一例豬圓環(huán)病毒感染的PCR診斷及病案分析

潘淑惠，王 璇，吳玙彤，文正常＊

（貴州省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005）

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，簡稱PCV)感染發(fā)病最早發(fā)現(xiàn)于加拿大(1991)，很快在歐美及亞洲一些國家包括我國發(fā)生和流行。現(xiàn)已知PCV有2個血清型，即PCV1和PCV2，其中PCV2為致病性病毒，它是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,簡稱PMWS)的主要病原。除PMWS外，豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、增生性壞死性肺炎(PNP)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病，亦與PCV2感染有重要關(guān)聯(lián)?，F(xiàn)已被世界各國公認為是繼豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)之后新發(fā)現(xiàn)的一種豬免疫障礙重要傳染病。2018年7月，貴州地區(qū)某縣一地方黑毛豬養(yǎng)殖場，發(fā)生了一起商品豬以重度局灶性皮炎、皮下淺表淋巴結(jié)腫大為典型臨床病理特征的傳染性疾病，采集病料經(jīng)實驗室PCR特異性鑒別診斷，結(jié)果為豬圓環(huán)病毒感染陽性。在貴州地區(qū)以PDNS為特征的臨床案例較為少見，現(xiàn)將相關(guān)診斷及發(fā)生情況給與報道，供廣大同業(yè)者參考，希望對豬場的疫病防控有所幫助。

1 發(fā)病情況調(diào)查

2018年7月，接貴州地區(qū)某縣動物疫病預(yù)防控制中心反映，該縣一黑毛豬養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的豬經(jīng)屠宰后發(fā)現(xiàn)身上長有許多腫大的淋巴結(jié)，多的甚至達到5 kg。初始認為是某寄生蟲病引起的皮膚病，但對病豬用驅(qū)蟲藥進行治療觀察10 d以上未見效果，其發(fā)病越顯嚴重，請求送檢實驗室以得到確診。

經(jīng)現(xiàn)場實地檢查，該豬場存欄有190余頭雜交黑毛豬，豬群引進時就發(fā)現(xiàn)部分豬就有少許皮膚皰疹，在飼養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)同舍的其他豬也逐步發(fā)病，皮膚皰疹發(fā)生面積逐步擴大，持續(xù)時間有10余個月，中間未發(fā)生過其他的疫（疾）病情況。

發(fā)病豬只均為育成肥豬，排查有臨床癥狀的患豬有30余頭，臨床發(fā)病率為15.79%?；钾i精神狀況良好，飲食、糞便正常，全身皮膚均患有不同程度的局灶性皮炎，主要分布在頸部、前胛、下腹、四肢、臀部等皮膚上（如圖1、圖2、圖3所示部位）。用手觸摸患部皮下淺表處，有乒乓球到網(wǎng)球大小的硬性炎性結(jié)節(jié)，邊緣清晰，觸壓痛性不明顯。將病豬屠宰后檢查發(fā)現(xiàn)，肌肉與皮膚邊緣處見淋巴結(jié)腫大，呈大小不等的圓形包塊，病變組織切面呈邊緣規(guī)則的圓形或橢圓形壞死灶，內(nèi)有大量的乳白色干酪樣炎性分泌沉積物（如圖4所示部位），其他臟器及組織未見異常。

2 PCR檢測

2.1 試驗材料及方法

2.1.1 試驗材料

檢測樣品為從發(fā)病豬場采集的豬淋巴結(jié)、肺病料組織；DL2000、2×Taq PCR MasterMix（0.05 U Polymerase/μL）、TIANGEN血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；苯酚、氯仿、無水乙醇等均為國產(chǎn)試劑。

2.2.2 總DNA提取

分別取淋巴結(jié)、肺病組織樣品加入適量的PBS溶液研磨成漿，取上清，參照TIANGEN血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書進行，提取的DNA于-20 ℃保存。

圖1 前后肢皮膚炎性結(jié)節(jié)

圖2 后肢體前側(cè)膚炎性結(jié)節(jié)

圖3 臀部皮膚炎性結(jié)節(jié)

圖4 皮下肌肉淋巴結(jié)壞死灶

2.2.3 引物設(shè)計

豬圓環(huán)病毒基因特異性引物：根據(jù)GenBank中登錄的PCV2全基因序列(KX898030) 高度保守區(qū)域，利用Primer 6.0 軟件設(shè)計特異性引物 A1/A2 (5′-TTCCATG GAGGTCTGTAG G-3′/5′-GAATGGATTGCCACTCG G-3′)， 預(yù) 期 擴 增 片 目 的 片 段 為353 bp。引物由上海寶生物公司合成。

豬偽結(jié)核棒狀桿菌基因特異性引物：參照?etinkaya等設(shè)計的偽結(jié)核棒狀桿菌16S rRNA引物(P1：5′-ACCGCACTTTAGTGTGTGT G-3′；5′ -P2：TCTCTAC GCCG ATCTTGTAT-3′)進行PCR擴增，預(yù)期擴增片目的片段為778 bp。引物由上海寶生物公司合成。

2.2.4 反應(yīng)體系

豬圓環(huán)病毒反應(yīng)體系為：以DNA為模板，PCR反應(yīng)液16 μL，TaqDNA聚 合 酶 2 μL， 模 板DNA 2 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ ，3 min ；94 ℃ ，30 s，62 ℃，30 s，72 ℃， 45 s，共 35次；72 ℃延伸10 min。

豬偽結(jié)核棒狀桿菌反應(yīng)體系為：以DNA為模板，PCR反應(yīng)體系為25 μL：Taq DNA 聚合酶0.5 μL，DNA 模板 2 μL，引物 P1、P2各1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，無菌水 17 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。

3 檢測診斷結(jié)果

從圖5結(jié)果顯示，送檢樣品中均檢出圓環(huán)病毒特異性片段；從圖6結(jié)果顯示，待檢病理組織樣品均未檢出偽結(jié)核棒狀桿菌特異性片段。采集的發(fā)病豬病料組織樣品PCR病原核酸檢測結(jié)果為圓環(huán)病毒病原核酸檢測為感染陽性，目的片段 353 bp；偽結(jié)核棒狀桿菌病原核酸檢測為陰性。本次發(fā)生的疫病確診為豬圓環(huán)病毒感染。

4 結(jié)論與分析

在貴州地區(qū)，以黑毛豬為代表的地方品種豬群發(fā)生皮膚型為主的圓環(huán)病毒病感染在生產(chǎn)上實則較為少見。該病案呈現(xiàn)的豬皮下淺表淋巴結(jié)腫大、化膿性炎癥病變、發(fā)病情況以及其他臨床表征，均與豬偽結(jié)核棒狀桿菌感染極其相似，在臨床上難以區(qū)別，故PCR病原核酸檢測時與豬偽結(jié)核棒狀桿菌感染進行了鑒別診斷。因此，一旦豬群發(fā)生類似的疾病，建議應(yīng)盡早送實驗室進行檢測診斷，不要耽誤疫病最佳的治療時間，為疫病的早期防控提供參考依據(jù)。

在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中，豬圓環(huán)病毒病感染為一種重要的豬免疫抑制性疫病，其高度的免疫抑制危害將對其他疫病的免疫防控帶來重要影響。因此，在對地方豬品種資源的收集、保護、開發(fā)與利用中，建議加大對豬圓環(huán)病毒病的檢測與凈化工作，避免該病在地方豬品種間的感染與傳播。

圖5 豬圓環(huán)病毒擴增圖

圖6 豬偽結(jié)核棒狀桿菌擴增圖