火麻葉中大麻二酚的熱回流法提取工藝研究

高 哲，張志軍，李曉君，李會珍

(中北大學 化學工程與技術學院，太原 030051)

火麻(CannabissativaL.)最早源于中亞，又名大麻、漢麻、線麻，是一年生草本植物，其莖皮纖維長而堅韌，可用作織麻布、制繩索和造紙等；其種子含油量達30%，油中富含多不飽和脂肪酸，其中α-亞麻酸、γ-亞麻酸、亞油酸總含量達76%～82%，高于其他常見油脂，具有極高的營養(yǎng)價值。火麻作為纖維、食物的來源已經(jīng)有3 000多年的歷史[1]?；鹇槿~中有多種大麻素類化合物，主要是大麻二酚及其羧基化合物。大麻二酚是非成癮性成分，具有阻斷某些多酚對人體神經(jīng)系統(tǒng)的不利影響，并且具有治療糖尿病、阻斷乳腺癌轉移、抗痙攣、抗類風濕關節(jié)炎、抗失眠等一系列生理活性功能[2-5]。近年來，科學家們也將大麻二酚應用于臨床試驗從而更好地研究其抑菌、抗炎、抗癌等活性，為人類健康發(fā)展提供有效保障[7-13]。因此，大麻二酚的提取制備得到廣泛重視。

目前大麻二酚提取工藝主要為酶輔助溶劑法[1]、超聲輔助溶劑法[2，12]及超臨界CO2萃取法[13]。本試驗選用既適合實驗室又廣泛應用于規(guī)?；I(yè)生產中的熱回流法[14]，先確定最優(yōu)提取溶劑再通過單因素試驗和正交試驗確定火麻葉中大麻二酚提取的最佳工藝條件，同時建立氣相色譜-質譜法(GC-MS)對浸膏中的大麻二酚進行定量分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

火麻葉：榆社縣田禾綠色食品有限公司；大麻二酚標準品：國家食品藥品檢定所；正己烷、石油醚、無水乙醇(分析純)；甲醇(色譜級)。

1.1.2 儀器與設備

FA1204B分析天平：上海精科天美科學儀器有限公司；JM-B-2002電子天平：余姚市紀銘稱重設備有限公司；BJ-400型高速多功能粉碎機：北京普朗新技術科學儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵：上海知信實驗儀器技術有限公司；GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SB-5200超聲波清洗機：寧波新芝生物科技有限公司；TRACE1300/ISQ氣質聯(lián)用儀：Thermo Fisher。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

色譜條件：色譜柱為Agilent HP-5毛細管柱(30 m×0.2 mm×0.11 μm)；載氣為氦氣，流速1.5 mL/min；柱溫程序為起始溫度120℃，保持1 min，以4℃/min升溫至160℃，以13℃/min升溫至275℃，保持3 min；進樣口溫度230℃；檢測器接口溫度280℃；分流比5∶1；進樣量1 μL。

質譜條件：電子轟擊(EI)離子源，離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；質譜TIC模式；掃描范圍(m/z)200～500；溶劑延遲時間3 min。

稱取0.010 0 g大麻二酚標準品，以甲醇定容制成母液(1 mg/mL)，分別取50、100、150、200、250、300 μL，均放置于10 mL容量瓶中，配制成質量濃度為5、10、15、20、25、30 μg/mL的標準品溶液。按上述氣相色譜-質譜條件進行檢測，以大麻二酚質量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2 火麻葉前處理

火麻葉經(jīng)篩選后60℃烘干至恒重，然后置于高速多功能粉碎機中粉碎，分別過60、40、20目篩制備得到60、40、20目火麻葉粉及20目篩上物，密封保存于冰箱冷藏備用。

1.2.3 大麻二酚的提取和測定

分別稱取不同粒徑火麻葉粉，按一定料液比加入提取溶劑，在設定的溫度、時間下熱回流提取，冷卻抽濾，將濾液在40℃下旋蒸濃縮制得浸膏。浸膏得率按下式計算：

Y=G1/G2×100%

式中：Y為浸膏得率，%；G1為浸膏的質量，g；G2為樣品質量，g。

分別準確稱取0.01 g浸膏，向其中加入10 mL甲醇，置于40 kHz超聲波清洗機中，條件設置為功率200 W、溫度20℃、時間3 min，之后過0.45 μm有機膜，所得濾液通過氣相色譜-質譜檢測并按照標準曲線計算浸膏中大麻二酚的含量。

同時在選擇提取溶劑的基礎上，以浸膏得率及浸膏中大麻二酚含量為指標，采用單因素試驗對過篩粒徑、料液比、提取溫度和提取時間4個因素進行考察，并采用正交試驗進行工藝優(yōu)化。

1.2.4 統(tǒng)計分析

所有提取試驗均重復3次，每次浸膏得率及大麻二酚含量的測定均重復3次，結果用“平均值±標準偏差”表示。應用SPSS軟件對所有數(shù)據(jù)進行方差分析并作圖，利用置信度為95%的最小顯著性差異(P<0.05)比較平均值。

2 結果與討論

2.1 大麻二酚標準曲線

以大麻二酚質量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線。得到大麻二酚標準曲線回歸方程為Y=4.909×106X+3.119×106，相關系數(shù)為R2=0.993 1，在5～30 μg/mL之間線性關系良好。

2.2 提取溶劑的選擇

準確稱取粒徑為20目的火麻葉粉，每份40 g，分別以正己烷、石油醚、無水乙醇作為提取溶劑，在料液比1∶15、提取時間3 h、提取溫度80℃下進行提取，考察提取溶劑對浸膏得率及大麻二酚含量的影響，結果見圖1。

圖1 提取溶劑對浸膏得率及大麻二酚含量的影響

由圖1可知，無水乙醇提取的浸膏得率最高，但其大麻二酚含量僅有19.70 mg/g，可能是無水乙醇極性偏大，導致醇溶性雜質、色素溶出[15]，正己烷和石油醚提取的浸膏得率差異不顯著，但正己烷提取的大麻二酚含量明顯高于石油醚。方差分析結果顯示3種提取溶劑對浸膏中的大麻二酚含量影響達到顯著水平(P<0.05)，因此選擇正己烷為提取溶劑。

2.3 單因素試驗

2.3.1 過篩粒徑對大麻二酚提取的影響

準確稱取一定量火麻葉粉，以正己烷為提取溶劑、料液比1∶10為提取溶劑量，在80℃下熱回流提取3 h，考察過篩粒徑對浸膏得率及大麻二酚含量的影響，結果見圖2。

圖2 過篩粒徑對浸膏得率及大麻二酚含量的影響

由圖2可知，20目篩上物的浸膏得率及大麻二酚含量均最低，分別為3.15%、15.04 mg/g，與另外3種不同粒徑火麻葉粉相比差異顯著(P<0.05)，這是由于物料與溶劑未能充分接觸從而阻礙了有效成分的溶出。20、40目和60目相比對浸膏得率及大麻二酚含量的影響差異不顯著，但考慮到粒徑較大時選用普通的雙聯(lián)過濾器即可實現(xiàn)后續(xù)工藝的固液分離，具有成本低、能耗低等優(yōu)點；粒徑過小時通常需選擇板框壓濾機、臥螺離心機等能耗高的儀器實現(xiàn)固液分離，因此將火麻葉粉粒徑控制在20目即可。

2.3.2 料液比對大麻二酚提取的影響

準確稱取粒徑為20目的火麻葉粉，以正己烷為提取溶劑，在80℃下熱回流提取3 h，考察料液比對浸膏得率及大麻二酚含量的影響，結果見圖3。

圖3 料液比對浸膏得率及大麻二酚含量的影響

由圖3可知，采用正己烷以料液比1∶10、1∶15、1∶20 提取時浸膏得率及大麻二酚含量沒有顯著差異，但顯著高于料液比1∶5時的浸膏得率及大麻二酚含量(P<0.05)。研究表明料液之間的濃度梯度是提取物發(fā)生轉移的動力，通過提高料液比，可以增加濃度梯度，有利于提取物的溶出。但當料液比達到某一值時，再提高料液比效果不大[16]，之后有減小的趨勢，這可能是由于大麻二酚易氧化轉變成另一種物質[17]。考慮到溶劑損耗、濃縮時間、工藝成本等問題，料液比確定為1∶10。

2.3.3 提取溫度對大麻二酚提取的影響

準確稱取粒徑為20目的火麻葉粉，以正己烷為提取溶劑、料液比1∶10為提取溶劑量，在一定提取溫度下熱回流提取3 h，考察提取溫度對浸膏得率及大麻二酚含量的影響，結果見圖4。

圖4 提取溫度對浸膏得率及大麻二酚含量的影響

由圖4可知，提取溫度從60℃升至85℃，浸膏得率僅增加了0.89個百分點，但大麻二酚含量相應地從27.85 mg/g提高到34.39 mg/g，提取溫度為80、85℃時大麻二酚含量穩(wěn)定在34.39 mg/g左右。有報道指出，溫度是提取過程中重要的影響因素，升高提取溫度能夠增加溶質的溶解度與溶解系數(shù)，有利于提取，但是超過一定的溫度后，酚類物質就會發(fā)生降解[18]。故選擇80℃作為提取溫度。

2.3.4 提取時間對大麻二酚提取的影響

準確稱取粒徑為20目的火麻葉粉，以正己烷為提取溶劑、料液比1∶10為提取溶劑量，在80℃下熱回流提取一段時間，考察提取時間對浸膏得率及大麻二酚含量的影響，結果見圖5。

圖5 提取時間對浸膏得率及大麻二酚含量的影響

由圖5可知，在3 h內，提取時間對浸膏得率及大麻二酚含量影響顯著(P<0.05)，隨著提取時間的延長，大麻二酚含量先呈上升的趨勢，提取時間為3 h時含量最高，顯著高于1、2 h(P<0.05)，分別比提取1、2 h時高出了83.89%和22.45%。3.5 h時大麻二酚含量略微下降0.26 mg/g，可能是由于大麻二酚本身具有還原性，含有的兩個酚羥基可以作為H供體，易被空氣中的氧氣所氧化。所以提取時間控制在3 h為宜。

2.4 正交試驗優(yōu)化

在單因素試驗基礎上，以浸膏得率及大麻二酚含量為指標，選用L9(34)正交試驗設計對火麻葉中大麻二酚提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，正交試驗設計與結果如表1所示。

表1 火麻葉中大麻二酚提取正交試驗設計及結果

由表1可知，4個因素對浸膏得率的影響程度由高到低依次為料液比>提取時間>過篩粒徑>提取溫度，4個因素對大麻二酚含量的影響程度由高到低依次為料液比>提取時間>提取溫度>過篩粒徑，提取最佳條件組合為A2B3C2D2，即過篩粒徑20目、料液比1∶15、提取溫度80℃、提取時間3 h。

利用SPSS軟件對試驗結果進行方差分析，結果見表2、表3。

表2 浸膏得率方差分析

由表2、表3可知：料液比對浸膏得率及大麻二酚含量的影響均達到極顯著水平(P<0.01)；提取時間對浸膏得率的影響達到極顯著水平(P<0.01)，對浸膏中大麻二酚含量的影響達到顯著水平(P<0.05)；提取溫度對浸膏得率及大麻二酚含量的影響均達到顯著水平(P<0.05)；過篩粒徑對浸膏得率的影響達到顯著水平(P<0.05)，而對大麻二酚含量的影響不顯著。

表3 大麻二酚含量方差分析

對最佳試驗條件進行3次驗證試驗，測得浸膏得率為5.24%，大麻二酚含量為46.16 mg/g。試驗提取的大麻二酚含量低，仍含有較多雜質，可以通過層析法、重結晶法等方法對其進行純化，以提高大麻二酚純度。

3 結 論

以火麻葉為原料，探討了提取溶劑、過篩粒徑、料液比、提取溫度及提取時間對大麻二酚提取的影響，確定了最佳的工藝條件：正己烷作為提取溶劑，火麻葉粉碎過20目篩后按料液比1∶15熱回流提取3 h，提取溫度控制在80℃。在最佳工藝條件下，浸膏得率為5.24%，浸膏中大麻二酚含量為46.16 mg/g。