慢生根瘤菌接種花生的結(jié)瘤能力

黃小娜，譚 芳，姜福純

(黔南民族師范學(xué)院 生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州 都勻 558000)

生物固氮主要包括自生固氮和共生固氮。自生固氮是指某些微生物能夠獨(dú)立地完成固定大氣中的分子氮的作用，這種固氮方式效率低下，固氮量有限[1]。而共生固氮是指固氮微生物和宿主植物共同完成固氮作用，這種固氮量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于自生固氮，是天然的氮肥制造工廠，以豆科植物與根瘤菌的固氮作用最為明顯[2]。根瘤菌是一類生活在土壤中的革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，在合適的條件下，根瘤菌能侵染豆科植物并與之進(jìn)行共生結(jié)瘤固氮，將空氣中游離態(tài)的氮?dú)廪D(zhuǎn)化成植物可以利用的化合態(tài)氮。根瘤菌與豆科植物的共生是生物固氮體系中作用最強(qiáng)的體系，所固定的氮約占生物固氮總量的65%，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著極為重要的作用[3]?；ㄉ?Arachis hypogasa)屬于豆科落花生屬，是世界上種植面積最大的油料作物，由于營(yíng)養(yǎng)豐富而在食品、飼料等領(lǐng)域有著廣泛的用途[4]。花生在生長(zhǎng)過程中，需要大量的氮素，花生根瘤菌能通過側(cè)根杈口(Crack entry)進(jìn)入根的皮層，刺激宿主(豆科植物)皮層細(xì)胞分裂形成根瘤[5]，與花生通過有效的共生固氮作用，可以提供花生生育期所需氮素的50%，花生接種根瘤菌對(duì)花生莢果產(chǎn)量均有一定程度的提高[6]，而花生慢生型根瘤菌的固氮能力高于同類根瘤菌[7]。如果篩選花生根瘤菌中具有較強(qiáng)結(jié)瘤能力和固氮活性的慢生根瘤菌，接種至花生植株，則可以提高花生結(jié)瘤固氮量，減少化學(xué)氮肥用量，改善環(huán)境，還可以提高花生的產(chǎn)量和品質(zhì)，有效降低種植成本，這在研究豆科植物共生固氮方面有著重要意義。在篩選并檢測(cè)花生根瘤菌結(jié)瘤能力和固氮活性時(shí)，一般采用盆栽接種的方法[8]，目前BOX-PCR 技術(shù)被廣泛應(yīng)用于分析大量的固氮細(xì)菌菌株或分離株, 能夠較好地揭示各個(gè)菌株在接種試驗(yàn)中的不同結(jié)瘤能力,為篩選高效菌株和制作混合菌劑或其他生物復(fù)合肥提供研究基礎(chǔ)[9-10]。

OKAZAKI 等[11]發(fā)現(xiàn)光合型慢生根瘤菌(ORS 278)在沒有使用結(jié)瘤因子而是通過某種未知的機(jī)制能在合萌(Aeschynomene indica)植株根際產(chǎn)生固氮根瘤，非光合型慢生根瘤菌(STM 6978)則以依賴性III型分泌系統(tǒng)(T3SS-dependent)產(chǎn)生固氮根瘤，推測(cè)菌株ORS 278與STM 6978有可能與花生形成結(jié)瘤。為此，筆者等對(duì)分離自花生根瘤的3種慢生根瘤菌菌株(DASA 03005、DASA 03183和DASA 03028)與分離自合萌根瘤的2種慢生根瘤菌菌株(ORS 278與STM 6978)進(jìn)行人工接種，檢測(cè)其結(jié)瘤情況、地表植株生物量及固氮酶活性，并采用BOX-PCR技術(shù)，比較分析5種接種菌株DNA指紋圖譜與結(jié)瘤菌株的DNA指紋圖譜之間的差異，為篩選合適的花生根瘤菌菌株及提高花生產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 氣相色譜儀、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、無菌操作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、試管、氣密微量注射器、pH計(jì)、高速離心機(jī)、自動(dòng)PCR儀、電子天平、凝膠電泳儀、電泳槽。

1.1.2 材料 無菌水、0.01%剛果紅、花生種子、蛭石、溴化乙錠(EB)以及瓊脂糖等。

1.1.3 菌株及培養(yǎng)基 試驗(yàn)菌株為5種慢生根瘤菌菌株。DASA 03005、DASA 03183、DASA 03028菌株分離自花生根瘤；ORS 278、STM 6978菌株分離自合萌根瘤；陽性對(duì)照為結(jié)瘤菌株U 110、DOA 9和SUTN 9-2[12-14]。菌株皆為泰國(guó)蘇蘭拉里理工大學(xué)農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所生物技術(shù)學(xué)院NPN實(shí)驗(yàn)室保存。菌株培養(yǎng)用YMA培養(yǎng)基+0.01%剛果紅，BNM營(yíng)養(yǎng)液用于植株培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 盆栽接種試驗(yàn) 采用土培法進(jìn)行盆栽接種試驗(yàn)，試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行。

1.2.2 菌種活化及菌液制備

1) 菌種活化。配制300 mL的YMA培養(yǎng)液，pH為6.8，取200 mL YMA培養(yǎng)液加入3 g瓊脂粉，100 mL不加瓊脂。培養(yǎng)液用高壓蒸汽鍋滅菌30 min，溫度設(shè)置為121 ℃。待200 mL YMA冷卻至60 ℃，滴2～3滴0.01%剛果紅溶液搖勻，在無菌操作臺(tái)中倒平板制作5個(gè)培養(yǎng)基。用接種環(huán)挑選備用菌種單菌落，用平板劃線法接種至培養(yǎng)皿并標(biāo)記，28℃恒溫倒置培養(yǎng)5～7 d。

2) 菌液制備。5支塑料試管高壓滅菌后，在無菌操作臺(tái)上各加入10 mL YMA培養(yǎng)液，用接種環(huán)分別挑選1～2個(gè)單菌落于試管中，封口，搖床培養(yǎng)2～3 d。

1.2.3 種子表面滅菌及催芽 使用蛭石作為基質(zhì)種植花生，挑選籽粒飽、干凈、大小一致花生種子，95%乙醇浸泡10 min，用無菌水清洗3次后棄去廢液，3%次氯酸鈉浸泡1 min，用無菌水清洗5次后浸泡過夜，次日播種于裝滿蛭石的鐵缽(已作滅菌處理)，密封后28℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。

1.2.4 盆栽試驗(yàn)裝置準(zhǔn)備 裝置為L(zhǎng)eonard雙層罐子，蛭石經(jīng)水浸泡后裝滿Leonard罐子上層，密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，冷卻待用。配制pH為6.8的BNM(無氮植物營(yíng)養(yǎng)液)營(yíng)養(yǎng)液10 L ，密封高壓滅菌后冷卻待用。

1.2.5 花生播種與菌株接種 待花生種子芽長(zhǎng)為2～3 cm，在無菌操作臺(tái)上移植到已進(jìn)行滅菌處理的Leonard罐子里，胚根向下，每個(gè)1粒，下層裝入2/3體積的YMA培養(yǎng)液后把Leonard罐子移入光溫室培養(yǎng)。7 d后分別向花生根部接種5種慢生根瘤菌菌株(DASA 03005、DASA 03183、DASA 03028、ORS 278和STM 6978)1 mL菌液，每組菌液接種3株花生，對(duì)照組不接種菌液，總計(jì)6組18株。培養(yǎng)3周并按時(shí)添加BNM營(yíng)養(yǎng)液。

1.2.6 數(shù)據(jù)收集

1) 檢查結(jié)瘤情況及測(cè)定植株干重。3周后，從溫室移出植株，拔出花生植株清理干凈附著在根部的蛭石，檢查空白對(duì)照組有無結(jié)瘤，有結(jié)瘤說明對(duì)照植株被雜菌污染，接種培養(yǎng)失敗，反之則可以繼續(xù)下一步試驗(yàn)，即計(jì)數(shù)試驗(yàn)組植株結(jié)瘤數(shù)并記錄。計(jì)數(shù)結(jié)束，用剪刀剪下植株根部，地上植株部分放在恒溫箱烘干24 h后稱重并記錄數(shù)據(jù)，溫度條件為65℃。

2) 固氮酶活性測(cè)定。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)乙烯峰面積。取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)乙烯注入氣相色譜儀中，記錄峰面積并注意出峰時(shí)間，測(cè)量3次取平均值，作為乙烯定量依據(jù)之一。用氣密微量注射器分別抽取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL乙烯標(biāo)準(zhǔn)氣體，測(cè)定相應(yīng)體積的峰面積，以保留時(shí)間定性分析。繪制體積與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用清水沖洗干凈花生根部，吸掉多余的水分后放入規(guī)格為80 mL的試管中并用橡皮塞密封。定時(shí)(相鄰2個(gè)待測(cè)樣品間隔5 min)用氣密微量注射器從試管中吸取1 mL空氣后注入等體積乙炔氣體，培養(yǎng)1 h。吸取1 mL待測(cè)樣品注入氣相色譜儀開始測(cè)定。色譜條件：進(jìn)樣溫度86 ℃，F(xiàn)ID檢測(cè)溫度200℃。固氮酶活性用乙烯濃度表示，計(jì)算公式[16]：N=(hx×C×V)/(hs×常數(shù)×t)。式中，hx：樣品峰面積；C：標(biāo)準(zhǔn)C2H4濃度(39.499 nmol/mL)；V：試管體積(80 mL)；hs：標(biāo)準(zhǔn)C2H4峰面積；常數(shù)：1 mL(標(biāo)準(zhǔn)乙烯測(cè)試體積)；t：待測(cè)樣品培養(yǎng)時(shí)間(h)；N:產(chǎn)生的C2H4濃度，單位為nmol/(h·mL)。

1.3 BOX-PCRDNA指紋圖譜分析

BOX-PCR技術(shù)的一般分析過程包括以下3個(gè)步驟[17]：基因組DNA的提取,以BoxA1R-1(5′-CCTCGGCAAGGCGACGCTGACG-3′)為引物進(jìn)行選擇擴(kuò)增，凝膠電泳分析。

1.3.1 細(xì)菌總DNA提取 取處于對(duì)數(shù)期的3 mL菌液于離心管中，用0.5 mL 1×TEN(10 mM Tris8.0，10 mM EDTA，100 mM NaCl)緩沖液清洗2次。依次加入含有20%蔗糖溶液的緩沖液300 μL、10% SDS(100 mg/mL) 100 μL、10 mg/mL核糖核酸酶(RNase)30 μL、2 mg/mL溶菌酶(現(xiàn)配)20 μL。旋渦振蕩5 min，混合均勻，然后在37℃下恒溫培養(yǎng)60 min，使其完全溶解。加入5M NaCl 75 μL溶液倒置反復(fù)搖勻，加入500 μL苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)。旋渦振蕩5 min，混合均勻后，14 000 r/min高速離心10 min。收集上清液，加入2體積純乙醇+0.1體積3M NaOAC反復(fù)顛倒5～6次，20℃低溫放置30 min。13 000 r/min高速離心10 min后用70%乙醇洗滌2次；13 000 r/min高速離心5 min后室溫干燥。用50 μL純水溶解DNA，放置于-20℃冰箱備用。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 配制1%瓊脂糖凝膠(用電子天平稱取1 g瓊脂糖，100 mL 5×TAE buffer)，微波爐加熱至完全融化(2 min)。冷卻至60℃倒膠，加入4滴EB溶液，待膠凝固后拔出梳子。將凝膠槽轉(zhuǎn)放入電泳槽，加入5×TAE buffer，保證液面高于凝膠表面，將3 μL DNA樣品和2 μL上樣緩沖液合均勻后加入到凝膠點(diǎn)樣孔，在一側(cè)點(diǎn)樣孔加5 μL Marker。電泳儀電壓設(shè)置為100V，跑膠30 min。停止電泳后凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.3.3 BOX-PCR擴(kuò)增條件 以DNA為模板，BoxAIR-1為引物進(jìn)行選擇擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)物含5 μL 5 × PCR buffer, 2.5 μL MgCl2(25 mM),0.5 μL dNTP(10 mM),0.25 μL DNA聚合酶, 5 μL BoxAIR-1(10 pM)引物,2 μL DNA模板，其中菌株DASA 03028、U 110和SUTN 9-2的DNA量為1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，菌株U 110、DOA 9和SUTN 9-2作陽性對(duì)照，以不加DNA為陰性對(duì)照。BOX-PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min, 94℃變性0.5 min, 53℃退火1 min，56℃延伸8 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)反應(yīng)，69℃最終延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后PCR產(chǎn)物于-20℃冰箱保存。取7 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，1 kb DNA Marker做參照，1%瓊脂糖凝膠。電泳條件：電壓80 V，電流400 mA，時(shí)間48 min。最后用BIORAD凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯標(biāo)準(zhǔn)樣品線性

在 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL乙烯標(biāo)準(zhǔn)氣體條件下測(cè)定相應(yīng)體積的峰面積，以保留時(shí)間(2.5 min)定性分析，繪制體積與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。一般地，當(dāng)R2在0.95～1.0時(shí)表示線性良好。從圖1看出，乙烯標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.992，表明，乙烯標(biāo)準(zhǔn)樣品線性良好。

2.2 試驗(yàn)菌株的基因組DNA

從圖2看出，菌株DASA 03028、U 110和DOA 9的DNA濃度較高，但不影響后續(xù)試驗(yàn)，只需減少DNA的量即可。

2.3 5種菌株接種花生的結(jié)瘤能力

5種菌株接種之后，DASA03005、DASA03028、DASA03183、STM6978和ORS278菌株的單株植株平均結(jié)瘤數(shù)分別為0、93.7個(gè)、91.3個(gè)、75.3個(gè)和0；其單株植株平均干重分別為1 150.6 mg、1 656.2 mg、1 638.8 mg、1 433.1 mg和808.6 mg。從表1看出，接種ORS 278與DASA 03005菌株的花生根部無結(jié)瘤，表明DASA03005、ORS278菌株不能在花生上結(jié)瘤。DASA03028的結(jié)瘤數(shù)略大于DASA03183，STM6978的結(jié)瘤數(shù)相對(duì)前兩者較低，表明花生慢生根瘤菌DASA 03028、DASA 03183有較強(qiáng)的結(jié)瘤能力。接種DASA 03183、DASA 03028和STM6978菌株的花生植株干重較大，結(jié)瘤植株的生物量明顯高于無結(jié)瘤植株。其中，接種菌株DASA03028植株的生物量居第一位，接種菌株DASA03183植株生物量略低，菌株STM6978的植株生物量相對(duì)前兩者較低。接種的菌株結(jié)瘤數(shù)越多，地表植株的生物量也相應(yīng)的較大。表明根瘤固氮可以為地上部植株的生長(zhǎng)提供含氮有機(jī)物，提高作物的光合速率及增加光合產(chǎn)物。

表1 接種5種菌株后花生的根部結(jié)瘤數(shù)及地表植株干重

2.4 5種菌株的固氮酶活性

從圖3看出，DASA03005和ORS278的固氮酶活性為0，這是由于株菌DASA03005和ORS278未能與花生形成結(jié)瘤。DASA03028和 DASA03183的固氮酶活性較高，代表固氮酶活性的乙烯濃度分別為1 351.01 nmol/(h·mL)和1 241.61 nmol/(h·mL)；STM 6978的固氮酶活性相對(duì)較低，其代表固氮酶活性的乙烯濃度為1 013.89 nmol/(h·mL)。表明菌株DASA 03028、DASA 03183具有較強(qiáng)的固氮能力。

2.5 BOX-PCR擴(kuò)增分析

利用BOXA1R引物對(duì)5種菌株和對(duì)照組菌株進(jìn)行選擇擴(kuò)增，通過凝膠電泳分析，獲得菌株的圖譜類型。從圖4看出，以DNA Marker作參照，采用BOX引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶均在1.0～4.0 kp。其中，DASA03028與對(duì)照菌株DOA9和SUTN9-2的圖譜基本一致，DASA03183與DOA9在2.0 kb、3.0kb和4.0kb處的條帶一致；DASA03005雖然有6條帶，但只在3.0 kb和4.0 kb處的2條帶是清晰的，與對(duì)照組有顯著差異；ORS278共有4條清晰的條帶，分別位于1.5 kb、2.0 kb、3.0 kb和4.0 kb處，和3個(gè)對(duì)照組菌株的條帶都有顯著差異；菌株STM6978共有8條帶，其條帶與結(jié)瘤菌株U110的圖譜基本一致。

3 結(jié)論與討論

花生盆栽接種5種慢生根菌株DASA03028、DASA03183、DASA03005、ORS278和STM6978，其中菌株DASA03028、DASA03183和STM6978能與花生形成結(jié)瘤，DASA03005和ORS278不能與花生形成結(jié)瘤。由此可見，分離自花生的慢生根瘤菌不一定都能與花生形成結(jié)瘤。分離自合萌的非光合型慢生根瘤菌菌株STM6978能與花生形成結(jié)瘤，很大程度上可能是依賴于T3SS的緣故。菌株DASA03005和ORS278雖不能與花生形成結(jié)瘤，卻能與合萌形成結(jié)瘤[11]，至于菌株DASA03005是否與光合型慢生根瘤菌菌株ORS278一樣具有某種未知的機(jī)制，且這種機(jī)制是否只能在特定的宿主范圍內(nèi)發(fā)揮作用，有待更進(jìn)一步的研究。

5種菌株中，菌株DASA03028接種花生具有很強(qiáng)的結(jié)瘤能力和固氮活性，DASA03183次之，STM6978較前兩者低。DASA03028與DASA03183在接種花生3周后，花生單株植株結(jié)瘤達(dá)到100個(gè)以上，結(jié)瘤數(shù)相對(duì)DASA03183(單株結(jié)瘤數(shù)最大可達(dá)85個(gè))多。乙炔還原法對(duì)固氮酶活性進(jìn)行測(cè)定顯示，菌株DASA03028和DASA03183的固氮酶活性優(yōu)于菌株STM6978，表明結(jié)瘤數(shù)越多，固氮酶活性越強(qiáng)，結(jié)瘤數(shù)與固氮酶活性之間存在一定的關(guān)系，這一規(guī)律和張宏等人的研究結(jié)論一致[18-20]。通過對(duì)地表植株生物量進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，接種的菌株結(jié)瘤數(shù)越多，地表植株的生物量也相應(yīng)較大，表明根瘤固氮可以為地上部植株的生長(zhǎng)提供含氮有機(jī)物，提高作物的光合速率及增加光合產(chǎn)物[1,12]。接種菌株DASA03028與DASA03183的花生地表植株干重也較接種STM6978的重，表明，根瘤固氮作用越強(qiáng)，植株的干重越重。

通過對(duì)5種菌株的BOX-PCR指紋圖譜分析表明，5種菌株的擴(kuò)增條帶存在多態(tài)性差異，其中菌株DASA03028、DASA03183和STM6978與對(duì)照組菌株的DNA指紋圖譜基本一致，DASA03005和ORS278則差異較大。BOX-PCR指紋圖譜分析技術(shù)能有效區(qū)分種、屬及菌株的遺傳差異，尤其是不同菌株間易產(chǎn)生清晰的特異性條帶，應(yīng)用BOX-PCR 技術(shù)對(duì)根瘤菌菌株進(jìn)行遺傳指紋圖譜分析, 可以揭示不同根瘤菌菌株的結(jié)瘤能力[10], 如果配合植物的生長(zhǎng)性狀，則可以準(zhǔn)確地篩選高效根瘤菌菌株。