guó)藥品生物鑒定所；甲醇，乙醇及其他試劑等均為分析純，市購(gòu)。

1.1.3儀器FW177中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)，101-1AB電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，HJF-300電子天平(深圳市恒之達(dá)儀器有限公司)，RE52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，KH-2500DE超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，L-5S紫外-可見分光光度計(jì)(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱量大黃素標(biāo)準(zhǔn)品0.005 0 g，用2 mL甲醇將其溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，再用蒸餾水定容，搖勻得濃度0.0001 g/mL的貯備液備用。從大黃素標(biāo)準(zhǔn)貯備液中分別移取0.5 mL、1.5 mL、3.5 mL、5.5 mL和7.5 mL的貯備液至5支10 mL的容量瓶中并標(biāo)記為1～5號(hào)，分別加入甲醇溶液搖勻并對(duì)其定容。用紫外分光光度計(jì)分別掃描1～5號(hào)瓶，通過(guò)觀察峰值確定最大吸收波長(zhǎng)為253 nm。在最大吸收波長(zhǎng)253 nm處測(cè)定溶液的吸光度，以測(cè)得吸光度為縱坐標(biāo)，大黃標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1) 乙醇濃度對(duì)提取率的影響。設(shè)5個(gè)處理，考察20%、40%、60%、80%及100%乙醇濃度對(duì)毛脈蓼塊根總蒽醌類物質(zhì)的提取率的影響。其他提取條件依次為溫度60℃，料液比1∶15，提取時(shí)間2.5 h。

2) 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。設(shè)定提取溫度60℃，料液比1∶15，乙醇濃度60%，在此條件下探討不同提取時(shí)間(0.5 h、1.0 h、1.5 h、2 h和2.5 h)對(duì)蒽醌類化合物提取率的影響。

3) 提取溫度對(duì)提取率的影響。設(shè)定料液比1∶15，乙醇濃度60%，提取時(shí)間1.5 h，在此條件下探討不同提取溫度(50℃、60℃、70℃、80℃和90℃)對(duì)蒽醌類化合物提取率的影響。

4) 料液比對(duì)提取率的影響。設(shè)定提取時(shí)間1.5 h，提取溫度60℃，乙醇濃度60%，在此條件下探討料液比(g∶mL)分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20及1∶25對(duì)毛脈蓼蔥醌類化合物提取率的影響。

5) 最佳提取工藝篩選。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取料液比、提取時(shí)間、提取溫度及乙醇濃度4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，利用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選乙醇法提取毛脈蓼中蒽醌類物質(zhì)的最優(yōu)工藝。

1.2.3毛脈蓼中蒽醌類化合物的提取與含量測(cè)定 將毛脈蓼塊根用清水清洗干凈，切成片，然后將所得藥片放入白瓷盤中置于50℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱恒溫干燥24 h，冷卻，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，除去大顆粒。準(zhǔn)確稱取2 g的毛脈蓼塊根粉末，用乙醇溶液進(jìn)行提取，提取液用真空泵進(jìn)行抽濾，將所得的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，濃縮到較粘稠時(shí)再轉(zhuǎn)移到25 mL帶有刻度的比色管中，用甲醇溶解并定容，并用紫外-可見分光光度法測(cè)定提取液的吸光度，根據(jù)大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出提取液中蒽醌類物質(zhì)的質(zhì)量濃度，再按下面的公式計(jì)算得到蒽醌類物質(zhì)的提取率。

提取率=C×V/M×100%

式中，C為由樣品液的吸光度計(jì)算所得樣品液的質(zhì)量濃度(mg)，V為樣品體積(mL)，M為毛脈蓼塊根粉的質(zhì)量(g)。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1可見，大黃標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與其在253 nm處的吸光度(OD值)之間存在線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=0.500 2x+0.100 3，R2=0.998 8，說(shuō)明，二者間線性關(guān)系良好。

圖1大黃標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2不同因素對(duì)毛脈蓼塊根總蒽醌類物質(zhì)提取率的影響

由圖2可知，不同因素對(duì)毛脈蓼塊根總蒽醌類物質(zhì)提取率的影響存在差異。

2.2.1乙醇濃度隨著乙醇濃度增高蒽醌類化合物的提取率呈先升后降趨勢(shì)。其中，乙醇濃度增至80%時(shí)，毛脈蓼塊根中總蔥醌類提取率達(dá)最高，為0.079 1%；之后隨著乙醇濃度繼續(xù)增大，提取率開始下降。原因在于隨著乙醇濃度的增加，溶劑極性存在較大的差別，能溶于乙醇的物質(zhì)相互競(jìng)爭(zhēng)消融，使蒽醌類化合物不能充分消融，從而使提取率呈下降趨勢(shì)。因此，提取毛脈蓼中蒽醌類有效成分的最佳乙醇濃度為80%。

2.2.2提取時(shí)間隨著提取時(shí)間增加蒽醌類化合物的提取率呈先升后降趨勢(shì)。其中，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，蒽醌類化合物提取率達(dá)最大，為0.081 3%；之后蒽醌類化合物的提取率呈逐漸下降趨勢(shì)。因此，毛脈蓼中蒽醌類有效成分的最佳提取時(shí)間為1.5 h。

2.2.3提取溫度隨著溫度的不斷增加蒽醌類化合物的提取率呈先升后降趨勢(shì)。其中，溫度低于70℃時(shí)，隨溫度增加蒽醌類化合物的提取率不斷增加，70℃時(shí)蒽醌類化合物的提取率達(dá)最大，為0.080 2%；之后隨著溫度升高，蒽醌類化合物的提取率呈下降趨勢(shì)。原因?yàn)檩祯惢衔锞哂袩岵环€(wěn)定性，隨著溫度的升高蒽醌類化合物發(fā)生消融或氧化，致使提取率呈下降趨勢(shì)。因此，提取毛脈蓼中蒽醌類有效成分的最佳提取溫度為70℃。

圖2不同因素處理毛脈蓼塊根總蒽醌類物質(zhì)的提取率

2.2.4料液比隨著料液比的增加蒽醌類化合物的提取率呈先升后降趨勢(shì)。其中，料液比為1∶15時(shí)提取率達(dá)最大，為0.081 1%；之后隨著料液比的增加蒽醌類化合物的提取率呈下降趨勢(shì)。因此，提取毛脈蓼中蒽醌類有效成分的最佳料液比為1∶15。

2.3毛脈蓼中蔥醌類化合物最佳提取工藝的篩選

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取料液比、提取時(shí)間、提取溫度和乙醇濃度進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。從表2和表3可知，方案2和方案6的提取率較高，分別為0.083 1%和0.082 2%，其次是方案4和方案1，提取率分別為0.075 6%和0.072 5%。各因素對(duì)毛脈蓼中蔥醌類化合物的提取率影響大小依次為料液比>乙醇濃度>提取時(shí)間>提取溫度。通過(guò)對(duì)各因素k值的比較，確定最佳工藝條件為料液比1∶15，提取時(shí)間1.5 h，提取溫度60℃，乙醇濃度60%。由于選出的最佳條件不在試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中，因此對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。3次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果表明，在此條件下毛脈蓼中蒽醌類化合物的提取率為0.083 3%～0.083 8%，平均為0.083 5%。與試驗(yàn)方案2和方案6的提取率接近，說(shuō)明，最佳工藝條件為料液比1∶15，提取時(shí)間1.5 h，提取溫度60℃，乙醇濃度60%。

表1毛脈蓼蒽醌類有效成分乙醇提取工藝優(yōu)化的L9 (34)正交試驗(yàn)因素與水平

表2毛脈蓼蒽醌類有效成分乙醇提取工藝優(yōu)化的L9 (34)正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

表3毛脈蓼蒽醌類有效成分乙醇提取工藝優(yōu)化L9 (34)正交試驗(yàn)的均值與極差

注：k1、k2、k3分別為因素在1、2、3水平時(shí)的提取率；R為極差。

Note:k1，k2andk3are the extraction rates with factors at 1，2 and 3 levels，respectively;Ris the range.

3小結(jié)

研究結(jié)果表明，影響毛脈蓼中蒽醌類化合物提取率的因素依次為料液比>乙醇濃度>提取時(shí)間>提取溫度；毛脈蓼中蒽醌類化合物的最佳提取工藝為料液比1∶15，溫度60℃，乙醇濃度60%，提取時(shí)間1.5 h，在此條件下提取率最高，為0.083 5%。