余 華, 葉健強(qiáng), 嚴(yán)玉寶, 謝 晶, 胡 娟, 康潤敏, 周岷江, 廖黨金, 崔鵬博, 葉勇剛, 于吉鋒, 肖 璐, 曹 冶, 魏 甬, 李興玉, 林 毅, 潘 夢, 戴卓建
(1.四川出入境檢驗檢疫局, 四川 成都 610041; 2.四川省畜牧科學(xué)研究院, 四川 成都 610066; 3.動物遺傳育種四川省重點實驗室, 四川 成都 610066)
恩拉霉素(Enramycin,Er),又名安來霉素和持久霉素,由日本武田藥品研究所于1966年發(fā)現(xiàn),是放線菌(StreptomycesfungicidiousNO. B5477)發(fā)酵產(chǎn)生的一種由不飽和脂肪酸和十二種氨基酸結(jié)合成的多肽類(Polypepide)抗生素[1-2],其主要成分是恩拉霉素A(C107H138C12N26O31R=CH3)和恩拉霉素B(C108H140C12N26O31R=C2H5OH)。該藥具有很強(qiáng)的抗G+菌作用,用作飼料添加劑能促進(jìn)畜禽生長和提高飼料效率,長期使用不易產(chǎn)生耐藥性,與其他抗生素亦無交叉耐藥;其化學(xué)性能穩(wěn)定,無致突、致畸及致癌作用,殘留極少,適口性好。現(xiàn)已成為當(dāng)前最具發(fā)展前景的獸用抗生素添加劑。
免疫分析法較傳統(tǒng)微生物檢測法、理化檢測法具有簡潔、快速、廉價、特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點,已被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于獸藥殘留的檢測,但至今國內(nèi)外尚無有關(guān)恩拉霉素酶免疫檢測技術(shù)的報道[3-5],僅日本厚生省對該項殘留物質(zhì)有畜、水產(chǎn)性食品常規(guī)檢測技術(shù)報道[6]。因此,開發(fā)我國自主產(chǎn)權(quán)的恩拉霉素殘留檢測方法對恩拉霉素酶免疫檢測技術(shù)具有重要意義。建立相關(guān)免疫學(xué)分析方法,制備出特異性強(qiáng)且效價高的恩拉霉素抗體是關(guān)鍵,必須將其與蛋白質(zhì)載體等大分子載體偶聯(lián)形成人工合成的完全抗原進(jìn)而制備相應(yīng)抗體[7],這也是建立免疫分析過程的前提和關(guān)鍵所在。鑒于此,在恩拉霉素人工抗原合成試驗的基礎(chǔ)上,采用正交試驗對抗原合成條件和主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化,以期為進(jìn)一步制備抗Enramycin多克隆抗體、單克隆抗體及檢測試劑盒奠定基礎(chǔ),并為恩拉霉素殘留檢測方法的建立提供參考。
1.1.1試劑恩拉霉素,純度≥98%,由項目組提純;牛血清白蛋白(BSA),相對分子質(zhì)量67 kDa,上海博奧生物科技公司;卵清蛋白(OVA),相對分子量45 kDa,上?;巧锟萍脊荆桓ナ贤耆魟?FCA)和弗氏不完全佐劑(FICA),Sigma公司;透析袋,截留分子量14 kDa,Sigma公司;戊二醛,成都金山化學(xué)試劑公司;1,4-二氧六環(huán),成都科龍化工試劑廠;Na2HPO4·2H2O,天津博迪化工公司;NaH2PO4和Na2CO3,成都長聊化工試劑有限公司;乙二胺四乙酸二鈉,天津華興精細(xì)化工公司。以上試劑均為分析純。
1.1.2儀器UV2501-PC型紫外掃描儀,日本島津Shimadzu公司;BS124S型電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;BS 100S型分析天平,北京賽多利斯有限公司;ULT1386-3-V38型低溫冰箱,美國REVCO公司;DCD-172K型常規(guī)冰箱,美國伊萊克斯公司;Freeze 6型冷凍干燥機(jī),Labconco公司;DF-101S型智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,河南省予華儀器有限公司。
1.2.1試驗設(shè)計在采用戊二醛法(glutaraldehyde)合成恩拉霉素人工免疫抗原(圖1)的基礎(chǔ)上,選取影響恩拉霉素人工抗原合成偶聯(lián)率的反應(yīng)物質(zhì)量比例、反應(yīng)溶劑比例、溫度及pH等因素,采用L9(34)正交試驗進(jìn)行4因素3水平的試驗因素與水平設(shè)計(表1和表2),以確定恩拉霉素人工抗原合成的最佳方案。其中,溶劑的比例以PBS與1,4-二氧六環(huán)的體積比表示,相同反應(yīng)溫度的各處理在同一全溫培養(yǎng)搖床中進(jìn)行反應(yīng),pH通過緩沖液PBS調(diào)節(jié)及維持。
圖1恩拉霉素人工免疫抗原合成路線
表1恩拉霉素人工免疫抗原合成的 L9 (34) 正交試驗因素與水平
注:表中mBSA、mEr分別為牛血清蛋白(BSA)和恩拉霉素(Enramycin)的質(zhì)量。
Note: mBSAand mErare BSA and Enramycin mass respectively.
表2恩拉霉素人工免疫抗原合成L9(34)正交試驗方案
1.2.2恩拉霉素人工免疫抗原的制備過程取一定量的BSA于一試管中,然后根據(jù)表1中PBS與1,4-二氧六環(huán)的體積比加入相應(yīng)體積的PBS溶液,等BSA完全溶解后即得試驗用溶劑。根據(jù)表2各試驗方案取相應(yīng)量的恩拉霉素分別盛于錐形瓶中,將上述配制的溶劑分別加入其中后搖勻,待恩拉霉素基本溶解后,再向錐形瓶中加入相應(yīng)量的1,4-二氧六環(huán),混勻。將磁力攪拌子放入錐形瓶后將其放入一個盛有水的大燒杯中,于25℃下邊攪拌邊水浴,5 min后在保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)下,向反應(yīng)器內(nèi)逐滴加入0.25%的戊二醛溶液數(shù)5 mL,之后仍保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)反應(yīng)4 h。經(jīng)過透析,干燥后得目標(biāo)物質(zhì)。
1.2.3人工免疫抗原的鑒定及其偶聯(lián)率采用UV2501-PC型紫外掃描儀對Er、BSA和制備的人工免疫抗原進(jìn)行紫外全波段(波長200~400 nm)掃描。當(dāng)Er與BSA偶聯(lián)形成免疫抗原后,其紫外最大吸收波長偏移至Er和BSA特征峰之間,則表明偶聯(lián)成功,得到免疫抗原。根據(jù)吸光度計算各處理恩拉霉素人工免疫抗原的偶聯(lián)率。
1.2.4最佳方案的選擇利用Excel 2016對正交試驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析,根據(jù)極差的大小確定各因素對反應(yīng)的影響;Ki和ki分別為因素第i水平(i=1,2,3)所在處理考查指標(biāo)的總偶聯(lián)率和平均偶聯(lián)率,對Ki和ki進(jìn)行比較,最大即為最優(yōu),以此確定恩拉霉素人工抗原的最佳合成工藝。
從圖2可知,Er標(biāo)準(zhǔn)品紫外最大吸收波長為279 nm,BSA紫外最大吸收波長為278 nm,合成物的紫外最大吸收波長偏移至Er和BSA特征峰之間,表明,Er與BSA偶聯(lián)成功,得到免疫抗原Er-BSA。
圖2恩拉霉素人工免疫抗原與BSA、Er紫外全波段掃描
各處理恩拉霉素人工抗原合成的偶聯(lián)率為17.96~26.04,其中,處理7的偶聯(lián)率最高,為26.04,處理2其次,為25.70,處理8最低,僅17.96。從表3看出,A、B、C和D 4個因素不同水平的極差依次為0.41、0.79、5.90和2.36,表明,4個因素對偶聯(lián)率的影響依次為C>D>B>A,主要影響因素為反應(yīng)物質(zhì)量比和溫度,而pH和反應(yīng)溶劑比例為次要影響因素。結(jié)合圖4對k值(表3)進(jìn)行比較得出,恩拉霉素人工抗原合成的最佳方案為A3B1C2D2,即pH 7.7,VPBS∶V二氧六環(huán)為1∶1,mBSA∶mEr為1∶1,反應(yīng)溫度為28℃。
注:表中Ki為因素A、B、C、D的第i(i=1,2,3)水平所在的試驗考查指標(biāo)偶聯(lián)率之和。
Note:Kipresents the coupling rate sum ati=1, 2 and 3 level of A, B, C and D factors respectively.
圖3 Er-BSA直觀分析圖
對比分析發(fā)現(xiàn),該最佳方案A3B1C2D2不在試驗設(shè)計方案中,但與其中處理7(A3B1C3D2)較接近,處理7僅有反應(yīng)物質(zhì)量比(C因素)未處于最好水平,但其偶聯(lián)率最高。由于確定最佳優(yōu)化方案時不僅要看試驗結(jié)果,同時也要結(jié)合極差分析結(jié)果進(jìn)行綜合考慮,因此,基于對重要因素反應(yīng)物質(zhì)量比(C因素)和溫度(D因素)首選最佳水平,對次要因素反應(yīng)溶劑比例(B因素)和pH(A因素)應(yīng)綜合考慮的原則,確定處理2(A1B2C2D2)為最佳方案,其Er-BSA偶聯(lián)率僅次于處理7,為25.70,居第2位,表明,篩選的最佳方案符合實際,并且節(jié)約反應(yīng)物(純化后的恩拉霉素)。
通過L9(34) 正交試驗方法對一步法合成恩拉霉素人工免疫抗原的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定反應(yīng)物質(zhì)量比和溫度是該反應(yīng)的主要影響因素,最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)物質(zhì)量比( mBSA∶mEr) 為1∶1,反應(yīng)溫度28℃,VPBS∶V二氧六環(huán)為2∶1,pH 6.7,在此條件下,Er-BSA偶聯(lián)率為25.70。
偶聯(lián)物的結(jié)合比是指偶聯(lián)物中半抗原與載體蛋白的分子個數(shù)之比,試驗優(yōu)化方案中符合實際的最佳方案為反應(yīng)物質(zhì)量比( mBSA∶mEr) 為1∶1,反應(yīng)溫度28℃,VPBS∶V二氧六環(huán)為2∶1,pH 6.7,其Er-BSA偶聯(lián)率為25.70,僅次于反應(yīng)條件為反應(yīng)物質(zhì)量比( mBSA∶mEr) 為2∶1,反應(yīng)溫度28℃,VPBS∶V二氧六環(huán)為1∶1,pH 7.7的偶聯(lián)率(26.04),居第2位。不同研究最佳偶聯(lián)比的結(jié)果存在差異,通常認(rèn)為半抗原分子與載體蛋白的偶聯(lián)比為(5~30)∶1最佳[11]。該研究以結(jié)合比適當(dāng)?shù)呐悸?lián)物作為人工抗原,能夠獲得效價高、特異性強(qiáng)的以BSA為載體的偶聯(lián)物。