海藻酸鈉沒(méi)食子酸衍生物的制備及性能分析

楊潔鈺 曾凡坤 鐘金鋒 覃小麗

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

海藻酸鈉(sodium alginate，SA)主要從褐藻、海帶中分離得到，是一種由α-L古羅糖醛酸和β-D甘露糖醛酸連接起來(lái)的天然多糖，具有良好的生物相容性和降解性[1]，常用作新鮮農(nóng)產(chǎn)品的初步涂膜保鮮和復(fù)合膜封裝保鮮，同時(shí)，也可作為食品增稠劑及部分食品營(yíng)養(yǎng)因子的載體[2-3]，是一種非常有前景的多糖，但SA性能單一，在食品領(lǐng)域的應(yīng)用存在一定的局限性。沒(méi)食子酸(gallic acid，GA)是一種典型的酚類(lèi)物質(zhì)，具有多種有價(jià)值的生物活性，其結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)酚羥基，表現(xiàn)出強(qiáng)抗氧化[4-5]、抑菌[6]、抗炎、抗癌[7-8]等特性。因此，研究SA的衍生化產(chǎn)物，賦予其新的性能，對(duì)拓展SA在食品領(lǐng)域應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義。

目前，已有通過(guò)碳化二亞胺基化學(xué)偶聯(lián)法、酶催化法、自由基引發(fā)法將GA、咖啡酸和阿魏酸等酚酸接枝到殼聚糖上[9-10]，自由基引發(fā)法將兒茶素接枝到SA上等接枝改性多糖及其相關(guān)性能的研究報(bào)道[11]，接枝改性后的多糖理化性質(zhì)和生物活性得到改善，具有更好的水溶性、抗氧化性和抑菌性等，現(xiàn)已有殼聚糖沒(méi)食子酸衍生物應(yīng)用于鮮切蘋(píng)果、銀鯧魚(yú)保鮮的研究[12-13]，但關(guān)于海藻酸鈉接枝沒(méi)食子酸衍生物的性能及其應(yīng)用還未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬采用自由基引發(fā)法，以抗壞血酸、過(guò)氧化氫為自由基引發(fā)劑，制備海藻酸鈉—沒(méi)食子酸衍生物(sodium alginate-gallic acid derivative，GA-SA)，探索自由基引發(fā)劑添加總量對(duì)接枝度的影響，對(duì)GA-SA性能進(jìn)行分析并研究其對(duì)車(chē)?yán)遄拥谋ｕr效果，為GA-SA在食品涂膜保鮮上的應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉(純度≥98.0%)、沒(méi)食子酸(純度≥98.5%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)：南京都萊生物技術(shù)有限公司；

車(chē)?yán)遄樱菏匈?gòu)；

Folin-Ciocalteu：北京索萊寶科技有限公司；

溴化鉀：光譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

30%過(guò)氧化氫溶液：分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；

抗壞血酸：分析純，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心；

碳酸鈉：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 試驗(yàn)儀器

冷凍干燥機(jī)：FD-1A-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-6100型，上海元儀器有限公司；

鎢燈絲掃描電子顯微鏡：JSM-6510LV10800型，日本JEOL公司；

紅外光譜：Spectrum 100型，美國(guó)PerkinElmer公司；

拉曼光譜儀：DXR2型，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；

差示掃描量熱儀：DSC4000型，美國(guó)PerkinElmer公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 GA-SA的制備 參考文獻(xiàn)[14]的方法，修改如下：在250 mL三口燒瓶中，取1.0 g SA溶于100 mL超純水，30 ℃水浴加熱并攪拌使SA完全溶解。通氮?dú)? min 以除去氧氣，保持過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)和抗壞血酸(ascorbic acid，AA)的摩爾比(3.5∶1.0)不變，添加不同量的H2O2和AA，然后繼續(xù)通氮?dú)獠嚢?0 min，加入1.0 g GA，反應(yīng)溫度25 ℃磁力攪拌24 h。根據(jù)文獻(xiàn)[14]的透析方法進(jìn)行透析，以去掉游離的GA，將混合物倒入透析袋(MWCO 3 500 Da)中，用去離子水長(zhǎng)時(shí)間透析，每8 h更換一次去離子水。透析結(jié)束后，經(jīng)真空冷凍干燥后得到最終產(chǎn)物，密封袋封裝。對(duì)照樣除不添加GA外，其他操作同上。

1.3.2 GA-SA接枝度的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[15]報(bào)道的Folin-Ciocalteu法，修改如下：準(zhǔn)確配制3 mg/mL的GA-SA溶液，取2 mL該溶液與1 mL Folin-Ciocalteu試劑(10倍稀釋)于10 mL容量瓶中，避光靜置5 min后，加入15% Na2CO3溶液2 mL，去離子水定容并搖勻，25 ℃避光靜置2 h，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)750 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以相同的方式制備不同濃度的GA標(biāo)準(zhǔn)品，繪制GA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。GA-SA的接枝度表示為每克GA-SA含有的GA的毫克量，按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

DG——接枝度，mg/g；

m1——GA-SA中GA質(zhì)量，mg；

m2——GA-SA質(zhì)量，g。

1.3.3 GA-SA的性能分析

(1) 傅里葉紅外光譜：采用溴化鉀壓片法[14]。

(2) 拉曼光譜：將樣品均勻地鋪在單凹載玻片的凹部，用MPlan 20×/0.40物鏡觀察，選取成像清晰典型的區(qū)域進(jìn)行拉曼激光散射。測(cè)量拉曼光譜范圍3 378～50 cm-1，曝光時(shí)間10 s，曝光30次。光闌選用50 μm狹縫，激光波長(zhǎng)785 nm，激光能量30.0 mW，采用拉曼光譜儀自帶的操作軟件采集及處理拉曼圖譜。

(3) 差示掃描量熱分析：使用差示掃描量熱儀進(jìn)行測(cè)試將樣品置于PE鋁盤(pán)內(nèi)，蓋上鋁蓋，固態(tài)壓片機(jī)密封鋁盒，熱分析從25 ℃升到400 ℃，加熱速率10 ℃/min，氮?dú)庾鳛榇祾邭夂捅Ｗo(hù)氣，空白鋁盒作為對(duì)照。

(4) 掃描電子顯微鏡觀察：采用掃描電鏡系統(tǒng)檢測(cè)SA和GA-SA的微觀表面形態(tài)特征變化。將樣品固定在樣品架上并噴射一層薄金，高真空條件及20 kV的加速電壓下進(jìn)行SEM檢測(cè)并選取具有代表性的區(qū)域拍攝，放大倍數(shù)為200倍和1 000倍。

(5) GA-SA的抗氧化活性測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)[11,16]中的測(cè)定方法，修改如下：取5 mL不同濃度的GA-SA溶液和5 mL 無(wú)水乙醇配制的80 μg/mL DPPH自由基溶液于具塞試管中，搖勻后25 ℃避光靜置3 h，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)517 nm 處測(cè)吸光度，按式(2)計(jì)算清除率。同時(shí)測(cè)定SA和GA對(duì)DPPH自由基的清除率。

(2)

式中：

R——清除率，%；

A1——待測(cè)液與DPPH自由基溶液吸光度值；

A0——5 mL DPPH自由基溶液與5 mL去離子水的吸光度；

A2——5 mL待測(cè)液與5 mL無(wú)水乙醇的吸光度。

1.3.4 GA-SA對(duì)車(chē)?yán)遄颖ｕr作用研究 挑選色澤紅潤(rùn)，大小均勻，無(wú)腐爛無(wú)損傷新鮮的車(chē)?yán)遄庸麑?shí)，分為3組，每組15個(gè)。將各組車(chē)?yán)遄臃謩e置于濃度為10 mg/mL GA-SA溶液、SA溶液中浸泡10 min，以去離子水浸泡10 min 的車(chē)?yán)遄幼鳛榭瞻讓?duì)照組，瀝干、放在紙盤(pán)中，并用紙盤(pán)蓋好，置陰涼通風(fēng)處放置。每天觀察稱(chēng)重并拍照記錄，按式(3)計(jì)算車(chē)?yán)遄拥馁|(zhì)量損失。

(3)

式中：

WR——車(chē)?yán)遄淤|(zhì)量損失率，%；

m0——貯藏前果實(shí)質(zhì)量，g；

m1——貯藏后果實(shí)質(zhì)量，g。

車(chē)?yán)遄拥母癄€率按式(4)計(jì)算：

(4)

式中：

DR——車(chē)?yán)遄痈癄€率，%；

N0——果實(shí)總個(gè)數(shù)；

N1——腐爛果實(shí)個(gè)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各試驗(yàn)重復(fù)2次，各樣品的指標(biāo)平行測(cè)定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05時(shí)判斷組間存在顯著差異)，用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GA-SA的接枝度

Liu等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)H2O2和AA添加量會(huì)影響最終的多糖分子自由基產(chǎn)生量，進(jìn)而影響衍生物最終的接枝度，說(shuō)明H2O2和AA的添加量對(duì)接枝度有重要影響。本研究固定H2O2和AA的添加比例，考察不同添加量H2O2和AA對(duì)GA-SA接枝度的影響。由圖1可知，隨著自由基引發(fā)劑添加量增多，接枝度先增高后降低。當(dāng)自由基引發(fā)劑添加量為5.54 mmol時(shí)，接枝度最高，可能是隨著H2O2和AA添加量增多， 產(chǎn)生的羥基自由基和抗壞血酸自由基增多，促使GA與SA接枝反應(yīng)機(jī)率升高，所以接枝度升高。然而，自由基引發(fā)劑添加量繼續(xù)增多(≥8.31 mmol)時(shí)，接枝度呈下降趨勢(shì)，可能是產(chǎn)生的羥基自由基和抗壞血酸自由基過(guò)多，且二者之間發(fā)生反應(yīng)最終使AA降解為脫氫抗壞血酸[17]，產(chǎn)生的自由基因此而減少，導(dǎo)致SA與GA的接枝反應(yīng)程度降低。綜上所述，當(dāng)固定H2O2和AA摩爾比為3.5∶1.0，添加H2O2和AA 5.54 mmol時(shí)，得到最高的接枝度(4.260 mg/g)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 GA-SA的性能分析

2.2.1 傅里葉紅外光譜 圖2是SA、GA、GA和SA的物理共混物和GA-SA(接枝度4.260 mg/g)的傅里葉紅外光譜。SA和GA在3 400～3 200 cm-1波數(shù)處均有強(qiáng)而寬的吸收峰，這是由分子內(nèi)或分子間O—H伸縮振動(dòng)引起；SA在3 020 cm-1波數(shù)處和GA在2 930 cm-1波數(shù)處的吸收峰均是C—H伸縮振動(dòng)峰；可見(jiàn)在3 400～2 900 cm-1的O—H和C—H伸縮非2種物質(zhì)的特征結(jié)構(gòu)[19]。SA是一種多糖，其特征峰包括在1 596，1 404 cm-1附近的COO—對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰；在1 150 cm-1波數(shù)處糖結(jié)構(gòu)中吡喃糖環(huán)C—O—C橋的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰；以及在1 060，1 024，900 cm-1波數(shù)處的C—C和C—O伸縮振動(dòng)吸收峰[19-21]。GA是一種苯酚，其主要特征峰是1 028 cm-1波數(shù)處的苯環(huán)振動(dòng)吸收峰[19]。以上SA與GA的特征峰在GA和SA的物理共混物的紅外光譜中均可見(jiàn)，而GA-SA的紅外光譜與SA和GA的都不同，說(shuō)明GA-SA中2物質(zhì)非簡(jiǎn)單疊加，而是存在強(qiáng)的相互作用。其中GA和SA的物理共混物、GA在1 700 cm-1波數(shù)處的吸收峰，是由GA中的羧基振動(dòng)引起，而此峰在GA-SA紅外光譜中未出現(xiàn)，說(shuō)明GA中的羧基全部參與了接枝反應(yīng)；此外，相比SA，GA-SA在1 735 cm-1波數(shù)處可觀察到一個(gè)新的吸收峰，它是由酯基振動(dòng)引起，表明GA與SA發(fā)生了酯化反應(yīng)，GA與SA之間形成酯鍵，GA已有效接枝到SA上，與Hu等[14]報(bào)道的殼聚糖沒(méi)食子酸衍生物出現(xiàn)酯鍵類(lèi)似。

圖2 SA、GA、GA和SA物理共混物和GA-SA

Figure 2 Infrared spectra of SA, GA, GA and SA physical mixture and GA-SA(grafting degree 4.260 mg/g)

2.2.2 拉曼光譜 圖3是GA、GA-SA(接枝度4.260 mg/g)和SA的拉曼光譜。SA中特征峰包括1 612 cm-1和1 415 cm-1附近的COO-不對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰；1 200～900 cm-1的C—O—H變形、C—O和C—C伸縮振動(dòng)吸收峰；700 cm-1處及以下糖結(jié)構(gòu)中的吡喃糖環(huán)變形和C—O—C糖苷鍵振動(dòng)吸收峰[22-23]。GA的特征峰包括1 691 cm-1處C—O伸縮振動(dòng)吸收峰，1 621 cm-1處芳環(huán)的C—C伸縮振動(dòng)吸收峰，1 399～1 300 cm-1處C—H基團(tuán)拉伸和—OH彎曲振動(dòng)吸收峰，以及200 cm-1以下由GA中的晶格振動(dòng)引起的強(qiáng)烈吸收峰[24]。GA-SA與SA拉曼光譜差異不明顯，GA中的特征峰并非都在GA-SA中出現(xiàn)，說(shuō)明GA與SA之間有較強(qiáng)的相互作用。相比SA，GA-SA在1 726 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，它是拉曼光譜中代表酯基的特征峰，表明GA與SA發(fā)生酯化反應(yīng)形成了酯鍵，GA接枝到了SA上，與Cadilia等[25]報(bào)道的海藻酸鈉殼聚糖微膠囊中出現(xiàn)的酯鍵類(lèi)似。

圖3 GA、GA-SA(接枝度4.260 mg/g)和SA拉曼光譜

2.2.3 差示掃描量熱分析 由圖4可看出，GA-SA(接枝度4.260 mg/g)與SA的熱分析圖差異明顯。SA在98 ℃出現(xiàn)吸熱峰，而GA-SA的吸熱峰降低到82 ℃，該吸熱峰是因?yàn)槎嗵侵麈溨兴值膿p失。通常，與水分蒸發(fā)相關(guān)的吸熱現(xiàn)象可一定程度反映接枝過(guò)程中的物理和分子變化；GA-SA的吸熱峰溫度降低，可能是GA進(jìn)入SA骨架導(dǎo)致其保水能力下降所致。SA在295，322 ℃附近出現(xiàn)2個(gè)小的放熱峰，GA-SA僅在322 ℃附近有一個(gè)寬而明顯的放熱峰，該放熱峰是由多糖鏈的降解引起[26]。GA-SA的降解溫度升高表明其熱穩(wěn)定性升高；放熱峰的變化可能是GA接枝在SA上，使SA鏈上增加了新的基團(tuán)，對(duì)衍生物的分子結(jié)構(gòu)和分子排列產(chǎn)生影響[11]。

圖4 SA和GA-SA(接枝度4.260 mg/g)的DSC熱分析圖

Figure 4 DSC thermal analysis of SA and GA-SA(grafting degree 4.260 mg/g)

2.2.4 掃描電子顯微鏡觀察 在掃描電鏡下觀察冷凍干燥的SA和GA-SA(接枝度4.260 mg/g)的表面形態(tài)，可以看到明顯的差異。由圖5可知，真空冷凍干燥的SA呈薄片狀且表面平滑，片塊連續(xù)均勻，邊緣較為光滑，結(jié)構(gòu)致密，可能是SA中存在強(qiáng)的分子間和分子內(nèi)氫鍵[14]。冷凍干燥后的GA-SA與SA相比，并非呈連續(xù)致密的光滑薄片狀，其均勻性較差，結(jié)構(gòu)較為松散，表面粗糙并出現(xiàn)明顯空隙，有較為明顯的顆粒狀物質(zhì)，邊緣呈鋸齒狀，可能是接枝改性后GA-SA短鏈較多，分子間氫鍵減少，分子間作用不強(qiáng)，不易形成緊密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因而呈現(xiàn)出粗糙的表面結(jié)構(gòu)[19]；也可能是GA-SA比SA具有更好的溶解性和較小的黏度。

A. a分別是 SA放大200，1 000倍 B. b分別是 GA-SA放大200，1 000 倍

圖5 SA和GA-SA(接枝度4.260 mg/g)的掃描電鏡圖

Figure 5 SEM images of SA and GA-SA(grafting degree 4.260 mg/g)

2.2.5 GA-SA的抗氧化活性 圖6是不同質(zhì)量濃度的GA、GA-SA(接枝度4.260 mg/g)和SA對(duì)DPPH自由基的清除率。當(dāng)SA濃度在0.25～4.00 mg/mL時(shí)，SA對(duì)DPPH自由基清除率始終不超過(guò)5.2%；清除率不隨SA濃度增加而增加，表明SA的抗氧化性極低，可能是SA分子間和分子內(nèi)氫鍵 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及較差的供氫能力抑制了對(duì)自由基的清除能力[27-28]。GA作為一種天然抗氧化劑分子，在濃度低至0.25 mg/mL 時(shí)仍然有較高的DPPH自由基清除率，且明顯高于GA-SA和SA。隨著濃度的增加，GA-SA對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸增加，當(dāng)濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到92.0%，接近GA的清除率(95.0%)，表明GA與SA接枝極大地提高了GA-SA的DPPH自由基清除活性，可能是改性后GA-SA的活性羥基增多，能提供更多質(zhì)子與DPPH自由基結(jié)合生成穩(wěn)態(tài)的DPPH2，進(jìn)而有效地清除DPPH自由基[28]。圖7是添加不同量H2O2和AA時(shí)，GA-SA的接枝度及其對(duì)DPPH自由基的清除率(GA-SA濃度均為1 mg/mL)，GA-SA接枝度為2.905，4.260，3.290，3.083 mg/g 時(shí)，DPPH清除率分別為60.59%，76.04%，68.00%，65.10%，且清除率存在顯著差異，表明SA鏈上的GA在GA-SA的抗氧化活性中起著至關(guān)重要的作用。

2.3 GA-SA對(duì)車(chē)?yán)遄拥谋ｕr作用

車(chē)?yán)遄邮且环N營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的鮮食水果，但其皮較薄，耐貯穩(wěn)定性差，易敗壞，因此，本研究擬探索SA衍生物對(duì)車(chē)?yán)遄淤A藏過(guò)程中的保鮮效果。車(chē)?yán)遄淤A藏過(guò)程中的質(zhì)量損失率和果實(shí)腐敗率是檢驗(yàn)其是否耐貯藏的重要指標(biāo)[29]。圖8 是空白組、SA組和GA-SA(接枝度4.260 mg/g)組車(chē)?yán)遄淤A藏過(guò)程果實(shí)腐爛率折線圖。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組車(chē)?yán)遄拥母癄€率均呈逐漸上升趨勢(shì)。與空白組和SA組相比，GA-SA組車(chē)?yán)遄痈癄€率明顯較低?？瞻捉M和SA組貯藏3 d以上腐爛率均急劇上升，而GA-SA組腐爛率上升緩慢。第6天時(shí)，空白組和SA組腐爛率已有20.00%，而GA-SA組腐爛率仍為0%。第12天時(shí)，空白組腐爛率76.67%，SA組腐爛率53.33%，GA-SA組腐爛率20.00%。相比于SA，GA-SA的抗氧化性和抑菌性均有所提高，可能是GA-SA 中的酚類(lèi)物質(zhì)起到了作用，在車(chē)?yán)遄庸麑?shí)表面形成一層抗氧化且抑菌的保護(hù)膜，避免了空氣中氧氣的氧化作用和微生物的入侵。圖9是空白組、SA組和GA-SA組的果實(shí)質(zhì)量損失率折線圖。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，3組果實(shí)均有質(zhì)量的損失，但GA-SA組的車(chē)?yán)遄淤|(zhì)量損失率明顯低于空白組和SA組。從第6天開(kāi)始，空白組、SA組和GA-SA組的質(zhì)量損失率分別為18.74%，14.95%，10.77%，3組的質(zhì)量損失率存在顯著差異；表明GA-SA涂膜處理可有效地減少車(chē)?yán)遄釉谫A藏期間的水分散失，大大降低其質(zhì)量損失率。結(jié)果表明GA-SA涂膜處理對(duì)車(chē)?yán)遄泳哂休^好的保鮮效果，能有效保持車(chē)?yán)遄庸麑?shí)的新鮮度，延緩果實(shí)腐敗變質(zhì)和水分散失。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Figure 7 Effect of H2O2and AA addition on GA-SA grafting degree and scavenging DPPH free radical

圖8 不同處理對(duì)車(chē)?yán)遄痈癄€率的影響

圖9 SA和GA-SA(接枝度4.260 mg/g)對(duì)車(chē)?yán)遄淤|(zhì)量

Figure 9 Effect of SA and GA-SA(grafting degree 4.260 mg/g)on the weight loss rate of cherries

3 結(jié)論

本研究采用H2O2-AA自由基引發(fā)接枝的方法，合成GA-SA。自由基引發(fā)劑H2O2和AA最適添加量為5.54 mmol，此時(shí)接枝度為4.260 mg/g。GA-SA的紅外光譜和拉曼光譜中均有酯基特征峰出現(xiàn)，表明GA與SA通過(guò)酯化反應(yīng)接枝；接枝后GA-SA熱穩(wěn)定性、分子結(jié)構(gòu)和分子排列產(chǎn)生變化，其抗氧化活性明顯高于SA。應(yīng)用研究表明，GA-SA對(duì)車(chē)?yán)遄拥耐磕けｕr效果良好。綜上所述，GA-SA有較好的抗氧化、抑菌性，可作為一些食品的涂膜保鮮材料。本試驗(yàn)對(duì)GA-SA的合成、性能及在鮮果保鮮中的應(yīng)用進(jìn)行了研究，其工藝優(yōu)化及對(duì)鮮果品質(zhì)的影響有待進(jìn)一步探索。