川明參醇提取物抗氧化性及熱穩(wěn)定性研究

萬(wàn) 重，肖丹桃，王淑君，王越梅，張 清

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

川明參(ChuanminshenViolaceumSheh et Shan)屬傘形科、川明參屬根下植物，因極易與其他品種相混而未在歷代本草中收載，從現(xiàn)今對(duì)川明參的報(bào)道來(lái)看，其開發(fā)利用的程度較低。有研究應(yīng)用乙醇提取川明參根粉中的成分，鑒定出7種化合物，包括香豆素傘形花內(nèi)酯、阿魏酸、胡蘿卜苷、印度枸橘素等[1]。董紅敏等[2]應(yīng)用超聲輔助提取川明參中的揮發(fā)油，并檢測(cè)出76種成分，鑒定并確定其中42種化合物，含量較多的為鐮葉芹醇、亞油酸和歐前胡素等。此外，還應(yīng)用95%乙醇超聲輔助提取其中的抗氧化活性成分，發(fā)現(xiàn)成分中蛋白質(zhì)和多糖含量較多，且具有較強(qiáng)的抗氧化能力[3]。香豆素是川明參的重要成分，有研究顯示超聲輔助醇提法可以提高香豆素的提取率[4]。川明參還包括黃酮、甾醇、有機(jī)酸、酚類、鞣質(zhì)和萜類等化學(xué)成分[5-6]。川明參干燥根中至少含有13種氨基酸，其中含量較高的有天冬氨酸、谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸[7]。有研究認(rèn)為把川明參粉加入到豬油中可以減緩油脂的氧化，提示川明參可以進(jìn)行開發(fā)利用，有潛力作為食品抗氧化劑應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[8]。

油脂在加熱或煎炸過(guò)程中會(huì)發(fā)生氧化、水解及聚合等一系列化學(xué)反應(yīng)，不僅破壞其原有的不飽和脂肪酸及維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，而且還產(chǎn)生醛、酮等有害物質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，添加抗氧化劑及經(jīng)過(guò)一些物理方式的處理可以延長(zhǎng)油脂的使用壽命。抗氧化劑根據(jù)其來(lái)源可分為天然抗氧化劑與合成抗氧化劑。天然抗氧化劑主要為植物中提取出來(lái)的活性物質(zhì)，包括生育酚、鼠尾草酚、類黃酮和芝麻酚等；合成抗氧化劑通常使用的為丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、沒(méi)食子酸丙酯(PG)和叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)等[9]。雖然天然抗氧化劑具有高效和低毒等優(yōu)勢(shì)，但大多數(shù)的天然抗氧化劑的熱穩(wěn)定性較差，容易在加熱反應(yīng)中揮發(fā)出去。合成抗氧化劑均能表現(xiàn)出較好的抗氧化性，但對(duì)人體健康的潛在威脅使其有限量要求[10]。因此，需從天然材料中尋找有效的抗氧化劑并能應(yīng)用于油脂的抗氧化。本實(shí)驗(yàn)以川明參為原料，采用超聲輔助乙醇提取技術(shù)提取川明參粉中的抗氧化活性物質(zhì)，并將川明參醇提取物添加到大豆油中，探究其對(duì)油脂加熱氧化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

無(wú)添加抗氧化劑的大豆油，購(gòu)于九三集團(tuán)營(yíng)銷有限公司；川明參采自四川省金堂縣，采摘時(shí)間為2018年3月下旬，新鮮川明參采摘后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，洗凈放入-20℃冰箱，取出晾干后，用粉碎機(jī)粉碎成100～200目粉末。

乙醚、無(wú)水乙醇、2,4-二硝基苯肼、苯、三氯乙酸、甲苯、甲醇鈉、氫氧化鉀、三氯化鐵、抗壞血酸(VC)和TBHQ均為分析純，正己烷、甲醇為色譜純，購(gòu)于雅安萬(wàn)科試劑公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和37種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品(CRM47885)，購(gòu)于Sigma試劑公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

艾拓金牌節(jié)能型電炸爐，BS 214D電子天平，UV-6100紫外分光光度計(jì)，7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，電子溫度計(jì)(德國(guó)易克賽思國(guó)際有限公司)，DK-9811恒溫水浴鍋，AUW22D十萬(wàn)分之一天平(日本島津儀器公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 川明參醇提取物的提取

川明參醇提取物的提取參照董紅敏[11]的醇提取方法，略有改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取50 g川明參干燥粉，加入500 mL 80%乙醇溶液，在49℃下超聲(225 W)輔助提取38 min。過(guò)濾提取液在45℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)呈濃縮物，再經(jīng)100 mL無(wú)水乙醇分3次洗滌，濾去不溶解的多糖成分。濾液在45℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直到乙醇蒸發(fā)干，得到川明參醇提取物，將其收集后保存在4℃條件下，備用。

1.2.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

以無(wú)水乙醇為溶劑，分別配制濃度為2×10-4mol/L的DPPH溶液，質(zhì)量濃度分別為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/mL的川明參醇提取物溶液和質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL VC溶液。精確吸取4 mL不同質(zhì)量濃度的川明參醇提取物溶液和VC溶液，加入4 mL DPPH溶液，搖勻后在暗室下放置30 min，以無(wú)水乙醇為對(duì)照，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上述溶液的吸光度[12]。按照下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A為樣品與DPPH混合溶液的吸光度；A0為樣品與無(wú)水乙醇混合溶液的吸光度；A1為無(wú)水乙醇與DPPH混合溶液的吸光度。

1.2.3 ABTS+自由基清除率的測(cè)定

將ABTS及過(guò)硫酸鉀用少量水溶解，再用無(wú)水乙醇配制濃度為7×10-3mol/L的ABTS溶液和濃度為2.5×10-3mol/L的過(guò)硫酸鉀溶液，并將二者等體積混合，在暗處放置12 h后待用。配制質(zhì)量濃度分別為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/mL的川明參醇提取物溶液和質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL VC溶液。精確吸取1 mL不同質(zhì)量濃度川明參醇提取物溶液和VC溶液，加入5 mL ABTS和過(guò)硫酸鉀的混合溶液，搖勻后在室溫條件下避光反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇為對(duì)照，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上述溶液的吸光度[13]。按照下式計(jì)算ABTS+自由基清除率。

式中：A為樣品與ABTS和過(guò)硫酸鉀混合溶液的吸光度；A0為樣品與無(wú)水乙醇混合溶液的吸光度；A1為無(wú)水乙醇與ABTS和過(guò)硫酸鉀混合溶液的吸光度。

1.2.4 川明參醇提取物對(duì)鐵還原能力的測(cè)定

用無(wú)水乙醇配制質(zhì)量濃度分別為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/mL的川明參醇提取物溶液和質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 的VC溶液，分別取1 mL上述溶液于試管中，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液2.5 mL、1 g/100 mL鐵氰化鉀2.5 mL，混勻并在50℃水浴保溫20 min，再加入10 g/100 mL三氯乙酸2.5 mL，3 000 r/min離心10 min后取上清液2.5 mL于試管中，再加入去離子水2.5 mL和0.1 g/100 mL三氯化鐵0.5 mL，常溫反應(yīng)5 min后在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[14]。

1.2.5 加熱氧化實(shí)驗(yàn)

將0%、0.05%、0.1%、0.3%和0.5%的川明參醇提取物及0.02%的TBHQ分別添加到500 mL大豆油中，在室溫下混勻并室溫放置24 h。將上述各大豆油樣品分別裝入試管中，進(jìn)行180℃油浴加熱實(shí)驗(yàn)。分別在0、3、6、9、12、15、18 h和21 h取樣，待冷卻后，放入-4℃冰箱中待測(cè)。

1.2.6 酸價(jià)、羰基價(jià)與脂肪酸組成的測(cè)定

酸價(jià)的測(cè)定參照GB 5009.229—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》，羰基價(jià)的測(cè)定參照GB 5009.230—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中羰基價(jià)的測(cè)定》。

油樣甲酯化采用堿化催化法[15]。稱取油樣25～30 mg于20 mL具塞試管中，加入1 mL無(wú)水甲苯，再加入1 mL濃度為0.5 mol/L的甲醇鈉-甲醇溶液，50℃恒溫處理10 min。冷卻后依次添加0.1 mL冰醋酸和1 mL去離子水，搖勻，然后用5 mL正己烷洗滌，取上層清液有機(jī)相1 mL用正己烷稀釋5倍，最后用無(wú)水硫酸鈉脫水、0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾，放入-4℃冰箱保存待測(cè)。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行脂肪酸組成分析。

氣相色譜條件：HP-88毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.2 μm)；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度250℃；氦氣流速1 mL/min；柱溫箱初始溫度120℃保持1 min，以5℃/min升到175℃保持10 min，以5℃/min升到190℃保持5 min，以5℃/min升到200℃保持5 min。

質(zhì)譜條件：離子源和四極桿溫度分別為230℃和150℃；質(zhì)譜掃描范圍(m/z)為40～400；采用全掃描模式。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，顯著性差異采用Duncan以及ANOVA檢驗(yàn)，應(yīng)用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 川明參醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力(見圖1)

由圖1A可知，在質(zhì)量濃度(5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/mL)范圍內(nèi)，川明參醇提取物對(duì)DPPH 自由基具有明顯的清除能力，且清除能力隨其質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。川明參醇提取物在質(zhì)量濃度為5～25 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率為39.39%～95.52%。由圖1B可知，VC質(zhì)量濃度為0.02～0.05 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基清除能力變化不顯著。將川明參醇提取物對(duì)DPPH自由基清除能力與VC進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為25 mg/mL 的川明參醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力高于質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的VC?？赏茢啻鲄⒋继崛∥镏泻锌寡趸钚晕镔|(zhì)，對(duì)DPPH自由基具有顯著的清除能力，且在質(zhì)量濃度為5～20 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基清除能力增加趨勢(shì)較快，質(zhì)量濃度為20～25 mg/mL時(shí)的增加趨勢(shì)變緩。

圖1 川明參醇提取物、VC對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.2 川明參醇提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力(見圖2)

圖2 川明參醇提取物、VC對(duì)ABTS+自由基的清除能力

由圖2A可以看出，在質(zhì)量濃度(5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/mL)范圍內(nèi)，川明參醇提取物對(duì)ABTS+自由基具有明顯的清除能力，其清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)川明參醇提取物質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+自由基的清除能力為74.41%。由圖2B可知，VC質(zhì)量濃度為0.02～0.05 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+自由基的清除能力均大于89%，且增加趨勢(shì)不明顯。將VC與川明參醇提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力相比，川明參醇提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力相對(duì)較弱。但隨著川明參醇提取物質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)ABTS+自由基的清除能力也會(huì)逐漸升高?？赏茢啻鲄⒋继崛∥飳?duì)ABTS+自由基的清除能力與其質(zhì)量濃度相關(guān)，質(zhì)量濃度越大，對(duì)ABTS+自由基的清除能力越強(qiáng)。

2.3 川明參醇提取物的鐵還原能力(見圖3)

圖3 川明參醇提取物、VC的鐵還原能力

由圖3可以看出，川明參醇提取物和VC在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)都具有較強(qiáng)的鐵還原能力，且隨著質(zhì)量濃度的增加，鐵還原能力增強(qiáng)。VC質(zhì)量濃度為0.01～0.05 mg/mL時(shí)，吸光度為0.10～0.30，川明參醇提取物質(zhì)量濃度為5～25 mg/mL時(shí)，吸光度為0.14～0.26。川明參醇提取物對(duì)鐵離子的還原能力隨著質(zhì)量濃度的增加趨勢(shì)相比VC緩慢。

2.4 川明參醇提取物的熱抗氧化能力

通過(guò)添加不同量的川明參醇提取物(CE)在大豆油中，以添加0.02%TBHQ和無(wú)添加抗氧化劑的大豆油(Blank)為對(duì)照，分析不同加熱時(shí)間每種油樣的酸價(jià)、羰基價(jià)，結(jié)果如圖4～圖5所示。

圖4 不同條件下大豆油在加熱過(guò)程中酸價(jià)的變化

由圖4可知，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，每種大豆油的酸價(jià)逐漸增大，但增加的趨勢(shì)有明顯差異。其中無(wú)添加抗氧化劑的大豆油酸價(jià)的增加趨勢(shì)最快，在21 h內(nèi)酸價(jià)(KOH)的變化范圍為0.24～0.37 mg/g；添加0.02%TBHQ的大豆油酸價(jià)增加趨勢(shì)最緩慢，在21 h內(nèi)酸價(jià)(KOH)的變化范圍為0.24～0.33 mg/g。在21 h時(shí)添加川明參醇提取物的大豆油中，添加0.3%川明參醇提取物的大豆油酸價(jià)(KOH)最低，為0.34 mg/g。TBHQ和川明參醇提取物在大豆油加熱過(guò)程中，對(duì)抑制大豆油酸價(jià)的增加都有明顯的效果，然而在不同添加量的川明參醇提取物作用下，大豆油酸價(jià)表現(xiàn)出不同的增加趨勢(shì)。

由圖5可知，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，每種大豆油的羰基價(jià)逐漸增大，但增加的趨勢(shì)有顯著差異。其中無(wú)添加抗氧化劑的大豆油羰基價(jià)增長(zhǎng)趨勢(shì)最快，在21 h的羰基價(jià)達(dá)到52.78 meq/kg；同時(shí)間下添加0.02%TBHQ的大豆油羰基價(jià)為46.48 meq/kg，添加0.1%、0.3%和0.5%的川明參醇提取物的大豆油羰基價(jià)均小于TBHQ的?？梢?，添加川明參醇提取物對(duì)大豆油羰基價(jià)的增加具有明顯的延緩效果。

圖5 不同條件下大豆油在加熱過(guò)程中羰基價(jià)的變化

在180℃條件下加熱21 h，無(wú)添加抗氧化劑、添加0.02% TBHQ和不同添加量的川明參醇提取物的大豆油脂肪酸組成變化情況如表1所示。

表1 不同條件下大豆油在加熱過(guò)程中主要脂肪酸組成的變化情況

續(xù)表1

脂肪酸加熱時(shí)間/h含量/%Blank0.02%TBHQ0.05%CE0.1%CE0.3%CE0.5%CEC18∶3005.43±0.01d05.44±0.02d05.42±0.03e05.44±0.04h05.44±0.04d05.45±0.04de305.13±0.04cd05.45±0.11d05.34±0.03de05.38±0.01g05.39±0.07d05.51±0.01e604.92±0.07cd05.26±0.01c05.25±0.06d05.21±0.03f05.35±0.01cd05.45±0.04de904.75±0.31bc05.17±0.05c05.11±0.07c05.15±0.05e05.31±0.01bc05.32±0.07cd1204.59±0.35ab05.04±0.02b04.94±0.04b04.94±0.02c05.24±0.02ab05.29±0.07bc1504.62±0.28bc04.99±0.01b04.95±0.05b04.97±0.06d05.16±0.05a05.20±0.07bc1804.39±0.25ab04.93±0.07ab04.79±0.01a04.80±0.05b05.03±0.07ab05.18±0.07b2104.15±0.02a04.86±0.01a04.31±0.01a04.72±0.06a04.76±0.07a04.85±0.05a 注:同列不同小寫字母表示差異顯著,顯著水平α=0.05。

由表1可知，大豆油中不飽和脂肪酸(除C18∶1)含量隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，飽和脂肪酸含量增加。C16∶0增加量最小的為添加0.1%川明參醇提取物的大豆油(增加量0.81個(gè)百分點(diǎn))，其次為添加0.3%川明參醇提取物的大豆油(增加量0.82個(gè)百分點(diǎn))。C18∶2和C18∶3在加熱過(guò)程中，隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。添加0.02%TBHQ的大豆油C18∶2減少量最小，為1.31個(gè)百分點(diǎn)，減少量最大的為添加0.05%川明參醇提取物的大豆油，為2.38個(gè)百分點(diǎn)。對(duì)大豆油C18∶2的減少量延緩效果順序?yàn)?.02%TBHQ>0.5%川明參醇提取物>0.1%川明參醇提取物>0.3%川明參醇提取物> 無(wú)添加>0.05%川明參醇提取物。C18∶3減少量最小的為添加0.02%TBHQ的大豆油，為0.57個(gè)百分點(diǎn)，其次為添加0.5%川明參醇提取物的大豆油，為0.61個(gè)百分點(diǎn)。對(duì)大豆油C18∶3的減少量延緩效果順序?yàn)?.02%TBHQ>0.5%川明參醇提取物>0.3%川明參醇提取物>0.1%川明參醇提取物>0.05%川明參醇提取物>無(wú)添加。

由此可見，在大豆油加熱過(guò)程中，添加川明參醇提取物，對(duì)大豆油飽和脂肪酸的增加及多不飽和脂肪酸的減少，均有一定的抑制作用，且不同添加量的川明參醇提取物對(duì)各種脂肪酸的組成變化有明顯差異。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用體外抗氧化能力測(cè)試和大豆油加熱氧化測(cè)試，對(duì)川明參醇提取物的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。由抗氧化指標(biāo)分析顯示，川明參醇提取物中含有抗氧化活性物質(zhì)，對(duì)DPPH、ABTS+自由基清除能力和鐵還原能力都具有明顯效果，且隨質(zhì)量濃度的增加，其抗氧化能力逐漸增強(qiáng)。川明參醇提取物對(duì)大豆油的熱氧化具有明顯的抑制效果，其抑制酸價(jià)增加效果最好的是0.3%川明參醇提取物；抑制羰基價(jià)增加效果最好的是0.5%川明參醇提取物。對(duì)于C16∶0、C18∶0的增加量，不同添加量的川明參醇提取物均表現(xiàn)出明顯的抑制效果。對(duì)于C18∶2和C18∶3的減少量，添加0.5%的川明參醇提取物對(duì)延緩其減少的效果略低于TBHQ。因此，川明參醇提取物在油脂高溫加熱過(guò)程中可以有效延緩油脂的氧化速率，有潛力應(yīng)用于食用油的貯藏或高溫加熱，從而延長(zhǎng)油脂的使用壽命。