常壓室溫等離子體誘變選育高產(chǎn)油脂皮狀絲孢酵母的研究

許鵬飛，郭金玲,2，呂育財,2，涂 璇,2，龔大春,2

(1.三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002； 2.三峽大學(xué)湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443002)

微生物油脂是利用酵母菌、藻類、霉菌等微生物在一定生長條件下，通過代謝在體內(nèi)積累所產(chǎn)生的一種特殊油脂，其主要成分為甘油三酯(TAG)，在組成上與植物油相似，以C16和C18為主[1]。微生物油脂可以作為生物柴油的原料，其產(chǎn)油微生物可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)。但目前微生物油脂的產(chǎn)量不高，高產(chǎn)菌株的選育成為微生物油脂產(chǎn)業(yè)化的瓶頸[2-3]。

常壓室溫等離子體(ARTP)誘變育種技術(shù)是通過氦氣大氣壓射頻輝光放電，產(chǎn)生系列活性氧化物和活性氮化物等離子體，攻擊微生物DNA，引起DNA的磷氧鍵和氮氧鍵斷裂，實(shí)現(xiàn)DNA重組，從而產(chǎn)生突變體的一種新技術(shù)。該技術(shù)操作在常壓室溫下進(jìn)行，具有活性粒子種類多樣、成本低、使用簡便、安全性高、無污染、突變譜廣、突變率高等優(yōu)勢，被廣泛用于酵母、霉菌等微生物的生物育種[4]。

建立高效的高產(chǎn)油脂菌株的篩選方法是ARTP誘變育種研究重點(diǎn)[5-6]。王美珠[7]研究發(fā)現(xiàn)，在酵母脂肪酸合成途徑中，蘋果酸酶是產(chǎn)油代謝途徑中的關(guān)鍵性酶，而芝麻酚是蘋果酸酶的抑制劑，如果將芝麻酚加入培養(yǎng)基中則可以抑制蘋果酸生成丙酮酸和NADPH，從而抑制脂質(zhì)積累[8-9]，由此可用于誘變菌株的初篩。Kimura[10]、林義[11]等報道利用尼羅紅熒光染色測量油脂的方法，具有較高的準(zhǔn)確率，如果采用熒光酶標(biāo)儀可望實(shí)現(xiàn)多孔板的高通量篩選。

因此，本文使用ARTP誘變儀對皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)進(jìn)行處理后，通過添加一定質(zhì)量濃度的芝麻酚抗性標(biāo)記初篩，然后將初篩菌株接種到多孔板培養(yǎng)后進(jìn)行尼羅紅熒光檢測高通量篩選，得到增殖迅速、油脂產(chǎn)量高的優(yōu)勢突變菌株，并對其遺傳穩(wěn)定性和菌株油脂成分開展進(jìn)一步研究，為后續(xù)的發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)，來自三峽大學(xué)艾倫麥克德爾米德研究所；氯仿、甲醇、尼羅紅等均為分析純；十六烷酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，購于TMRM公司。常壓室溫等離子體(ARTP)誘變儀，Tecan Infinite?200 Pro多功能酶標(biāo)儀，福立GC9720氣相色譜儀。

平板培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母浸粉10 g/L，瓊脂粉 20 g/L。

種子液培養(yǎng)基：蔗糖 25 g/L，酵母浸膏 6 g/L，麥芽浸粉 5 g/L，Na2HPO44 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，1×105Pa滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 60 g/L，酵母浸膏 6 g/L，麥芽浸粉 5 g/L，Na2HPO44 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，1×105Pa滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

將保存的原始菌株接種到斜面中，30℃培養(yǎng)3 d。然后將斜面上的菌種取1環(huán)接種到100 mL種子液中，在28℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)18 h。

1.2.2 高產(chǎn)菌株ARTP誘變篩選

將培養(yǎng)好的菌株，先進(jìn)行ARTP誘變條件的優(yōu)化，然后通過芝麻酚抗性標(biāo)記進(jìn)行初篩，挑選優(yōu)勢菌落，接種到多孔板中培養(yǎng)，通過添加尼羅紅熒光試劑，挑選熒光強(qiáng)度大的菌株，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，提取油脂，氣相檢測，得到優(yōu)勢菌株。具體流程如下。

1.2.3 誘變致死率計(jì)算

先將種子液制成OD600值為1.0的菌懸液，將ARTP誘變儀的溫度保持在20℃，調(diào)節(jié)功率為120 W,氦氣流量為10 L/min[11]。吸取10 μL菌懸液點(diǎn)到已用酒精灼燒30 s的金屬載片上，將載片放入到誘變室內(nèi)，發(fā)射體距離菌懸液2 mm，使用不同的時間(0、10、20、30、40、50、60 s)進(jìn)行誘變處理，將誘變的菌體放入1 mL的生理鹽水中振搖1 min，取100 μL涂布到平板培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)2 d，計(jì)算致死率。

1.2.4 芝麻酚質(zhì)量濃度篩選

配制62.5 mg/mL的芝麻酚溶液，分別添加0、40、80、120、160 μL到50 mL的平板培養(yǎng)基中，最終質(zhì)量濃度為0、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL。將OD600值為1.0的菌懸液取100 μL涂布到含芝麻酚的抗性平板上，28℃培養(yǎng)2 d，觀察菌體生長情況。

1.2.5 優(yōu)勢菌株的高通量篩選

先將平板上誘變的菌株用竹簽接種到48孔1 mL 的液體培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min的微孔板恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，每隔24 h，取150 μL菌液到96孔板中用酶標(biāo)儀檢測600nm處的吸光度，測定生物量。

每個孔板添加7.5 μL尼羅紅染液，混合均勻，避光染色5 min，用酶標(biāo)儀以485 nm的發(fā)射波長、595 nm的吸收波長檢測細(xì)胞油脂熒光強(qiáng)度，以沒有添加尼羅紅染液的熒光強(qiáng)度為空白對照，篩選出油脂含量高的誘變菌株。

1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)

將篩選得到的高油脂含量的菌株和低油脂含量的菌株分別接種到種子液中培養(yǎng)18 h，取10%種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中28℃、200 r/min培養(yǎng)，每隔24 h檢測菌株濃度和油脂含量，連續(xù)檢測10 d。

1.2.7 油脂提取

將發(fā)酵培養(yǎng)90 h的菌液8 500 r/min離心10 min，將菌體放到已烘干稱重的試管中，一起放入80℃烘箱中烘干至恒重，計(jì)算菌體得率。每克干菌體加入適量 8 mol/L的鹽酸，混合均勻后室溫靜置1 h，沸水浴處理10 min，迅速冷卻，恢復(fù)到常溫后加入2倍體積的氯仿-甲醇(體積比2∶1)溶液，混勻后室溫靜置30 min，于4 500 r/min離心10 min。萃取得氯仿層，上層溶液再加10 mL氯仿，振蕩均勻，離心，進(jìn)行二次萃取得氯仿層，合并氯仿層。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿得油脂，稱重。

1.2.8 遺傳穩(wěn)定性分析

將誘變菌株在平板培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10次，再進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測菌株的熒光強(qiáng)度變化，研究其遺傳穩(wěn)定性。

1.2.9 油脂脂肪酸組成分析

取1 mL油脂放入15 mL離心管中，加入3 mL正己烷，浸潤提取15 min后，再加入0.4 mol/L的KOH-CH3OH溶液1 mL，振蕩搖勻后放于50℃水浴15 min左右，取出后沿管壁加入5%NaCl溶液，靜置分層后，用注射器取其上層清液，經(jīng)過濾后加入1.5 mL的氣相色譜樣品瓶內(nèi)，進(jìn)行氣相分析。氣相分析條件參考朱啟思等[12]方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 ARTP誘變時間對Trichosporon cutaneum致死率的影響

研究表明，等離子體中的活性粒子作用于微生物，能夠使微生物細(xì)胞壁/膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并引起基因損傷，進(jìn)而使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)顯著變化，最終導(dǎo)致微生物產(chǎn)生突變[13]。誘變時間和強(qiáng)度對微生物致死率的影響較大。致死率過低或過高都不利于篩選。本實(shí)驗(yàn)采用1.2.3的方法，在不同誘變時間下，考察皮狀絲孢酵母的致死率與時間關(guān)系，結(jié)果見圖1。

圖1 皮狀絲孢酵母ARTP致死率曲線

從圖1可以看出，ARTP對Trichosporoncutaneum的殺傷力較強(qiáng)，致死率在10～40 s之間呈現(xiàn)直線增長方式，經(jīng)35 s 誘變后菌體致死率為80%左右， 40 s 的時候致死率就達(dá)到了95%左右，當(dāng)誘變時間達(dá)到60 s的時候，菌體基本上全部不能存活。為了保證一定的正負(fù)突變率，選擇一定的誘變時間至關(guān)重要。因此，選擇致死率達(dá)到95%左右的40 s為最佳誘變時間。

2.2 芝麻酚質(zhì)量濃度對誘變菌株生長的影響

選取不同質(zhì)量濃度芝麻酚，按照1.2.4方法進(jìn)行研究。不同質(zhì)量濃度芝麻酚對Trichosporoncutaneum生長的影響如圖2所示。

圖2 不同質(zhì)量濃度芝麻酚對Trichosporon cutaneum生長的影響

從圖2可以看出，芝麻酚能抑制Trichosporoncutaneum菌株的生長。在低質(zhì)量濃度(0.05 mg/mL)時，抑制作用較小，當(dāng)芝麻酚質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 mg/mL時，菌落數(shù)量明顯減少，生長受到抑制作用，菌落形態(tài)也發(fā)生了一些變化。當(dāng)芝麻酚質(zhì)量濃度達(dá)到0.15 mg/mL時，抑制大大增強(qiáng)，菌落數(shù)量大幅減小。若繼續(xù)加大芝麻酚質(zhì)量濃度，菌株停止生長。為了保證菌株的生長情況較好，又便于篩選，選取0.15 mg/mL的芝麻酚作為篩選培養(yǎng)基中的最佳質(zhì)量濃度，用于芝麻酚抗性標(biāo)記篩選。

2.3 ARTP誘變高通量菌株篩選

綜合考慮ARTP致死率情況和芝麻酚的抑制效果，將OD600值為1.0的種子菌懸液，用ARTP誘變儀以120 W的功率處理40 s，再將誘變的菌株涂布到含有0.15 mg/mL芝麻酚的平板培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)2 d。挑選生長旺盛的40個單菌落菌株用無菌竹簽接種到48孔培養(yǎng)基中，每隔24 h檢測菌株濃度和熒光強(qiáng)度。圖3顯示了原始菌株熒光強(qiáng)度為1.0時，40個誘變菌株培養(yǎng)6 d時的相對熒光強(qiáng)度。

圖3 誘變菌株的相對熒光強(qiáng)度

從圖3可以看出，大多數(shù)誘變菌株的熒光強(qiáng)度低于原始菌株(W)，但有兩株誘變菌株TrichosporoncutaneumA1、E8的熒光強(qiáng)度高于原始菌株20%以上。同時也有熒光強(qiáng)度比原始菌株低很多的，其中菌株C2最低，說明其脂肪酶合成途徑的關(guān)鍵基因受到極大影響，為了驗(yàn)證熒光強(qiáng)度與油脂積累的關(guān)系，以及為了后期探究誘變菌株基因?qū)用嫔系淖兓?，特將正突變誘變菌株TrichosporoncutaneumA1、E8和負(fù)突變誘變菌株TrichosporoncutaneumC2同時進(jìn)行進(jìn)一步復(fù)篩，為后期的進(jìn)一步發(fā)酵和基因水平的比較做準(zhǔn)備。

2.4 誘變菌株的發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩

將誘變菌株TrichosporoncutaneumA1、E8、C2和原始菌株(W)進(jìn)行種子液和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，每天檢測熒光強(qiáng)度，進(jìn)行復(fù)篩, 其10 d的檢測結(jié)果如圖4所示。

圖4 誘變菌株與原始菌株的熒光強(qiáng)度隨時間的變化

從圖4可以看出，初篩得到的優(yōu)勢菌株TrichosporoncutaneumA1、E8在搖瓶發(fā)酵中的熒光強(qiáng)度明顯高于原始菌株，菌株熒光強(qiáng)度增加較快，預(yù)示著誘變菌株的脂質(zhì)積累量較大，在發(fā)酵9 d時的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，為原始菌株的300%左右，負(fù)突變誘變菌株C2的脂質(zhì)積累一直低于原始菌株且積累緩慢。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證誘變菌株的油脂積累情況，將這4個菌株搖瓶培養(yǎng)9 d后，按照1.2.7的方法提取細(xì)胞內(nèi)油脂，分析其生物量、油脂產(chǎn)量和含量變化，結(jié)果如表1所示。

表1 皮狀絲孢酵母誘變菌株的復(fù)篩結(jié)果

由表1可知，經(jīng)誘變篩選的誘變菌株TrichosporoncutaneumA1比TrichosporoncutaneumE8綜合指標(biāo)好，較原始菌株產(chǎn)油脂能力有了很大提高，其生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量分別提高了41.6%、123.1%、57.4%。在搖瓶培養(yǎng)中，TrichosporoncutaneumA1的油脂產(chǎn)量達(dá)到了5.8 g/L，遠(yuǎn)高于原始菌株，而負(fù)突變誘變菌株C2油脂產(chǎn)量下降26.9%。由此可見，本篩選方法用于優(yōu)勢誘變菌株篩選是行之有效的。

2.5 遺傳穩(wěn)定性

為了檢驗(yàn)優(yōu)勢誘變菌株TrichosporoncutaneumA1能否保持穩(wěn)定的遺傳特性，將誘變菌株A1連續(xù)傳代培養(yǎng)10次，并同時進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測菌株的熒光強(qiáng)度, 結(jié)果如圖5所示。

圖5 誘變菌株A1連續(xù)傳代10次的熒光強(qiáng)度

從圖5可以看出，從第1代到第10代誘變菌株A1的熒光強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定，傳代至第10代，誘變菌株A1的熒光強(qiáng)度仍然能達(dá)到第一代的90%，可見誘變菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，能穩(wěn)定生產(chǎn)油脂。

2.6 油脂脂肪酸組成

對誘變菌株TrichosporoncutaneumA1所產(chǎn)油脂用氣相色譜法進(jìn)行脂肪酸組成測定，結(jié)果如表2所示。

表2 原始菌株和誘變菌株A1的脂肪酸組成及含量 %

從表2可以看出，誘變前后菌株中的油脂脂肪酸組成相同。而誘變菌株A1的油脂脂肪酸含量與原始菌株相比，十六烷酸、硬脂酸、亞油酸的相對含量略有提高，而油酸的相對含量下降了3.89個百分點(diǎn)，其變化的原因有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本文建立了芝麻酚初篩和尼羅紅熒光多孔板檢測的高通量篩選策略。經(jīng)過ARTP的40 s誘變后，接種到質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL的芝麻酚培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)2 d，篩選出生長旺盛的菌株，然后接種到48孔液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，并利用96孔板尼羅紅熒光染色對培養(yǎng)菌株進(jìn)行高通量篩選，選育出一株高產(chǎn)油脂菌株TrichosporoncutaneumA1。該菌株較原始菌株的生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量分別提高了41.6%、123.1%、57.4%，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性；通過氣相色譜分析,其油脂脂肪酸組成與原始菌株相同，主要為十六烷酸、硬脂酸、油酸、亞油酸。

本文通過將ARTP隨機(jī)誘變與芝麻酚定向抑制微生物產(chǎn)油代謝途徑中的關(guān)鍵酶相結(jié)合，增大誘變菌株向油脂積累方向突變的機(jī)會，使篩選到優(yōu)良菌株的概率升高，減少篩選的工作量，為油脂酵母的選育提供了高效的篩選方法，可為其他產(chǎn)油脂菌株的篩選提供重要參考。誘變后所產(chǎn)生的正負(fù)突變誘變菌株在基因水平的變化和關(guān)鍵酶的影響有待進(jìn)一步研究。