石榴五味子保健酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

尹樂斌周 娟李立才金小柯雷志明廖 聰趙良忠

(1. 邵陽學(xué)院生物與化學(xué)工程系，湖南 邵陽 422000； 2. 豆制品加工技術(shù)湖南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基地，湖南 邵陽 422000)

保健酒是指對(duì)人體具有保健作用的飲料酒，在中國已經(jīng)有1 000多年的發(fā)展歷史[1]。隨著人們生活水平的提高，對(duì)健康越來越重視，保健酒行業(yè)迎來了歷史發(fā)展的機(jī)遇期，近年來成為了研究熱點(diǎn)[2]。石榴(PunicagranatumL)是石榴科石榴屬植物石榴的成熟果實(shí)，也被稱作金罌、丹若等[3-4]。其鮮果中總糖含量占14%～18%，適宜作釀酒原料，此外，石榴中還含有多酚類、黃酮類、脂肪酸、生物堿、維生素、鞣質(zhì)等多種生理活性成分[5]，具有抗腫瘤抗炎、抗氧化、保護(hù)肝臟等生理活性作用[6]。五味子[Schisandrachinensis(Turcz) Baill]是木蘭科植物五味子的干燥果實(shí)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心、抗氧化作用[7-8]。目前對(duì)石榴酒的研究主要集中在其發(fā)酵工藝優(yōu)化[9]及澄清條件選擇[10]方面，對(duì)其抗氧化活性能力的探究還鮮有報(bào)道。張洪亞等[11]的研究結(jié)果表明，石榴酒具有較好的體外抗氧化活性及斑馬魚體內(nèi)抗氧化活性，但該文并未報(bào)道石榴酒的釀造工藝及抗氧化有效成分的測(cè)定。

本試驗(yàn)擬以石榴與五味子為原料釀酒，對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)定其體外抗氧化活性，為石榴酒的保健功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

石榴：市售；

五味子：藥店自購；

果膠酶：江蘇富盛德生物工程有限公司；

安琪葡萄酒用高活性酵母：安琪酵母股份有限公司；

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；

蘆?。褐袊幤飞镏破窓z定所；

Folin-Ciocalteu顯色劑：上海麥克林生化科技有限公司；

L-Ascorbic acid(Vc)：生工生物工程(上海)股份有限公司；

2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸) [2,2’-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS]：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；

1,1-二苯基-2-苦肼基自由基[1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical，DPPH]：Sigma公司；

2,4,6-三吡啶三吖嗪[2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ]：上海麥克林生化科技有限公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋：GI54DWS型，濟(jì)寧曲阜圣泰機(jī)械有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：HPX-9272MBE型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

雙人單面(垂直)凈化工作臺(tái)：SW-CJ-2FD型，江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：UV-1780型，島津儀器(蘇州)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 單因素試驗(yàn)方法

(1) 五味子提取液添加量對(duì)石榴五味子保健酒的影響：固定菌種添加量4%，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 d，五味子提取液添加量分別為5%，10%，15%，20%，25%，以酒精度、感官評(píng)分、糖度及酸度為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)石榴五味子保健酒進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

(2) 菌種添加量對(duì)石榴五味子保健酒的影響：固定發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 d，五味子添加量10%，菌種添加量分別為1%，2%，3%，4%，5%，以酒精度、感官評(píng)分、糖度及酸度為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)石榴五味子保健酒進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

(3) 發(fā)酵溫度對(duì)石榴五味子保健酒的影響：固定五味子提取液添加量10%，菌種添加量3%，發(fā)酵時(shí)間6 d，發(fā)酵溫度分別為16，20，24，28，32 ℃，以酒精度、感官評(píng)分、糖度及酸度為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)石榴五味子保健酒進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

(4) 發(fā)酵時(shí)間對(duì)石榴五味子保健酒的影響：固定五味子提取液添加量10%，菌種添加量3%，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間分別為3，4，5，6，7 d，以酒精度、感官評(píng)分、糖度及酸度為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)石榴五味子保健酒進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.3.3 正交試驗(yàn)方法 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行正交試驗(yàn)對(duì)石榴五味子保健酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定方法

(1) 酒精度：按GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測(cè)定》執(zhí)行。

(2) 總糖：采用費(fèi)林法，按GB/T 12456—2008執(zhí)行。

(3) 酸度：采用酸堿滴定法，按GB/T 12456—2008執(zhí)行。

(4) 總酚含量：采用Folin-Ciocalteu法[12]。

(5) 黃酮含量：參照文獻(xiàn)[13]。

(6) 感官評(píng)分：由10位食品專業(yè)人員組成感官評(píng)價(jià)小組，根據(jù)GB/T 15038—2006葡萄酒、果酒通用分析方法，按照表1中的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)石榴五味子保健酒進(jìn)行感官評(píng)定。

(7) 抗氧化活性測(cè)定：參照張洪亞等[11]的方法，將石榴酒原汁分別稀釋不同的倍數(shù)再測(cè)定其DPPH自由基、ABTS自由基、OH自由基的清除活性及鐵離子還原力(Ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP)。DPPH自由基清除率測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]；ABTS自由基清除率測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]；OH自由基清除率測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]；FRAP還原力測(cè)定參照文獻(xiàn)[17]。

表1石榴五味子保健酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

Table1ThesensoryevaluationcriteriaofPomegranateandSchisandrahealthwine

項(xiàng)目評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)得分口味(40分)口感清爽潤(rùn)滑、優(yōu)雅、醇和飽滿21～40口感較清爽、優(yōu)雅、較醇和11～20口感差,入喉黏口、粗糙0～10風(fēng)味(30分)石榴味足,藥香酒香協(xié)調(diào)突出21～30石榴味足,藥香酒香較協(xié)調(diào)11～20石榴味不足,藥香酒香不協(xié)調(diào)0～10色澤(15分)色澤呈亮紅色,均勻,澄清,無明顯沉淀物11～15色澤呈亮紅色稍偏暗,較均勻,較澄清,少許沉淀物6～10色澤偏黃暗沉無光澤,沉淀物明顯0～5風(fēng)格(15分)具有典型風(fēng)格11～15較有典型風(fēng)格6～10缺乏典型風(fēng)格0～5

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Office Excel 2003和Origin 9.0 繪圖軟件及正交設(shè)計(jì)助手軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素結(jié)果與分析

2.1.1 五味子提取液添加量的影響 如圖1所示，隨著五味子提取液添加量的增大，酒精度先下降后趨于穩(wěn)定，感官評(píng)分則呈先略微上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)添加量為10%時(shí)感官評(píng)分最高。這是因?yàn)?，在發(fā)酵之前，將石榴原汁的初始糖度統(tǒng)一調(diào)為18°Bx，而五味子提取液中的主要成分是木脂素、有機(jī)酸、酚類及苷類等物質(zhì)，糖類物質(zhì)少，所以在分裝過程中，隨著五味子提取液添加量的增加，初始發(fā)酵液的糖度也就降低，而酵母發(fā)酵的底物主要是糖類物質(zhì)，故而酒精度略有下降但酵母能利用的糖類物質(zhì)有限，因此之后酒精度趨于穩(wěn)定。另外，五味子本身有一定的刺激性中藥味，添加過少藥味不足，不能體現(xiàn)保健酒特征，添加過多時(shí)，藥味過重與酒味不協(xié)調(diào)，不為人們接受，因此當(dāng)五味子提取液添加量進(jìn)一步增加時(shí)感官評(píng)分降低。殘留糖度、原酒酸度的變化趨勢(shì)基本一致，都是先下降，后基本保持不變(圖2)。殘留糖度的變化主要與初始糖度的變化及酵母發(fā)酵能力有關(guān)。而原酒中有機(jī)酸的來源主要有兩個(gè)方面，一方面是原石榴汁中含有的有機(jī)酸，另一方面是在發(fā)酵過程中乙醇被氧化產(chǎn)生的有機(jī)酸，因此，原酒酸度變化的趨勢(shì)與酒精度的一致。綜上所述，五味子提取液的最佳添加量為10%。

圖1 五味子添加量對(duì)酒精度及感官評(píng)分的影響

圖2 五味子添加量對(duì)糖度及酸度的影響

2.1.2 菌種添加量的影響 隨著酵母菌添加量的增加，酒精度和感觀評(píng)分都呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)酵母菌添加量為3%時(shí)，達(dá)到最高(圖3)。這是因?yàn)楫?dāng)菌種添加量過少時(shí)，石榴五味子保健酒發(fā)酵不完全，酒精度過低，無法掩蓋五味子的藥味，另外甜度也太高，原酒呈現(xiàn)出來的風(fēng)格很不協(xié)調(diào)。隨著菌種添加量的增加，酒精度逐漸升高，糖類物質(zhì)含量下降，原酒呈現(xiàn)的風(fēng)味也越來越協(xié)調(diào)；但是，當(dāng)菌種添加量繼續(xù)增加時(shí)，由于菌數(shù)過多，部分酵母自溶使原酒出現(xiàn)苦味，另外，由于酒精生成的速度過快，在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，部分酒精發(fā)生氧化生成醛、酸等，一方面酒精度降低，另一方面還會(huì)出現(xiàn)“上頭”的癥狀，原酒的口感也較差。原酒的酸度受酒精度的影響一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而殘?zhí)堑牧侩S著菌種的增加呈逐漸降低最后基本保持不變的趨勢(shì)(圖4)。這是因?yàn)榫N添加過少時(shí)，發(fā)酵不完全，導(dǎo)致殘?zhí)呛扛?，由于酵母能利用的糖類是有限的，所以，盡管菌種添加量在增加，殘?zhí)堑牧恳膊蛔?。綜合各方面因素，最終確定菌種添加量為3%。

圖3 菌種添加量對(duì)酒精度及感官評(píng)分的影響

圖4 菌種添加量對(duì)糖度及酸度的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度的影響 發(fā)酵溫度對(duì)石榴五味子保健酒品質(zhì)影響比較明顯，如圖5所示，酒精度隨著溫度的升高而升高，而感官評(píng)分隨著溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是在一定范圍之內(nèi)，酵母的代謝活動(dòng)隨著溫度的升高而加快，酒精的產(chǎn)量也隨之增多，產(chǎn)品風(fēng)味逐漸變得豐滿[18]?？墒堑搅艘欢囟纫院螅湍傅拇x活動(dòng)受到抑制，酒精度增長(zhǎng)開始變得緩慢。與此同時(shí)，由于發(fā)酵溫度升高，原酒中甲醇和雜醇油含量增高[19]，原酒品質(zhì)變差，飲用過后容易出現(xiàn)頭暈癥狀，原酒的感官評(píng)分降低。如圖6所示，原酒的酸度隨著溫度升高而不斷增加這是因?yàn)闇囟壬咭院?，乙醇轉(zhuǎn)變成乙酸的反應(yīng)也加快，28 ℃以后酸度上升趨勢(shì)變得明顯。殘?zhí)呛縿t受酵母代謝活動(dòng)的影響隨著溫度升高呈明顯的下降趨勢(shì)，到一定程度以后，由于酵母能利用的糖濃度有限，所以呈基本不變的趨勢(shì)，結(jié)合各方面因素確定最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)酒精度及的感官評(píng)分影響

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)糖度及酸度的影響

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間的影響 在其他發(fā)酵條件都確定的情況下，發(fā)酵時(shí)間主要影響的是感官評(píng)分，從圖7可以看出，酒精度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后略有下降的趨勢(shì)，而感官評(píng)分則呈先上升后下降的趨勢(shì)，酸度在整個(gè)發(fā)酵過程中都緩慢上升(圖8)。這主要是由于隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酒精積累上升，酒的品質(zhì)也逐漸變得豐滿，可是到了一定時(shí)間以后，殘?zhí)呛坎蛔?，酒精度增加抑制了酵母的生長(zhǎng)繁殖，部分酵母發(fā)生自溶，使原酒產(chǎn)生了苦味物質(zhì)從而影響感官評(píng)分。由于發(fā)酵容器體積一定所以空間中氧的含量也是一定的，因此抑制了酒精的氧化，這就是隨時(shí)間的延長(zhǎng)酒精度下降不明顯，酸度上升也不明顯的原因。因此，確定發(fā)酵時(shí)間5 d為最佳。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度及感官評(píng)分的影響

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)糖度及酸度的影響

2.2 正交結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以五味子提取液添加量、菌種添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為變量，進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平表見表2，通過感官評(píng)分確定石榴五味子保健酒最佳生產(chǎn)工藝條件，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2石榴五味子保健酒正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

Table2ThefactorandleveloftheorthogonaltestofPomegranateandSchisandrahealthwine

水平A五味子提取液添加量/%B菌種添加量%C發(fā)酵溫度/℃D發(fā)酵時(shí)間/d15224421032853154326

表3石榴五味子保健酒正交試驗(yàn)結(jié)果

Table3TheorthogonaltestresultsofPomegranateandSchisandrahealthwine

試驗(yàn)號(hào)ABCD感官評(píng)分1111168.02122286.53133384.14212378.35223186.06231280.37313273.28321384.29332185.3k179.573.177.579.7k281.585.583.380.0k380.983.281.182.2極差R2.012.45.82.4

由表3可知，各因素對(duì)石榴五味子保健酒感官評(píng)分的影響程度大小依次為B>C>D>A，工藝最優(yōu)組合為A2B2C2D3。對(duì)正交試驗(yàn)中各因素的相關(guān)性進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4。

表4 石榴五味子保健酒方差分析表

由表4可知，菌種添加量對(duì)石榴五味子保健酒的感官質(zhì)量的影響顯著，五味子提取液添加量，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)石榴五味子保健酒感官質(zhì)量的影響不顯著。綜上所述，石榴五味子保健酒的最優(yōu)工藝組合為五味子提取液添加量10%、菌種添加量3%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間6 d。在此條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得酒品色澤艷若朝霞，藥香酒香協(xié)調(diào)，優(yōu)雅，酒精度為12.8% vol，感官評(píng)分平均為89分，總酸(以乳酸計(jì))為4.4 g/L，總糖(以葡萄糖)為63.0 g/L，黃酮、總酚含量分別為13.29，413.00 mg/L。

2.3 產(chǎn)品抗氧化分析

2.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用 產(chǎn)品不同稀釋倍數(shù)及不同濃度VC對(duì)DPPH自由基清除活性如圖9所示。從圖9可以看出，隨著樣品稀釋的不斷減少及VC濃度的不斷增加對(duì)DPPH自由基的清除率也不斷增加，當(dāng)產(chǎn)品稀釋倍數(shù)為100倍時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除活性達(dá)到了92.38%，與濃度為0.032 mg/mL的VC清除能力相當(dāng)，后繼續(xù)增加樣品濃度，對(duì)DPPH自由基的清除效果增加不明顯，說明在本研究所述的石榴五味子保健酒發(fā)酵工藝條件下得到的產(chǎn)品對(duì)DPPH自由基的清除活性較強(qiáng)。

2.3.2 對(duì)ABTS自由基的清除作用 產(chǎn)品及VC對(duì)ABTS自由基的清除效果略好于對(duì)DPPH自由基的清除效果(圖10)，VC濃度為0.032 mg/mL時(shí)對(duì)ABTS自由基的清除率達(dá)到了99.24%，比同濃度VC對(duì)DPPH自由基清除率高了6.86%。隨著產(chǎn)品濃度的增加，對(duì)ABTS自由基的清除活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)產(chǎn)品稀釋100倍時(shí)，對(duì)ABTS自由基的清除活性達(dá)到95.20%相當(dāng)于0.024 mg/mL VC的，表明產(chǎn)品清除效果明顯。

圖9 產(chǎn)品稀釋倍數(shù)、Vc濃度與DPPH自由基清除率之間的關(guān)系

Figure 9 The relationship between product dilution times and DPPH radical scavenging rate (n=3)

圖10 產(chǎn)品稀釋倍數(shù)、Vc濃度與ABTS自由基清除率之間的關(guān)系

Figure 10 The relationship between product dilution times and ABTS free radical clearance (n=3)

2.3.3 產(chǎn)品對(duì)OH自由基的清除作用 OH自由基具有強(qiáng)氧化活性，是生物機(jī)體內(nèi)活性氧代謝的產(chǎn)物，能引發(fā)不飽和脂肪酸的過氧化反應(yīng)，對(duì)機(jī)體損傷極大[11,20]。圖11表示的是樣品稀釋倍數(shù)與OH自由基的清除關(guān)系，從圖11 中可以看出，VC對(duì)OH自由基的清除效果很好，濃度僅為0.020 mg/mL 的VC清除率就能達(dá)到99.58%，而樣品對(duì)OH自由基表現(xiàn)出的清除效果就遠(yuǎn)不如對(duì)DPPH自由基與ABTS自由基，但依然表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除活性，當(dāng)樣品稀釋倍數(shù)為10倍時(shí)對(duì)OH自由基的清除活性能達(dá)到90%以上。

2.3.4 FRAP還原力 FRAP被廣泛用于食品保健品抗氧化分析，其反應(yīng)原理是在pH條件下，利用亞鐵離子與TPTZ生成藍(lán)紫色復(fù)合物來測(cè)量樣品抗氧化能力，藍(lán)紫色越深說明抗氧化能力越強(qiáng)，由圖12可以看出，當(dāng)VC的濃度達(dá)到0.032 mg/mL時(shí)其還原能力已經(jīng)達(dá)到上限，而石榴五味子保健酒的還原力雖然隨著稀釋倍數(shù)的降低逐漸升高，但還遠(yuǎn)不如VC。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出產(chǎn)品的抗氧化活性較強(qiáng)，一方面是因?yàn)楫a(chǎn)品綜合了石榴中含有大量酚類物質(zhì)，且在發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)不會(huì)存在大的損失[21]；另外一方面是因?yàn)槭裰杏袡C(jī)酸含量多使樣品pH較低，樣品中的花青素得以保留[22]。除此之外，五味子也表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。

圖11 產(chǎn)品稀釋倍數(shù)、Vc濃度與OH自由基清除率之間的關(guān)系

Figure 11 The relationship between product dilution times and OH free radical clearance (n=3)

Figure 12 The relationship between product dilution times and FRAP reducing power (n=3)

3 結(jié)論

石榴五味子保健酒的最優(yōu)工藝條件為五味子提取液添加量10%、菌種添加量3%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間6 d。該工藝條件下制得的石榴五味子保健酒色澤均勻、艷若朝霞，優(yōu)雅、澄清無沉淀，藥香酒香協(xié)調(diào)，口味醇厚，石榴滋味突出，整體風(fēng)格獨(dú)特，黃酮、總酚含量分別為13.29，413 mg/L。對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行了DPPH、ABTS、OH自由基的清除除活性及FRAP還原力的測(cè)定，結(jié)果表明在此工藝下生產(chǎn)制作的石榴五味子保健酒具有較強(qiáng)的抗氧化活性。